Summary
Een stapsgewijze procedure wordt beschreven voor het label vrij immobilisatie van exosomen en extracellulaire blaasjes uit vloeibare monsters en hun beeldvorming door Atoom kracht microscopie (AFM). De AFM-beelden worden gebruikt om de grootte van de blaasjes in de oplossing te schatten en andere biofysische eigenschappen te karakteriseren.
Abstract
Exosomen en andere extracellulaire blaasjes (Ev's) zijn moleculaire complexen bestaande uit een vesikel van het lipide membraan, de oppervlakte-inrichting door membraan eiwitten en andere moleculen, en diverse Luminale inhoud geërfd van een bovenliggende cel, waaronder Rna's, eiwitten en Dna's. De karakterisering van de hydrodynamische maten van EVs, die afhangt van de grootte van het vesikel en de coronale laag gevormd door oppervlakte decoraties, is routine geworden. Voor exosomen, de kleinste van EVS, is het relatieve verschil tussen de hydrodynamische en blaasjes maten significant. De karakterisering van blaasjes-maten door de cryogene transmissie elektronenmicroscopie (cryo-TEM) beeldvorming, een gouden standaardtechniek, blijft een uitdaging als gevolg van de kosten van het instrument, de expertise die nodig is om de monstervoorbereiding, beeldvorming en gegevensanalyse en een klein aantal deeltjes die vaak in beelden worden waargenomen. Een algemeen beschikbaar en toegankelijk alternatief is de atomaire kracht microscopie (AFM), die veelzijdige gegevens kan produceren over driedimensionale geometrie, grootte en andere biofysische eigenschappen van extracellulaire blaasjes. Het ontwikkelde protocol begeleidt de gebruikers bij het gebruik van deze analytische tool en schetst de workflow voor de analyse van EVs door de AFM, die de monstervoorbereiding voor beeldvormings EVs in gehydrateerde of gedroogde vorm omvat, de elektrostatische immobilisatie van blaasjes op een substraat, data-acquisitie, analyse en interpretatie. De representatieve resultaten tonen aan dat de fixatie van EVs op het gemodificeerde mica-oppervlak voorspelbaar, aanpasbaar is en de gebruiker in staat stelt om dimensionerings resultaten te verkrijgen voor een groot aantal blaasjes. De blaasje dimensionering op basis van de AFM gegevens bleek consistent te zijn met de cryo-TEM Imaging.
Introduction
Extracellulaire blaasjes (Ev's) zijn aanwezig in alle lichaamsvloeistoffen, waaronder bloed, urine, speeksel, melk en het vruchtwater. Exosomes vormen een districts klasse van EVs, onderscheiden van andere EVs door endosomale biogenese, de markers van het endosomale traject en de kleinste grootte onder alle Ev's. De grootte van exosomen wordt vaak gerapporteerd met een aanzienlijke variabiliteit tussen studies. De dimensionerings resultaten bleken methode afhankelijk te zijn, wat het verschil in fysische principes weerspiegelt dat door verschillende analytische technieken wordt gebruikt om de EV-grootten1,2teschatten. De nanodeeltjes Tracking Analysis (NTA)-de meest gebruikte maat karakterisatie techniek-schat de grootte van EVS als hun hydrodynamische diameters, die kenmerkend zijn voor de weerstand tegen de Brownische mobiliteit van EVS in de oplossing. Een grotere hydrodynamische diameter van een vesikel impliceert zijn lagere mobiliteit in vloeistof. De coronale laag rond blaasjes, bestaande uit oppervlakte eiwitten en andere moleculen die aan het membraanoppervlak zijn verankerd of geadsord, belemmert de mobiliteit aanzienlijk en vergroot de hydrodynamische grootte van Ev's. In relatieve termen is deze toename bijzonder groot voor de exosomen3, zoals geïllustreerd in Figuur 1.
De cryogene transmissie elektronenmicroscopie (cryo-TEM) beeldvorming is een definitieve techniek in het karakteriseren van blaasje maten en morfologie in hun gehydrateerde toestanden. Echter, de hoge kosten van de instrumentatie en de gespecialiseerde expertise die nodig zijn om het correct te gebruiken motiveren de verkenning van alternatieve technieken die kunnen beeld gehydrateerd EVs. Een relatief klein aantal EVs waargenomen of gekarakteriseerd in de verworven cryo-TEM beelden is een ander opmerkelijk nadeel van deze techniek.
Atomaire kracht microscopie (AFM) visualiseert de driedimensionale topografie van gehydrateerde of gedroogde ev's4,5,6 door een sonde over het substraat te scannen om het beeld van de deeltjes op het oppervlak te rasterlen. De essentiële stappen van het protocol om EVs door de AFM te karakteriseren, worden in deze studie uiteengezet. Voordat de blaasjes in vloeistof worden gevisualiseerd, moeten ze worden geïmmobiliseerd op een substraat door ofwel Tethering aan een Gefunctionaliseerde oppervlak, overvulling in een filter, of door elektrostatische aantrekkingskracht7. De elektrostatische fixatie op een positief geladen substraat is een bijzonder handige optie voor immobilisatie van exosomen waarvan bekend is dat ze een negatief Zeta-potentieel hebben. Echter, dezelfde elektrostatische krachten die de extracellulaire blaasjes op het oppervlak immobiliseren, verstoren ook hun vorm, wat post-Imaging data-analyse essentieel maakt. We hebben dit punt uitgewerkt door het algoritme te beschrijven dat de grootte van de bolvormige blaasjes in de oplossing schat op basis van de gegevens van de AFM over de vervormde vorm van de exosomen geïmmobiliseerd op het oppervlak.
In het ontwikkelde protocol wordt de procedure voor de robuuste elektrostatische immobilisatie van blaasjes gepresenteerd en gevolgd door de stappen die nodig zijn om atoom kracht imaging in de gehydrateerde of drooghoudende toestanden uit te voeren. De factoren die invloed hebben op de oppervlakte concentratie van de geïmmobiliseerde blaasjes worden geïdentificeerd. De leiding wordt gegeven over het uitvoeren van de elektrostatische immobilisatie voor monsters met verschillende concentraties van EVs in de oplossing. De selectie van experimentele omstandigheden die de raming van empirische kansverdelingen van verschillende biofysische eigenschappen, gebaseerd op een voldoende groot aantal geïmmobiliseerde blaasjes, wordt besproken. Voorbeelden van post-Imaging analyse van de AFM-gegevens worden gegeven. Specifiek, een algoritme wordt beschreven voor het bepalen van de grootte van blaasjes in de oplossing op basis van de AFM karakterisatie van geïmmobiliseerde EVs. De representatieve resultaten tonen de consistentie van de blaasje dimensionering door de AFM met de resultaten van cryo-TEM Imaging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. isolatie van EVs uit een biovloeistof
- Isoleer EVs door een van de vastgestelde methoden, zoals de differentiële ultracentrifugatie8, precipitatie of grootte-uitsluitings chromatografie9.
- Bevestig de aanwezigheid van de verwachte oppervlakte-en Luminale biomarkers en de afwezigheid van biomarkers die kruisbesmetting van het preparaat aangeven. Bevestig de morfologie van de lipide-dubbelgelaagde van de geïsoleerde deeltjes met elektronenmicroscopie.
Opmerking: bij het isoleren van de exosomen moet de hydrodynamische grootteverdeling, gemeten door nanodeeltjes-traceer analyse (NTA) of Dynamische lichtverstrooiing, in het verwachte bereik liggen. De details van EV en exosome isolatie vallen buiten het bestek van dit protocol. De gekozen methode zal afhangen van experimentele vragen en het doel van de studie10. De volgende stappen geven een concrete illustratie van de procedure om de exosomen te verrijken door precipitatie uit het groeimedium van MCF-7 borstkankercellen met behulp van een in de handel verkrijgbare neerslag Kit (tabel met materialen). - Voor celkweek uitbreiding, bewaar MCF-7 borstkankercellen in vloeibare stikstof. Cellen ontdooien tot subcultuur.
- Na aseptische praktijken, uitvoeren van celplating op 150 mm platen. Gebruik het groeimedium bestaande uit de Eagle's minimale essentiële medium, 0,01 mg/ml humane recombinant insuline, en 10% exosome-vrij foetaal runderserum.
- Beluate de kweek met 95% lucht en 5% CO2 en inbroed bij 37 °C.
- Nadat de cellen zijn afgewikkeld (ongeveer 24 h na het beplating), verander de media. Splits de plaat met een verhouding van 1:10 en kweek tien platen, elk met 20 mL media.
- Oogst en pool media van 9 van deze platen (180 mL) bij ~ 70−80% samenloop wanneer cellen zich nog in de groeifase bevinden.
- Verdeel de media in 60 mL en 120 mL, verder opgesplitst in 30 mL/buis en centrifugeer bij 3.000 x g gedurende 15 minuten.
- Breng de supernatant van elke buis over naar een nieuwe steriele 50 mL Tube en voer de exosome isolatie uit.
- Isoleer exosomen door neerslag volgens gepubliceerde protocollen (zie bijvoorbeeld referentie11) of volg de instructies van defabrikant alser een commerciële isolatie kit (tabel met materialen) wordt gebruikt. Als eerste stap in het laatste geval, centrifuge Cell medium bij 3.000 x g gedurende 15 min. Zuig de supernatant op en gooi cellen en celresten weg.
- Voeg de precipitatie oplossing (1:5 volume verhouding) toe aan de supernatant, meng en koel de koeling 's nachts.
- Centrifugeer op 1.500 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant na het centrifugeren weg.
- Draai de overblijvende exosome pellet nog eens 5 min bij 1.500 x g. Zonder de pellet te verstoren, verwijder de resterende neerslag oplossing door aspiratie.
- Respendeer de pellet in 100−500 μL 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) buffer en verdeel in meerdere aliquots naar behoefte voor de downstream analyse.
- Onmiddellijk overgaan tot het oppervlak immobilisatie van de geïsoleerde exosomen voor AFM beeldvorming. Indien nodig, Vries de aliquots op-80 °C voor later gebruik tijdens het nemen van voorzorgsmaatregelen om beschadiging van het monster tijdens de Vries-ontdooien cyclus te voorkomen.
2. oppervlakte fixatie van extracellulaire blaasjes
- Gebruik sterke dubbelzijdige tape, epoxy of een alternatieve lijm om een mica-schijf stevig aan een AFM/scanning tunneling microscoop (STM) magnetische roestvrijstalen specimen schijf te bevestigen.
- Cleave mica disc met behulp van een scherp scheermesje of een mes, of door een plakband aan het bovenoppervlak te bevestigen en vervolgens af te maken om een laag materiaal te verwijderen.
Opmerking: beide methoden moeten een maagdelijk oppervlak onthullen door een dun laagje mica te verwijderen dat eerder aan de omgeving is blootgesteld. Na de ingreep moet de bevestiging van mica aan de AFM/STM metaal preparaat schijf stevig blijven. - Behandel bij kamertemperatuur het bovenste oppervlak van mica voor 10 s met 100 μL van 10 mM NiCl2 -oplossing, die de oppervlakte lading wijzigt van negatief naar positief.
- DEP NiCl2 oplossing met een pluisvrij veeg-of blotting papier. Was het mica-oppervlak 3x met gedeïoniseerd (DI) water en droog het met een stroom droge stikstof.
Opmerking: het is een goede gewoonte om het gemodificeerde oppervlak met de AFM te scannen om te bevestigen dat het vrij is van verontreinigingen. - Plaats de AFM-preparaat schijf met het daaraan gehechte oppervlakte gemodificeerde mica in een petrischaaltje.
- Verdun het exosome monster van stap 1,14 met 1x PBS om een concentratie te verkrijgen tussen 4,0 x 109 en 4,0 x 1010 deeltjes per ml oplossing. Valideer de verdunde DEELTJESCONCENTRATIE met NTA.
- Vorm een Sessile druppel op het oppervlak van mica door 100 μL van de verdunde exosome oplossing uit een pipet te legen.
- Plaats het deksel op de petrischaal en verzegel het met een paraffine folie om de verdamping van het monster te verminderen. Inbroed het monster voor 12−18 uur bij 4 °C.
Opmerking: de oppervlaktedichtheid van de geïmmobiliseerde exosomen zal toenemen met de incubatietijd en de concentratie van EVs in de vloeistof. Een langere incubatietijd kan nodig zijn als exosomen in het monster bij lagere concentraties aanwezig zijn. - Na incubatie, aspiraat 80−90% van het monster zonder het oppervlak te verstoren. Op dit punt zullen de exosomen elektrostatisch worden geïmmobiliseerd op het mica substraat.
- Spoel het oppervlak af met 1x PBS voordat u een gehydrateerde EVs Imaging. Herhaal 3x. Zorg ervoor dat het monster gehydrateerd blijft gedurende het spoelproces.
- Na het wassen van het mica-oppervlak met 1x PBS, verwijdert u 80%−90% van de vloeistof en Pipetteer ~ 40 μL verse 1x PBS om het monster te bedekken.
- Bij het beeldvorming van de gedroogde EVs, spoel het substraat met DI water. Herhaal 3x.
Opmerking: spoelen met DI water voorkomt de vorming van zoutkristallen en de afzetting van opgeloste stoffen op het oppervlak als het substraat droogt. - Vóór het beeldvormende gedroogde EVs, zuig zoveel mogelijk vloeistof op zonder het oppervlak aan te raken en de rest te drogen met een stroom droge stikstof.
3. AFM-beeldvorming
- Om de gedroogde EVs te kunnen afbeellen, selecteert u een Cantilever die is ontworpen voor het scannen in de lucht in de te tikken en contactloze beeldvormings modi en Monteer deze op de sonde houder.
Opmerking: de kenmerken van een voorbeeld Cantilever vermeld in de tabel van materialen (123 μm lengte, 40 μm breedte, 7 nm punt straal en 37 N/m veerconstante) kunnen worden gebruikt als een leidraad bij het selecteren van een sonde die compatibel is met de BESCHIKbare AFM-instrumentatie.- Plaats de bereiding vanaf stap 2,13 op het podium van AFM. De magnetische roestvrijstalen specimen schijf zal het monster op het podium immobiliseren. Tijd voor de bereiding en het podium om thermisch te equilibreren.
- Gebruik de tapmodus om een voldoende groot gedeelte van het oppervlak vande mica tescannen. Kies bijvoorbeeld een gebied van 5 x 5 μm, in 512-lijnen met een scansnelheid van ~ 1 Hz. Verkrijg zowel de hoogte-als de fase-installatiekopieën als ze aanvullende informatie over de topografie en de oppervlakte-eigenschappen van het monster bieden.
Opmerking: de scantijd wordt verhoogd met het afbeeldingsgebied en het aantal regels dat is geselecteerd om de afbeelding te vormen, maar neemt af met de scansnelheid die is gedefinieerd als het aantal regels dat per seconde is gescand. Snelle scansnelheden kunnen van invloed zijn op de beeldkwaliteit. Daarom moet de snelheid van het rastering de afweging tussen de aanschaf tijd en de beeldkwaliteit in evenwicht brengen.
- Voor het beeld gehydrateerd blaasjes, selecteer een Cantilever geschikt voor het scannen van zachte, gehydrateerde monsters en monteer de cantilever op een sonde houder ontworpen voor het scannen in vloeistoffen.
Opmerking: bij het selecteren van een sonde die compatibel is met de beschikbare AFM-instrumentatie, worden de specificaties van de sonde vermeld in de tabel met materialen (driehoekige Cantilever met 175 μm nominale lengte, 22 μm breedte, 20 nm punt straal, 0,07 N/m veerconstante, en geoptimaliseerd voorbeeld vorming met de aandrijf frequentie in het bereik van 4 tot 8 kHz) kan als leidraad worden gebruikt.- Bevochtig de punt van de cantilever met 1x PBS om de kans op het inbrengen van luchtbellen in de vloeistof te verminderen tijdens het scannen.
- Plaats de bereiding vanaf stap 2,11 op het podium van AFM. De magnetische roestvrijstalen specimen schijf immobiliseren de bijgevoegde mica met geïmmobiliseerde EVs op het oppervlak.
- Tijd voor de bereiding en de AFM fase om thermisch te equilibreren.
- Afbeelding van het gehydrateerde mica-oppervlak in de tapmodus. Verkrijg zowel de hoogte-als de fase-installatiekopieën.
Opmerking: de beeldkwaliteit wordt beïnvloed door de instrumentatie, de geselecteerde sonde en Scanparameters. Bij het optimaliseren van de scan condities kunnen de volgende keuzes worden gebruikt als uitgangspunt: 5 x 5 μm gebied gescand in 512 lijnen met ~ 0.8-1.0 Hz scan rate en aandrijf frequentie tussen 4 en 8 kHz.
4. beeldanalyse
Opmerking: de volgende gegevensverwerkings-en analysestappen worden toegepast op de verworven hoogte beelden. Een soortgelijke procedure kan worden aangepast om de fase gegevens te analyseren. De beschrijving hieronder is specifiek voor gwyddion12, een gratis en open source software beschikbaar onder GNU General Public License. Vergelijkbare mogelijkheden zijn beschikbaar in alternatieve software tools.
- Ga naar Data proces, SPM modes, Tip en kies model Tip (Figuur 2). Selecteer de geometrie en de afmetingen van de tip die wordt gebruikt om het voorbeeld te scannen en klik op OK.
- Corrigeer de punt erosie-artefacten door de oppervlakte reconstructie uit te voeren. Open de afbeelding. Selecteer in het menu gegevens proces, SPM-modi, Tip, kies vervolgens oppervlakte reconstructie en klik op OK (afbeelding 3).
- Lijn het Imaging vlak uit zodat het overeenkomt met het laboratorium XY-vlak door de kanteling van de ondergrond te verwijderen uit de scangegevens. Als u deze taak wilt uitvoeren, selecteert u gegevens proces, niveau en kiest u vlak niveau (Figuur 4).
- Lijn de rijen van de afbeelding uit door gegevens proceste selecteren, gegevens te corrigeren en vervolgens rijen uitlijnente kiezen. Er zijn verschillende uitlijningsopties beschikbaar (Figuur 5). Mediaan is bijvoorbeeld een algoritme dat een gemiddelde hoogte van elke scanlijn vindt en deze van de gegevens aftrekt.
- Ga naar gegevens proces, Corrigeer gegevens en kies littekens verwijderen (Figuur 6), waarmee veelvoorkomende scan fouten die littekens worden genoemd, worden verwijderd.
- Lijn het mica-oppervlak uit op de nulhoogte, Z = 0, door basis niveau in het dropdown-menu vlak te selecteren dat toegankelijk is vanuit het gegevens proces (afbeelding 7).
- Identificeer EVs op het gescande oppervlak met behulp van Mark by Threshold in korrels drop-down menu (figuur 8a). Dit algoritme identificeert oppervlakte-geïmmobiliseerde exosomen als deeltjes uitsteekt van de Zero-oppervlakte substraat door de hoogte boven de door de gebruiker geselecteerde drempel. Selecteer een drempelwaarde in het bereik tussen 1 en 3 nm, waardoor de meeste achtergrond interferentie wordt geëlimineerd. Kleinere drempels worden gebruikt met schonere achtergrond.
Opmerking: de drempelwaarde in figuur 8a is 1,767 nm. De uitkomst van de MCF-7 exosome identificatie met deze drempel is weergegeven in figuur 8b. Gwyddion biedt verschillende alternatieven voor drempelmethode als het algoritme voor het automatisch identificeren van blaasjes in de afbeelding, met inbegrip van geautomatiseerde drempel (methode van Otsu), randdetectie en het algoritme van de waterscheiding.
Opmerking: deeltjesagglomeraten, indien aanwezig in het AFM-beeld, kunnen worden gemaskeerd en uitgesloten van de analyse. - Voer geometrische en dimensionale karakterisering van de geïdentificeerde EVs uit met behulp van de beschikbare distributies algoritmen toegankelijk uit korrels menu.
Opmerking: gwyddion biedt hulpmiddelen om de verdeling van scalaire waarden, Areal, volumetrische en andere eigenschappen van geïmmobiliseerde Ev's in een gehydrateerde of dessierd toestand te beoordelen. Een voorbeeld van een scalaire waarde eigenschap wordt weergegeven in afbeelding 9, die de verdeling van de maximale hoogten binnen de voetafdruk van elke geïdentificeerde exosome geeft. - Exporteer de AFM-gegevens van gwyddion voor gespecialiseerde analyse door andere computationele tools en aangepaste computerprogramma's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De oppervlakte fixatie van EVs is een kritieke stap in de beeldvormings sequentie. Elektrostatische oppervlakte immobilisatie van exosomen, waarvan bekend is dat ze een negatief Zeta-potentieel hebben, zal robuust optreden nadat het substraat van mica is aangepast om een positieve oppervlakte lading te hebben. Zonder de behandeling met NiCl2 om positieve oppervlakte veranderingen uit te voeren, bleek de immobilisatie van EVS op het substraat ineffectief te zijn. Het hoogte plaatje in afbeelding 10a, verworven in de lucht na het MCF-7 exosome monster met 2,59 x 1010 BLAASJES per ml PBS, werd gedurende 12 uur geïnventariseerd op een ongewijzigd oppervlak van vers gecleaved mica, vertoont zeer weinig blaasjes die nog oppervlak nadat het was gereinigd met DI water. De blaasjes zichtbaar in afbeelding 10a zijn, hoogstwaarschijnlijk, het resultaat van onvolledige aspiratie van di water, die resuspendeerde blaasjes niet bevestigd aan het oppervlak en vervolgens afgezet op het substraat als het verdampte.
Na het wijzigen van de oppervlakte lading met nikkel chloride, is het raadzaam om te bevestigen dat het oppervlak vrij blijft van verontreinigingen na de behandeling. De hoogte afbeelding in figuur 10B (verkregen in de lucht) geeft een voorbeeld van een schoon oppervlak nadat het werd behandeld met nicl2 en vervolgens drie keer gewassen met di water. De ruwheid van kationen-derivatized oppervlak was lager dan 0,3 nm, wat consistent is met het vorige rapport13.
De dramatische positieve impact van de oppervlakte lading modificatie op de efficiëntie van de fixatie van MCF-7 exosomen wordt geïllustreerd door figuur 10c,D. Deze twee panelen tonen de in de lucht verworven hoogte scans na het monster, dat eerder in figuur 10Awerd afgebeeld, werd geïnnobeerd voor respectievelijk 24 uur en 12 uur op het met nikkel chloride behandelde oppervlak.
De tijd dat een bepaald monster op het behandelde oppervlak wordt geïnineerd, bepaalt de oppervlakte concentratie (blaasjes per gebied) van de geïmmobiliseerde EVs. De hoogte afbeelding in afbeelding 10c illustreert het geval van overmatig dichte oppervlakte dekking door de immobiliseren blaasjes verkregen na de beschreven MCF-7 exosome monster werd geïnnobeerd voor 24 h. Een aantal algoritmen vertrouwen op voldoende onbezette substraat tussen de korrels om beeldcorrectie en data-analyse uit te voeren. Bijvoorbeeld, het nivelleren en verschuiven van de ondergrond naar het nulvlak, de lijn correctie en de schatting van het volume van de korrels hebben het tussenliggende vlakke oppervlak nodig om nauwkeurige berekeningen uit te voeren. Wanneer de concentratie van de geïmmobiliseerde blaasjes is zo hoog als in figuur 10C, deze algoritmen zullen niet betrouwbaar functioneren. Een voorbeeld van een adequate oppervlakte concentratie van blaasjes geïmmobiliseerd uit hetzelfde MCF-7 monster wordt getoond in de hoogte afbeelding in figuur 10d, die werd verkregen na kortere (12 h) incubatie.
De nabewerking van de verkregen onbewerkte AFM-gegevens is nodig om te corrigeren voor veelvoorkomende scan fouten. De volgende beschrijving is specifiek voor gwyddion. Soortgelijke functionaliteit is beschikbaar in andere AFM/SPM data analysetools.
Binnen gwyddion wordt de vliegtuig functie gebruikt om te corrigeren voor een kanteling in het substraat. Een dergelijke achtergrondcorrectie wordt bereikt door eerst het vlak van de ondergrond te vinden met behulp van alle gegevenspunten in de afbeelding en deze vervolgens af te trekken van de onbewerkte gegevens. De correctie langs de scanlijnen wordt bereikt door de functie rijen uitlijnen . Een van de geïmplementeerde algoritmen voert bijvoorbeeld de uitlijning uit door de mediane hoogte van elke scanlijn te berekenen en vervolgens het resultaat af te trekken van de corresponderende rij met afbeeldingsgegevens. De bijdrage van de lokale storingen in de terugmeldlus kan worden verwijderd door de functie Verwijder littekens toe te passen, die de gaten in de uitgelijnde gegevens vult en de littekens elimineert door de gegevens in de aangrenzende scanlijnen te vergelijken. De verschuiving van het substraat naar de hoogte Z = 0 kan worden bereikt door een combinatie van een facet en polynomiale nivellering van het oppervlak na het maskeren van korrels en andere functies. Het hulpprogramma voor het afvlakken van gwyddion voert deze taak autonoom of met een door de gebruiker opgegeven masker uit. Na de beschreven achtergrond en lijn correcties, de elektrostatisch gefixeerde blaasjes kunnen worden geïdentificeerd op het substraat door het uitvoeren van Mark korrels functie.
Figuur 11a en figuur 11b tonen hoogte-en fase beelden van gehydrateerde MCF-7 exosomen geïmmobiliseerd op een mica-oppervlak en verworven in PBS met behulp van de tapmodus. In totaal werden 561 gehydrateerde blaasjes geïdentificeerd in het gescande gebied met behulp van het drempel algoritme van de functie Mark Grains met de drempelwaarde ingesteld op ~ 20%. De fase vertraging van de reactie van de sonde bij de aandrijf frequentie is gevoelig voor gelokaliseerde stijfheid variaties in zachte monsters. De consistentie tussen de hoogte-en fase beelden, gezien in figuur 11a,B, is daarom een belangrijke bevestiging dat de afbeelding gemaakt korrels inderdaad zachte blaasjes geïmmobiliseerd zijn op het substraat.
Figuur 11C toont de dwarsdoorsnede van de hoogte afbeelding via exosomen op de witte lijn in figuur 11a. Terwijl de exosomen in een biovloeistof een bolvormige geometrie1,14,15,16hebben, wordt hun vorm op het substraat ernstig vervormd door de elektrostatische aantrekkingskracht op de positief geladen Oppervlak. De Oblate pannenkoek-achtige geometrie van elektrostatisch geïmmobiliseerde blaasjes wordt verder geïllustreerd in figuur 11D door de close-up hoogte afbeelding (en de dwarsdoorsnede) van een exosome boxed in figuur 11a. Het corresponderende fase beeld wordt weergegeven in afbeelding 11e. De empirische kansdichtheidsfunctie (PDF) van piekhoogten boven het oppervlak voor alle 561 gehydrateerde blaasjes die in de AFM-scan zijn geïdentificeerd, wordt weergegeven in figuur 12a. De gemiddelde waarde voor deze verdeling is 7,9 nm, die ongeveer gelijk is aan tweemaal de dikte van een fosfolipide dubbellaagte17 bij afwezigheid van vervormings krachten.
Het gebied op het substraat bezet door een geïmmobiliseerde exosome werd benaderd als een cirkel met de diameter gelijk aan de gemiddelde afstand van het vesicle "centrum van de massa" tot de grens op het oppervlak van de mica. De verdeling van deze projectie diameters wordt weergegeven in figuur 12a en heeft het gemiddelde gelijk aan 69,6 nm. De verkregen hoogte en de diameter verdelingen kwantificeren verder de significante impact van de elektrostatische oppervlakte immobilisatie op de vervormde vorm van geïmmobiliseerde exosomen.
De robuustheid en reproduceerbaarheid van de protocol procedures werden bevestigd door het dezelfde MCF-7-monster drie keer te heranalyseren, van monstervoorbereiding tot beeldvorming, waarbij elke herhalings resultaat statistisch vergelijkbaar was met de resultaten in Figuur 12.
De vervorming van geïmmobiliseerde blaasjes veroorzaakt door elektrostatische krachten kan worden gecompenseerd of geïnterpreteerd om inzicht te geven in de eigenschappen van de afbeelding gemaakt EVS. De AFM-gegevens kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om de bolvormige grootte van de blaasjes in de oplossing te schatten. Als uitgangspunt kunnen we het volume berekenen dat is ingekapseld door de membraan enveloppen van geïmmobiliseerde blaasjes. Het volume wordt gevonden door de integratie van het verschil tussen het oppervlakte niveau van de geïdentificeerde blaasjes en de ondergrond hoogte eronder. Het substraat niveau onder de blaasjes is niet direct toegankelijk, maar kan worden geschat door de Laplace of alternatieve interpolatie van gegevenspunten voor onbezette substraat rond de blaasjes. Binnen gwyddion wordt een dergelijke volumeberekening uitgevoerd met behulp van de verdeling van verschillende korrel kenmerken functie. Het resultaat dat wordt geëxporteerd uit gwyddion kan vervolgens worden toegewezen in de diameters van volume-equivalent bollen.
De toepassing van het beschreven algoritme op de AFM-gegevens voor 561 geanalyseerde gehydrateerde MCF-7 blaasjes produceerde de verdeling van de diameter van de volume-equivalente bollen zoals weergegeven in figuur 12B. Deze verdeling schat de grootte van membraan blaasjes in hun aangeboren bolvormige vorm in een biovloeistof voor hun elektrostatische fixatie op het mica-oppervlak. De blaasje dimensionering verkregen uit de analyse van de AFM-gegevens werd vergeleken met de resultaten van cryo-TEM beeldvorming van hetzelfde monster en bleek in nauwe overeenstemming te zijn3 (figuur 12b). De vergelijking van de hydrodynamische diameters gemeten door de NTA met de verkregen blaasje maten (Figuur 1) geeft aan dat de mobiliteit van exosomen veel kleiner is dan verwacht wordt van de grootte van hun blaasjes, bepaald door de AFM en het cryo-TEM Metingen. Het verschil tussen de hydrodynamische en blaasje maten karakteriseert de dikte van de coronale laag rondom exosomale blaasjes.
Figuur 1: vergelijking van de hydrodynamische en geometrische diameters van EVs. De geometrische grootte van het exosomale vesikel is aanzienlijk kleiner dan de hydrodynamische grootte die wordt bepaald door diffusie in een vloeistof. Het verschil is de coronale laag gevormd door membraan-geconjugeerd en geadsorlageerde moleculen die de mobiliteit van EVs belemmeren. Dit cijfer wordt gewijzigd van verwijzing3 en opnieuw afgedrukt met toestemming.
Figuur 2: eigenschappen van de AFM-sonde. De geometrie en de afmetingen van de AFM-sonde kunnen worden gespecificeerd met behulp van de Modeltip functie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: correctie van Imaging artefact veroorzaakt door convolutie van de tip-sample. Door oppervlakte reconstructieuit te voeren, kunnen de verkregen AFM-gegevens worden gecorrigeerd voor tip-artefacten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: correctie voor een kanteling in het substraat. Vlak niveau bepaalt het vlak van het substraat en trekt dit af van de AFM-gegevens. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Afbeelding 5: correctie van onjuiste overeenstemmingen in scan rijen. Een conventioneel algoritme om de scangegevens uit te lijnen is het vinden van een gemiddelde hoogte langs elke scanlijn en trekt het resultaat af van de corresponderende rij met gegevenspunten in de afbeelding. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: correctie voor de lacunes in de uitgelijnde gegevens. Veelvoorkomende scan fouten, bekend als littekens, kunnen uit de AFM-gegevens worden verwijderd door het toepassen van de functie Verwijder Scars. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Afbeelding 7: uitlijning van een substraat op nul hoogte. Met de optie afvlakken in het menuniveau kan de gebruiker het substraat oppervlak op het basisniveau plaatsen dat overeenkomt met de nulhoogte. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: identificatie van geïmmobiliseerde blaasjes op het gescande oppervlak. A) de oppervlakte-geïmmobiliseerde exosomen worden geïdentificeerd als korrels die uitsteekt boven de ondergrond door een door de gebruiker geselecteerde hoogte drempelwaarde die in de markering per drempelis aangegeven. B) de uitkomst van de identificatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 9: analyse van de gegevens van de AFM. De verdeling van de maximale hoogten boven het substraat in het gebied bezet door de geïdentificeerde exosomen wordt getoond als samengesteld door graan verdelingen gereedschap. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 10: effect van oppervlakte modificatie en EV-concentratie van de oppervlaktedichtheid van geïmmobiliseerde blaasjes. A) het hoogte beeld van AFM van vers gespleten mica substraat na 12 h incubatie met MCF-7 exosome monster gevolgd door reiniging met di water en drogen. De immobilisatie van EVs van de vloeistof naar het substraat is inefficiënt zonder een positieve lading aan het oppervlak van mica te onttrekken. Weinig deeltjes gezien in de scan zijn waarschijnlijk het resultaat van onvolledige verwijdering van het MCF-7 monster voordat het substraat werd gedroogd. B) de hoogte scan van het oppervlak van mica in de lucht na de behandeling met nikkel chloride toont het substraat vrij van verontreinigingen. Panelen (C) en (D) tonen AFM hoogte scans verkregen na de wijziging van de oppervlakte lading en de INCUBATIE met hetzelfde MCF-7 monster als in paneel (A) voor respectievelijk 24 uur en 12 uur. De oppervlakte concentratie van geïmmobiliseerde blaasjes is buitensporig dicht na 24 h incubatie. De 12 h incubatie leidt tot minder exosomen geïmmobiliseerd op het oppervlak en de scangegevens die gemakkelijker te analyseren nauwkeurig. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Afbeelding 11: AFM beelden van gehydrateerde MCF-7 exosomen elektrostatisch geïmmobiliseerd op het gemodificeerde mica oppervlak. (A) de hoogte afbeelding. B) het corresponderende AFM-fase beeld bevestigt dat de korrels in het hoogte beeld zachte nanodeeltjes zijn, zoals te verwachten is voor membraan blaasjes. C) de hoogtegegevens van de drie blaasjes die door de lijn (A) worden gekruist, illustreren een afgevlakte vorm die wordt veroorzaakt door de elektrostatische aantrekkingskracht van exosomen op het positief geladen oppervlak van het gemodificeerde mica. D) de vorm vervorming blijkt in een vergrote weergave de geïmmobiliseerde blaasje boxed in paneel (A) en zijn dwarsdoorsnede. Het fase beeld van hetzelfde vesikel wordt weergegeven in (E). Dit cijfer wordt gewijzigd van verwijzing3 en opnieuw afgedrukt met toestemming. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 12: dimensionale karakterisering van gehydrateerde blaasjes geïmmobiliseerd op het oppervlak en de schatting van hun bolvormige grootte in de oplossing. A) de verdeling van piekhoogten boven het oppervlak (rode kromme) heeft het gemiddelde gelijk aan 7,9 nm. Het gebied bezet door geïmmobiliseerde exosomen heeft een gemiddelde diameter van 69,6 nm (blauwe curve). (B) AFM hoogte beeld voor een van de geïmmobiliseerde exosomen illustreert zijn zeer oblaat vorm veroorzaakt door elektrostatische krachten. De bolvormige grootte van exosomale blaasjes in de oplossing kan worden geschat door overeenkomende volumes ingesloten door oppervlakte-geïmmobiliseerde en sferische membraan enveloppen. C) de grootteverdeling van bolvormige blaasjes in de oplossing (rode kromme) werd bepaald uit de AFM-gegevens van 561 geïmmobiliseerde blaasjes. De blaasje maten in cryo-TEM beelden (blauwe curve) zijn consistent met de AFM resultaten. Dit cijfer wordt gewijzigd van verwijzing3 en opnieuw afgedrukt met toestemming. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 13: oppervlakte concentratie en grootte segregatie artefacten tijdens passieve afzetting van EVs uit verdampende vloeistof. A) het Scan-Elektron microscopie (SEM)-beeld toont aan dat de oppervlakte concentratie van exosomen die passief uit een droog vloeistof is gestort, ruimtelijk variabel is wanneer de oppervlakte-immobilisatie van een suspensieve biovloeistof niet wordt uitgevoerd. B) passieve afzetting van EVS uit een droog monster zorgt voor scheiding van de grootte van de blaasjes. De omvangrijke variabiliteit wordt gekwantificeerd door de kansdichtheids functies (PDF) voor de blaasjes in verschillende gebieden in de afbeelding (A) gedefinieerd door witte diagonale lijnen. Dit cijfer wordt gewijzigd van verwijzing1 en opnieuw afgedrukt met toestemming. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 14: bekervormige geometrie van drooggelegde blaasjes passief afgezet op het oppervlak tijdens de vloeibare verdamping. De oppervlakte-uitdroging van blaasjes die niet geïmmobiliseerd door elektrostatische krachten is bekend te resulteren in een bekervormige verschijning vaak waargenomen in SEM afbeeldingen van EVs. Dit cijfer wordt gewijzigd van verwijzing1 en opnieuw afgedrukt met toestemming. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De immobilisatie van EVs uit een biologische vloeistof, oppervlakte scanning en beeldanalyse zijn de essentiële stappen van het ontwikkelde protocol voor de AFM-karakterisering van Ev's in vloeistof. Het aantal blaasjes vatbaar voor AFM beeld schalen met het oppervlak van de afbeelding en de oppervlakte concentratie van de blaasjes geïmmobiliseerd op het substraat. Gezien een negatief Zeta-potentieel van ev's en exosomen18, pleiten we voor elektrostatische fixatie van EVS van vloeibare monsters naar het AFM-substraat. De immobilisatie is effectief wanneer het oppervlak positief wordt opgeladen. Voorafgaand aan de EV-immobilisatie moet de positieve oppervlakte lading mogelijk aan het substraat worden toegerekend, zoals in het geval van mica-een gelaagd silicaat mineraal met algemene formule KAl2(alsi3O10) (Oh)2. Het oppervlak van de verscleaved mica is dicht bij perfect vlak, wat ideaal is voor het beeldvormende nanodeeltjes door de AFM, maar de oppervlakte lading is negatief en moet dus worden gewijzigd. Het protocol beschrijft de procedure voor het delen van een positieve oppervlakte verandering aan het AFM-substraat. De representatieve resultaten vertonen een duidelijke verbetering van de EV-fixatie van een biovloeistof naar het gemodificeerde mica substraat.
Bij het uitbeelden van gehydrateerde blaasjes is het belangrijk om de verdamping van monsters te minimaliseren, waardoor de oppervlakte depositie artefacten en convectieve stromen worden veroorzaakt en de vloeistof concentratie van de blaasjes met de tijd toeneemt, wat leidt tot een hogere oppervlakte concentratie van geïmmobiliseerde EVs dan verwacht, vooral tijdens langdurige incubaties. Sonde houders die expliciet zijn ontworpen voor vloeibare monsters elimineren of langzame verdamping en dienen te worden gebruikt om gehydrateerd EVs te beeld. Niet-specifieke bindingen met de scan sonde worden gereduceerd in aanwezigheid van Ionische soorten. Daarom is het bij het maken van een gehydrateerde EVs beter om het substraat te bedekken met een gebufferd medium, zoals PBS, in plaats van DI water.
Belang van oppervlakte immobilisatie
De consistente en voorspelbare immobilisatie van EVs op het gemodificeerde substraat verwijdert de primaire bron van variabiliteit in de AFM-resultaten. Alle downstream stappen, van scannen naar gegevensanalyse, zijn gemakkelijker te controleren door de selectie van instrumentatie, tests, Scanparameters en de volgorde van gegevensanalyse en algoritmen. De gebruiker moet zich bewust zijn van de variabiliteit in biologische monsters en de EV-isolatie protocollen, die belangrijke kwesties zijn buiten de reikwijdte van dit werk.
We raden aan oppervlakte-immobilisatie van EV op het oppervlak van de gemodificeerde mica uit vloeibare monsters te voeren, zelfs als het doel is om gedroogde blaasjes in de lucht te karakteriseren — de behoefte is minder evident, omdat blaasjes onvermijdelijk op elk substraat zullen storten als de vloeistof verdampt. In feite, de AFM resultaten voor gedroogde EV verkregen zonder aanpassing van de oppervlakte heffingen van mica, wat een vereiste stap is voor elektrostatische immobilisatie van ev's uit een vloeistof, zijn gerapporteerd in de afgelopen19,20,21 . Wanneer EVs niet aan het oppervlak van het vloeistofmonster worden bevestigd, zal hun passieve afzetting door verdamping echter artefacten produceren die gezamenlijk bekend staan als een koffie ring-effect22. Twee dergelijke artefacten, die zich voordoen als een droog vloeistof, worden geïllustreerd in het SEM-beeld (figuur 13a) van serum exosomen afgezet door verdamping op een negatief geladen glasoppervlak. Significante variaties in de oppervlakte concentratie van neergeprecipiteerde blaasjes zijn onmiddellijk zichtbaar. Het tweede artefact, gekwantificeerd in figuur 13b, is de aanzienlijke variabiliteit in de blaasje maten in verschillende gebieden binnen de omtrek van het gedroogde monster. Gezien deze artefacten, kan de AFM-karakterisering van passief gestorte blaasjes uit een droog vloeistof bevooroordeeld of inconsistente resultaten opleveren, tenzij het gehele oppervlak dat aanvankelijk door een nu gedroogd vloeistofmonster werd gebruikt, wordt gescand.
Er moeten twee extra problemen worden overwogen bij het beeldvorming van de geadsorbeerde monsters zonder vaste immobilisatie van blaasjes op het substraat. Bedenk dat ons protocol gebruikers instrueert om het oppervlak grondig te wassen met DI water nadat de blaasjes zijn geïmmobiliseerd uit een vloeibaar monster. Deze stap is bedoeld om te voorkomen dat Ionische en andere niet-vesiculaire opgeloste stoffen oppervlakte deposito's vormen tijdens de verdamping van complexe biovloeistoffen met een aanzienlijke osmolariteit. Als EVs niet vast zijn, zal grondig wassen een groot aantal blaasjes van het oppervlak losmaken, waardoor de resultaten mogelijk worden gebivetten en te weinig deeltjes worden geanalyseerd. Een andere gemeenschappelijke moeilijkheid, verminderd door het immobiliseren van EVs op het gemodificeerde mica-oppervlak vóór de AFM-beeldvorming, is de hechting van deeltjes aan de sonde23 en de misleidende artefacten die door dit fenomeen worden veroorzaakt.
Beheersing van de oppervlaktedichtheid van geïmmobiliseerde EVs
De twee gemakkelijk controleerbare factoren die in het protocol zijn geïdentificeerd, kunnen de gebruiker de oppervlakte concentratie van de geïmmobiliseerde EVs op het gemodificeerde mica-substraat aanpassen: de concentratie van de blaasjes in het vloeistofmonster en de tijd waarop het monster wordt geïnineerd de ondergrond. Een hoge dichtheid van geïmmobiliseerde blaasjes, bereikt met een langere incubatietijd en een hogere concentratie van EVS in de vloeistof, verhoogt het aantal blaasjes geanalyseerd tijdens het scannen en de statistische kracht van conclusies aangekomen door de analyse van de AFM Gegevens. Tegelijkertijd is een overmatig dichte oppervlakte concentratie, zoals in het geval getoond in Figuur 10 c , waar deeltjes het gehele oppervlak zonder tussenliggende gebieden van het substraat strak bedekken, de beeldanalyse en de interpretatie van de resultaten compliceert en kan leiden tot het scannen van artefacten veroorzaakt door de interactie tussen sterk verdeelde deeltjes.
Invloed van elektrostatische screening en hydrodynamische mobiliteit van EVs
De transparante controle over de oppervlakte concentratie van geïmmobiliseerde Ev's als functie van factoren die invloed hebben op het stelt een gebruiker in staat om de experimentele voorwaarden aan te passen aan de specifieke behoeften van een studie. Bij het uitvoeren van maatwerk, is het belangrijk om te erkennen dat de elektrostatische oppervlakte immobilisatie een transport-beperkt proces is dat wordt beïnvloed door de Ionische sterkte van de biovloeistof.
De concentratie van Ionische en positief geladen soorten is omgekeerd van invloed op de lengte van de Debye waarover het oppervlak en de blaasje worden gescreend. Naast deze lengte zijn de elektrostatische krachten verwaarloosbaar. De grenslaag van de elektrostatische aantrekkingskracht van het substraat zal veel kleiner zijn in ionically rijke PBS dan in DI water. Dit verschil impliceert dat, na een korte incubatie die overeenkomt met de tijd die nodig is om de laag vloeistof af te putten waar de elektrostatische attracties voelbaar zijn, een oppervlaktedichtheid van EVs geïmmobiliseerd uit de suspensie in DI-water hoger zal zijn dan van PBS suspensie, ervan uitgaande dat de concentratie van EVs hetzelfde is in beide vloeistoffen. Anders gezegd, moeten meer blaasjes worden geïmmobiliseerd om een dikkere aantrekkelijkheid laag in DI water uit te putten dan in PBS onder anders identieke omstandigheden.
Nadat de blaasjes zijn uitgeput van de grenslaag, wordt de immobilisatie een volledig transport-beperkt proces. In dit regime zal de snelheid van de depositie niet afhangen van het suspensieve medium (bijv. DI water of PBS) zolang de viscositeit gelijk is en het transport volledig diffusief is. Het transport van blaasjes in de grenslaag van de attractie mag echter niet geheel diffusie zijn. Bijvoorbeeld, als het monster in een afname van het AFM-substraat gedeeltelijk verdampt tijdens de incubatie, zal de vloeistof in de druppel worden onderworpen aan de verdampings gestuurde stroom, en het transport van de blaasjes naar het substraat zal, zowel diffusie-en convectieve bijdragen. Wanneer de verdamping niet voldoende onder controle is, zal de bijdrage van een convectief transport aanzienlijk zijn, en de snelheid van immobilisatie zal hoger zijn dan verwacht. De impact van het convectieve transport zal veranderen met de dikte van de aantrekking, die zelf afhangt van het Ionische gehalte van de vloeistof. Bovendien zal de verdamping de blaasje immobilisatie op het substraat versterken door de EVS in de oplossing te concentreren. Bij hogere EV-concentraties zal de concentratie gradiënt tussen de aantrekking en de aangrenzende vloeistof toenemen, waardoor een grotere thermodynamische drijvende kracht ontstaat voor de migratie van blaasjes naar het substraat.
Geïmmobiliseerde blaasjes kunnen een vloeibaar monster vertegenwoordigen met een bias. Voor het geval dat de snelheid van immobilisatie wordt beperkt door diffusie, blaasjes met kleinere hydrodynamische maten, bepaald door de combinatie van de blaasje grootte en de dikte van de coronale laag eromheen (Figuur 1), hebben meer kans om de aantrekkelijkheid laag vanwege hun hogere mobiliteit. Bijgevolg zullen de hydrodynamische kleine Ev's na de initiële depletie periode oververtegenwoordigd zijn op het substraat in vergelijking met hun bijdrage aan de EV-populatie in het vloeistofmonster. Merk op dat een kleinere hydrodynamische grootte niet automatisch wijst op EVS met kleinere blaasje maten vanwege de heterogeniteit in de dikte van de coronale laag3. De bevooroordeelde representatie wordt vermeden met lange incubaties die de gehele populatie van EVs in de vloeistof afbreken door de immobilisatie op het substraat. Wanneer een gebruiker streeft naar het immobiliseren van alle EVs uit de biofluid, om te voorkomen dat overmatig dichte dekking van het oppervlak met de geïmmobiliseerde blaasjes, het kan nodig zijn om de EV-concentratie in de vloeistof onder het bereik voorgesteld in het protocol te verminderen.
Vervorming van EVs op het substraat
Extracellulaire blaasjes in hun inheemse gehydrateerde toestand en na uitdroging kan worden gekenmerkt door de AFM, zoals beschreven in het protocol. De elektrostatische krachten24 die EVS op het mica-oppervlak immobiliseren, verstoren ook hun vorm van de bolvormige geometrie waarin ze in de oplossing bestaan. De impact van de uitdroging op de grootte en morfologie van geïmmobiliseerde Ev's kan worden geanalyseerd door het opnieuw scannen van hetzelfde oppervlak voor en nadat het monster mag drogen.
Het is leerzaam om de impact van het monster preparaat op de vorm van de gedroogde EVs te onderzoeken. De elektrostatisch geïmmobiliseerde EVs handhaven de zeer Oblate geometrie na het drogen, maar worden verder afgevlakt door de adsorptie. De hoogte boven het oppervlak van de drooggeadsorbeerd blaasjes wordt kleiner dan in figuur 12a, terwijl hun footprint gebied toeneemt (gegevens niet weergegeven). Aan de andere kant, wanneer blaasjes passief worden afgezet tijdens de vloeibare verdamping en zonder voorafgaande immobilisatie op het oppervlak, hebben ze de neiging om een cupvorm geometrie te bereiken bij uitdroging, zoals al lang is waargenomen in de SEM-beelden en, meer recentelijk, in de AFM Scans. Deze gecupt vorm wordt nu herkend als een monster voorbereidings artefact25 veroorzaakt door niet-uniformiteit in de capillaire krachten tijdens de oppervlakte droging, als mechanistisch uitgelegd in Figuur 141.
Beeldanalyse en interpretatie van AFM-gegevens
De reacties op elektrostatische en capillaire krachten die de vorm van Ev's verstoren, geven waardevolle informatie over de structurele en samenstellings eigenschappen van Ev's. Bijvoorbeeld, een multidimensionale set van biofysische kenmerken, zoals de vervormde grootte en vorm geëxtraheerd uit de gegevens van de AFM, werden onlangs gebruikt om de haalbaarheid te demonstreren om onderscheid te maken tussen exosomen die worden uitgescheiden door verschillende hostcellen5. De verstoringen kunnen ook in aanmerking worden genomen en gecompenseerd. We lieten bijvoorbeeld zien hoe de AFM-gegevens te gebruiken om de bolvormige grootte van blaasjes in de oplossing te karakteriseren door de diameters van bollen die hetzelfde volume inkapen als geïmmobiliseerde exososmes3te schatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen financiële steun van de National Science Foundation (Award Number IGERT-0903715), de Universiteit van Utah (afdeling Chemical Engineering Seed Grant en de Graduate Research Fellowship Award), en Skolkovo Institute of Science en technologie (Skoltech Fellowship).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM/STM Controller | Bruker | Multimode Nanoscope V | This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air. |
| AFM/STM metal specimen discs (10 mm) | TedPella | 16207 | Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means. |
| AFM/STM Mica discs (10 mm) | TedPella | 50 | Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters |
| AFM probe for imaging in the air | Bruker | TESP-V2 | High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air. |
| AFM probe for soft sample imaging in liquid | Bruker | MLCT | Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation. The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy. |
| Double sided tape | Spectrum | 360-77705 | Used to fix the mica disk on the metal specimen disc. |
| ExoQuick-TC | System Biosciences | EXOTC50A-1 | ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media. |
| Glass probe AFM holder for imaging in liquid | Bruker | MTFML-V2 | This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM. The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation. The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation. The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids. |
| Gwyddion | Czech Metrology Institute. | Version 2.52 | Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques. |
| Lint-free blotting paper | GE Healthcare Whatman | Grade GB003 Blotting Paper | Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate. |
| Lint-free cleanroom wipes | Texwipe | AlphaWipe TX1004 | Use these polyester wipes for surface cleaning. |
| Nickel(II) chloride (NiCl2) | Sigma-Aldrich | 339350 | Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Gibco | 10010023 | PBS, pH 7.4 |
References
- Chernyshev, V. S., et al. Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).
- Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 881-906 (2018).
- Skliar, M., et al. Membrane proteins significantly restrict exosome mobility. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).
- Parisse, P., et al. Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles. European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).
- Ito, K., et al. Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning. Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).
- Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles. Nanotechnology. 29, 132001 (2018).
- Meyer, R. L. Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions. Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).
- Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750 (2019).
- Weng, Y., et al. Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling. The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).
- Nečas, D., Klapetek, P. Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis. Open Physics. 10, 181-188 (2012).
- Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling. ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).
- Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).
- Zhou, Y., et al. Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4, 34 (2013).
- Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features. FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).
- Briegel, A., et al. Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).
- Akagi, T., et al. On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells. PLOS ONE. 10, e0123603 (2015).
- Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).
- Radeghieri, A., et al. Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).
- Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes. Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11 (2016).
- Deegan, R. D., et al. Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops. Nature. 389, 827-829 (1997).
- Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy. Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).
- Pastré, D., et al. Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study. Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).
- van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).
