Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Imaging av ekstracellulære blemmer av Atomic Force mikroskopi

Published: September 11, 2019 doi: 10.3791/59254
Automatic Translation
1,2, 3,4
1Department of Chemical Engineering, University of Utah, 2The Nano Institute of Utah, University of Utah, 3Center for Photonics and Quantum Materials, Skolkovo Institute of Science and Technology, 4Biopharmaceutical Cluster 'Northern', Moscow Institute of Physics and Technology

Summary

En trinnvis fremgangsmåte er beskrevet for etikett fri immobilisering av exosomes og ekstracellulære blemmer fra flytende prøver og deres tenkelig av Atomic Force mikroskopi (AFM). Den AFM bildene brukes til å anslå størrelsen på blemmer i løsningen og karakterisere andre Biofysiske egenskaper.

Abstract

Exosomes og andre ekstracellulære blemmer (EV) er molekylære komplekser bestående av en lipid membran vesicle, overflaten dekorasjon av membran proteiner og andre molekyler, og mangfoldig luminal innhold arvet fra en overordnet celle, som inkluderer RNAs, proteiner, og DNAs. Karakterisering av de hydrodynamisk størrelsene på EV ' r, som avhenger av størrelsen på vesicle og dens koronale lag dannet av overflate dekorasjoner, har blitt rutine. For exosomes, den minste av EV ' r, er den relative forskjellen mellom hydrodynamisk og blemmer størrelser betydelig. Karakterisering av blemmer størrelser av kryogene overføring elektron mikroskopi (fryse-TEM) Imaging, en gull standard teknikk, er fortsatt en utfordring på grunn av kostnadene for instrumentet, den kompetansen som kreves for å utføre prøven forberedelse, bildebehandling og dataanalyse, og et lite antall partikler ofte observert i bilder. En allment tilgjengelig og tilgjengelig alternativ er atomkraft mikroskopi (AFM), som kan produsere allsidige data på tredimensjonale geometri, størrelse og andre Biofysiske egenskaper av ekstracellulære blemmer. Den utviklede protokollen veileder brukerne i å benytte dette analytiske verktøyet og skisserer arbeidsflyten for analyse av EV ' r av AFM, som inkluderer prøve forberedelsene for avbildning av EV ' r i hydrert eller desiccated form, den elektrostatiske immobilisering av blemmer på et substrat, datainnsamling, analyse og tolkning. Representative resultater viser at fiksering av EV ' r på den modifiserte glimmer flaten er forutsigbar, tilpassbar, og tillater brukeren å oppnå størrelses resultater for et stort antall blemmer. Den vesicle dimensjonering basert på AFM data ble funnet å være i samsvar med fryse-TEM Imaging.

Introduction

Ekstracellulære blemmer (EV) er til stede i alle kroppsvæsker, inkludert blod, urin, spytt, melk og fostervann væsken. Exosomes danner en distrikts klasse av EV ' r differensiert fra andre EV ' r av endosomal kognitiv, markører for endosomal Tien, og den minste størrelsen blant alle EV ' r. Størrelsen på exosomes rapporteres ofte med betydelig variasjon mellom studiene. Størrelses resultatene ble funnet å være metode avhengig, noe som reflekterer forskjellen i fysiske prinsipper ansatt av ulike analytiske teknikker for å anslå EV størrelser1,2. Nanopartikkel sporings analyse (NTA), som er den mest brukte størrelses karakterisering teknikken, anslår for eksempel størrelsen på EV ' er som deres hydrodynamisk diameter, som karakteriserer motstanden mot Brownske mobilitet fra EV ' r i løsningen. En større hydrodynamisk diameter på en vesicle innebærer lavere mobilitet i væsken. Det koronale laget rundt blemmer, bestående av overflate proteiner og andre molekyler som er forankret eller adsorberes til membran overflaten, hemmer mobiliteten betydelig og øker hydrodynamisk størrelsen på EV ' r. I relative termer er denne økningen spesielt stor for exosomes3, som illustrert i figur 1.

Den kryogene overførings elektron mikroskopi ("karakteriserer") er en definitiv teknikk i de vesicle størrelsene og morfologi i sine hydrert tilstander. Men den høye kostnaden for instrumentering og den spesialiserte kompetansen som trengs for å bruke den på riktig måte motivere til å utforske alternative teknikker som kan bilde hydrert EV ' r. Et relativt lite antall EV ' r som er observert eller karakterisert ved de oppnådde fryse-TEM-bildene er en annen bemerkelsesverdig ulempe ved denne teknikken.

Atomic Force mikroskopi (AFM) visualiserer den tredimensjonale topografi av hydrert eller desiccated EV4,5,6 ved å skanne en sonde over underlaget til raster bildet av partiklene på overflaten. De grunnleggende trinnene i protokollen for å karakterisere EV ' er av AFM er skissert i denne studien. Før Imaging den blemmer i væske, må de være immobilisert på et substrat ved enten tethering til en funksjonalisert overflate, fangst i et filter, eller ved elektrostatisk tiltrekning7. Den elektrostatiske fiksering på et positivt ladet substrat er et spesielt praktisk alternativ for immobilisering av exosomes kjent for å ha et negativt Zeta-potensiale. Men den samme elektrostatiske krefter som nakkens ekstracellulære blemmer på overflaten også forvrenge sin form, noe som gjør post-Imaging dataanalyse avgjørende. Vi utdype dette punktet ved å beskrive algoritmen som anslår størrelsen på globular blemmer i løsningen basert på AFM data på forvrengt form av exosomes immobilisert på overflaten.

I den utviklede protokollen, er fremgangsmåten for den robuste elektrostatiske immobilisering av blemmer presentert og etterfulgt av trinnene som trengs for å utføre Atomic Force Imaging i hydrert eller desiccated tilstander. Faktorene som påvirker overflate konsentrasjonen av immobilisert blemmer er identifisert. Veiledningen er gitt om hvordan man utfører de elektrostatiske immobilisering for prøver med forskjellige konsentrasjoner av EV ' r i løsningen. Utvalget av eksperimentelle forhold som tillater estimering av empirisk sannsynlighet distribusjoner av ulike Biofysiske egenskaper basert på et tilstrekkelig stort antall immobilisert blemmer diskuteres. Eksempler på post-Imaging analyse av AFM data er gitt. Nærmere bestemt er en algoritme beskrevet for fastsettelse av størrelsen på blemmer i løsningen basert på AFM karakterisering av immobilisert EV ' r. Representanten resultatene viser konsistensen av vesicle dimensjonering av AFM med resultatene av fryse-TEM Imaging.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. isolering av EV-er fra en biofluid

  1. Isoler EV-biler med en av de etablerte metodene, slik som differensial ultracentrifugation8, utfelling eller størrelses ekskludering kromatografi9.
  2. Bekreft tilstedeværelsen av forventet overflate og luminal biomarkører og fraværet av biomarkører indikerer krysskontaminering av preparatet. Bekreft lipid bilayer morfologi av de isolerte partikler av elektron mikroskopi.
    Merk: Når du isolerer exosomes, bør hydrodynamisk størrelsesfordeling målt ved nanopartikkel sporings analyse (NTA) eller dynamisk lysspredning være i det forventede området. Detaljene i EV og exosome isolasjon er utenfor omfanget av denne protokollen. Den valgte metoden vil avhenge av eksperimentelle spørsmål og målet med studien10. Følgende trinn gir en konkret illustrasjon av prosedyren for å berike exosomes av nedbør fra vekstmedium for MCF-7 brystkreftceller ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig utfelling Kit (tabell av materialer).
  3. Før cellekultur ekspansjon, lagre MCF-7 brystkreftceller i flytende nitrogen. Tine celler til under kultur.
  4. Følg aseptisk praksis og utfør celle belegg på 150 mm plater. Bruk vekstmedium sammensatt av Eagle's minimum essensielle medium, 0,01 mg/ml humant rekombinant insulin, og 10% exosome-fri Foster storfe serum.
  5. Aerate kulturen med 95% luft og 5% CO2 og ruge ved 37 °C.
  6. Etter at cellene er avgjort (ca 24 h etter plating), endre Media. Split platen på 1:10 ratio og kultur ti plater, som hver inneholder 20 mL av Media.
  7. Harvest og pool Media fra 9 av disse platene (180 mL) på ~ 70−80% samløpet når cellene er fortsatt i vekstfasen.
  8. Del mediene inn i 60 mL og 120 mL, videre delt inn i 30 mL/rør, og sentrifuger ved 3 000 x g i 15 min.
  9. Overfør supernatanten fra hvert rør til en ny steril 50 mL slange og utfør exosome isolering.
  10. Isoler exosomes etter nedbør i henhold til publiserte protokoller (se for eksempel referanse11), ellerfølg produsentens instruksjonerhvis det brukes et kommersielt isolasjons sett (tabell med materialer). Som et første skritt i sistnevnte tilfelle, sentrifuger celle medium på 3 000 x g for 15 min. trekke supernatanten og forkaste celler og celle rusk.
  11. Tilsett utfelling løsning (1:5 volum ratio) til supernatanten, mix, og kjøleskap over natten.
  12. Sentrifuger ved 1 500 x g i 30 min ved romtemperatur. Kast supernatanten etter sentrifugering.
  13. Spin de resterende exosome pellet for ytterligere 5 min på 1 500 x g. Uten å forstyrre pellet, fjerne den resterende nedbør løsning ved aspirasjon.
  14. Resuspend pellet i 100−500 μL av 1x fosfat-bufret saltvann (PBS) buffer og deler seg i flere alikvoter etter behov for nedstrøms analyse.
  15. Umiddelbart videre til overflaten immobilisering av isolerte exosomes for AFM Imaging. Om nødvendig, fryse alikvoter på-80 °C for senere bruk mens du tar forholdsregler for å unngå skade på prøven under fryse-tine syklus.

2. overflate fiksering av ekstracellulære blemmer

  1. Bruk sterk dobbeltsidig tape, epoxy, eller en alternativ lim til fast feste en glimmer disk til en AFM/skanning Tunneling mikroskop (STM) magnetisk rustfritt stål prøve disk.
  2. Cleave glimmer plate ved hjelp av en skarp barberhøvel eller verktøyet kniv, eller ved å feste en selvklebende tape til toppen overflaten og deretter pealing den av for å fjerne et lag av materiale.
    Merk: enten metoden skal avdekke en jomfru overflate ved å fjerne et tynt lag av glimmer tidligere eksponert for miljøet. Etter inngrepet, må vedlegget av glimmer til AFM/STM metall prøve disken forbli fast.
  3. Ved romtemperatur, behandle den øverste overflaten av glimmer for 10 s med 100 μL av 10 mM NiCl2 -løsning, som endrer overflate ladningen fra negativ til positiv.
  4. Blot NiCl2 løsning med en lofri tørk eller blotting papir. Vask glimmer overflaten 3x med deionisert (DI) vann og tørk den med en strøm av tørr nitrogen.
    Merk: det er lurt å skanne den modifiserte overflaten med AFM for å bekrefte at den er fri for forurensninger.
  5. Plasser AFM prøven disken med vedlagte overflate-modifisert glimmer i en Petri parabolen.
  6. Fortynne exosome prøven fra steg 1,14 med 1x PBS å få en konsentrasjon mellom 4,0 x 109 og 4,0 x 1010 partikler per ml oppløsning. Valider den fortynnede partikkel konsentrasjonen med NTA.
  7. Form en fastsittende dråpe på overflaten av glimmer ved å tømme 100 μL av den fortynnede exosome oppløsningen fra en pipette.
  8. Plasser lokket på Petri fatet og forsegle den med en parafin film for å redusere prøve fordampning. Ruge prøven for 12−18 timer ved 4 °C.
    Merk: overflate tettheten til de immobilisert exosomes vil øke med inkubasjonstid og konsentrasjonen av EV ' r i væsken. Lengre inkubasjonstid kan være nødvendig hvis exosomes er til stede i prøven ved lavere konsentrasjoner.
  9. Etter inkubasjons, aspirer 80−90% av prøven uten å forstyrre overflaten. På dette punktet vil exosomes være elektrostatisk immobilisert på glimmer underlaget.
  10. Skyll overflaten med 1x PBS før bildebehandling hydrert. Gjenta 3x. Pass på å holde prøven hydrert gjennom hele skylle prosessen.
  11. Etter å ha vasket glimmer overflaten med 1x PBS, Fjern 80%−90% av væsken og pipetter ~ 40 μL av FERSK 1x PBS for å dekke prøven.
  12. Skyll underlaget med DI vann når du Imaging desiccated EV ' r. Gjenta 3x.
    Merk: skylling med DI vann vil hindre dannelsen av saltkrystaller og deponering av oppløsninger på overflaten som underlaget tørker.
  13. Før bildebehandling desiccated EV ' r, aspirer du så mye væske som mulig uten å berøre overflaten og tørke resten med en strøm av tørr nitrogen.

3. AFM Imaging

  1. Hvis du vil avbilde desiccated EV ' r, velger du en cantilever som er designet for skanning i luften ved tapping og ikke-kontaktbilde moduser og monterer den på sonde holderen.
    Merk: karakteristikkene av et eksempel cantilever oppført i tabellen av materialer (123 μm lengde, 40 μm bredde, 7 NM spissen radius, og 37 N/m fjær konstant) kan brukes som en guide når du velger en sonde kompatibel med de tilgjengelige AFM instrumentering.
    1. Plasser preparatet fra trinn 2,13 på AFM scenen. Prøven på den magnetiske rustfrie stålplaten vil nakkens prøven på scenen. Tillat tid for utarbeidelse og scenen til likevekt termisk.
    2. Bruk tappe modus for å skanne et tilstrekkelig stort område av glimmer's overflate. For eksempel velge et område på 5 x 5 μm, rastered i 512 linjer med en skannehastighet på ~ 1 Hz. tilegne seg både høyde og fase bilder som de gir utfyllende informasjon om topografi og overflateegenskaper av prøven.
      Merk: skanningen tid vil øke med avbildet området og antall linjer valgt å danne bildet, men reduseres med skanningen hastighet definert som antall linjer skannet per sekund. Raske skannehastigheter kan påvirke bildekvaliteten. Derfor bør hastigheten på Rastering juridisk balansere forholdet mellom anskaffelses tiden og bildekvaliteten.
  2. For å bilde hydrert blemmer, Velg en cantilever som passer for skanning av myke, hydrert prøver og Monter cantilever på en sonde holder designet for skanning i væsker.
    Merk: Når du velger en sonde kompatibel med de tilgjengelige AFM instrumentering, spesifikasjonene til sonden oppført i tabell over materialer (trekantet cantilever med 175 μm nominell lengde, 22 μm bredde, 20 NM spissen radius, 0,07 N/m fjær konstant, og optimalisert for bildebehandling med frekvensomformeren i området mellom 4 og 8 kHz), kan brukes som en veiledning.
    1. Fukt tuppen av cantilever med 1x PBS for å redusere sannsynligheten for å innføre luftbobler i væsken under skanningen.
    2. Plasser preparatet fra trinn 2,11 på AFM scenen. Den magnetiske prøveplaten i rustfritt stål vil nakkens den vedlagte glimmer inneholdende immobilisert EV ' er på overflaten.
    3. Tillat tid for utarbeidelse og AFM scenen til likevekt termisk.
    4. Image den hydrert glimmer overflaten i tappe modus. Skaff deg både høyde-og fase bildene.
      Merk: bildekvaliteten påvirkes av instrumentene, den valgte proben og skanneparametrene. Når du optimaliserer skanne forholdene, kan følgende valg brukes som et utgangspunkt: 5 x 5 μm-området skannet i 512 linjer med ~ 0.8-1,0 Hz skannehastighet og kjøre frekvens mellom 4 til 8 kHz.

4. bildeanalyse

Merk: følgende databehandlings-og analyse trinn brukes på de oppnådde høyde bildene. En lignende prosedyre kan tilpasses for å analysere fase dataene. Beskrivelsen neden er spesifikk å Gwyddion12, en ledig og åpen kildeprogramvare anvendelig under GNU general offentligheten med lisens. Lignende funksjoner er tilgjengelige i alternative programvareverktøy.

  1. Gå til data prosess, spm moduser, tips og velg modell spissen (figur 2). Velg geometrien og dimensjonene til tipset som brukes til å skanne prøven, og klikk OK.
  2. Korriger spissen erosjon artefakter ved å utføre overflaten rekonstruksjon. Åpne bildet. Fra menyen, velg data prosess, spm moduser, tips, velg deretter Surface Rekonstruksjon og klikk OK (Figur 3).
  3. Juster bilde planet slik at det samsvarer med laboratorie-XY-flyet ved å fjerne vinkelen i underlaget fra skanne dataene. Du kan utføre denne oppgaven ved å velge data prosess, nivå og velge plan nivå (Figur 4).
  4. Juster rader i bildet ved å velge data prosess, rette data og deretter velge Juster rader. Flere justeringsalternativer er tilgjengelige (figur 5). Median er for eksempel en algoritme som finner en gjennomsnittshøyde på hver skannings linje og trekker den fra dataene.
  5. Gå til data Process, korrigere data og velg Fjern arr (figur 6), som fjerner vanlige skannefeil kjent som arr.
  6. Juster glimmer overflaten på null høyde, Z = 0, ved å velge flat base in Level drop-down menyen tilgjengelig fra data Process (figur 7).
  7. Identifiser EV ' r på den skannede overflaten ved å bruke Merk etter terskel i rullegardinmenyen korn (figur 8a). Denne algoritmen identifiserer overflate immobilisert exosomes som partikler som stikker ut fra underlaget med null overflate av høyden over den brukerdefinerte terskelen. Velg en terskel i området mellom 1 og 3 NM, noe som vil eliminere det meste av bakgrunns forstyrrelsene. Mindre terskler brukes med renere bakgrunn.
    Merk: terskelen i figur 8a er 1,767 NM. Utfallet av MCF-7 exosome identifikasjon med denne terskelverdi er vist i figur 8B. Gwyddion tilbyr flere alternativer til terskelverdi som algoritme for å automatisk identifisere blemmer i bildet, inkludert automatiserte terskelverdi (Otsu metode), kantdeteksjon, og nedslagsfeltet algoritmen.
    Merk: partikkel-agglomerater, hvis det finnes i AFM-bildet, kan være maskert og ekskludert fra analysen.
  8. Utføre geometriske og dimensjonale karakterisering av identifiserte EV ' er ved hjelp av tilgjengelige distribusjoner algoritmer tilgjengelig fra korn -menyen.
    Merk: Gwyddion gir verktøy for å vurdere fordelingen av skalerbare verdier, areal, volum og andre egenskaper ved immobilisert EV ' r i en hydrert eller desiccated tilstand. Et eksempel på en egenskap med skalerbare verdier vises i figur 9, som gir fordelingen av høyeste høyder innenfor fotavtrykket til hver identifiserte exosome.
  9. Eksporter AFM data fra Gwyddion for spesialisert analyse av andre beregningsorientert verktøy og tilpassede dataprogrammer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Overflate fiksering av EV ' r er et kritisk trinn i bildesekvensen. Elektrostatisk overflate immobilisering av exosomes, kjent for å ha en negativ Zeta potensial, vil robust skje etter at glimmer ' s substrat er modifisert til å ha en positiv overflate ladning. Uten behandling med NiCl2 for å formidle positive overflate endringer, ble immobilisering av EV ' r på underlaget funnet å være ineffektiv. Høyde bildet i figur 10a, ervervet i luften etter MCF-7 exosome prøven inneholder 2,59 x 1010 blemmer per ml PBS var inkubert for 12 h på uendret overflaten av fersk kløyvde glimmer, viser svært få blemmer igjen på overflaten etter at den ble rengjort med DI vann. Den blemmer synlig i figur 10a er, mest sannsynlig, resultatet av ufullstendig ASPIRASJON av di vann, som resuspendert blemmer ikke festet til overflaten og deretter avsatt dem på underlaget som det fordampet.

Etter endring av overflate ladning med nikkel klorid, er det tilrådelig å bekrefte at overflaten er fri for forurensninger etter behandlingen. Høyde bildet i figur 10b (innhentet i luften) gir et eksempel på en ren overflate etter at den ble behandlet med NiCl2 og deretter VASKET tre ganger med di vann. Den grovhet av derivatized overflate var under 0,3 NM, som er forenlig med forrige rapport13.

Den dramatiske positive virkningen av overflaten lade modifikasjon på effektiviteten av fiksering av MCF-7 exosomes er illustrert av figur 10c,D. Disse to panelene viser høyde skanninger ervervet i luften etter prøven, tidligere avbildet i figur 10a, ble inkubert for 24 h og 12 h, henholdsvis på overflaten behandlet med nikkel klorid.

Tiden en gitt prøve inkubert på den behandlede overflaten bestemmer overflate konsentrasjonen (blemmer per område) av immobilisert EV ' r. Høyde bildet i figur 10c illustrerer tilfelle av svært tett overflate dekning av nakkens blemmer oppnådd etter at beskrevet MCF-7 exosome prøven var inkubert for 24 h. En rekke algoritmer stole på å ha tilstrekkelig ledig substrat mellom korn til å utføre bilde korreksjon og dataanalyse. For eksempel, utjevning og skiftende underlaget til null flyet, linje korreksjon, og estimering av korn ' volum trenger den mellomliggende flat overflate for å utføre nøyaktige beregninger. Når konsentrasjonen av immobilisert blemmer er så høyt som i figur 10c, vil disse algoritmene ikke fungere pålitelig. Et eksempel på en tilstrekkelig overflate konsentrasjon av blemmer immobilisert fra samme MCF-7 prøven er vist i høyden bildet i figur 10D, som ble oppnådd etter kortere (12 h) inkubasjons.
 
Post-prosessering av ervervet rå AFM data er nødvendig for å korrigere for vanlige skanning feil. Følgende beskrivelse er spesifikk for Gwyddion. Lignende funksjonalitet er tilgjengelig i andre AFM/SPM dataanalyseverktøy.

Innenfor Gwyddion brukes Plane Level -funksjonen til å korrigere for en vippe i underlaget. Slik bakgrunn korreksjon oppnås ved først å finne flyet av underlaget ved hjelp av alle datapunkter i bildet og deretter trekke den fra rådata. Korreksjonen langs skanne linjene oppnås ved å justere rader -funksjonen. En av de implementerte algoritmene utfører for eksempel justeringen ved å beregne median høyden på hver skanne linje og deretter trekke resultatet fra den tilsvarende raden med bildedata. Bidraget av de lokale feil i feedback loop kan fjernes ved å bruke Fjern arr funksjon, som fyller hullene i de justerte data og eliminerer arr ved å sammenligne dataene i tilstøtende skannelinjer. Skiftet av underlaget til høyden Z = 0 kan oppnås ved en kombinasjon av en fasett og polynom utjevning av overflaten etter maskering korn og andre funksjoner. Gwyddion ' s flat basis verktøy utfører denne oppgaven selvstendig eller med en brukerdefinert maske. Etter den beskrevne bakgrunn og linje rettelser, kan elektrostatisk fiksert blemmer identifiseres på underlaget ved å utføre Merk korn funksjon.

Figur 11a og figur 11b viser høyde og fase bilder av hydrert MCF-7 exosomes immobilisert på en glimmer overflate og ervervet i PBS bruker tappe modus. Totalt 561 hydrert blemmer ble identifisert i det skannede området ved hjelp av terskel algoritme av Merk korn funksjon med terskelverdien satt til ~ 20%. Fase forsinkelsen av sonden respons på stasjonen frekvens er følsom for lokaliserte stivhet variasjoner i myke prøver. Konsistensen mellom høyde og fase bilder, sett i figur 11a,B, er derfor en viktig bekreftelse på at avbildet korn er, ja, myke blemmer immobilisert på underlaget.
 
Figur 11C viser tverrsnitt av høyde bildet gjennom exosomes plassert på den hvite linjen i figur 11a. Mens exosomes i en biofluid har en globular geometri1,14,15,16, deres form på underlaget er alvorlig forvrengt av elektrostatisk tiltrekning til positivt ladet Overflaten. Den Oblate pannekake-lignende geometri elektrostatisk immobilisert blemmer er videre illustrert i figur 11D av nærbilde høyde bilde (og tverrsnitt) av en exosome eske i figur 11a. Det tilsvarende fase bildet vises i figur 11e. Den empiriske sannsynlighet tetthet funksjon (PDF) av topp høyder over overflaten for alle 561 hydrert blemmer identifisert i AFM skanningen er vist i figur 12a. Middelverdien for denne fordelingen er 7,9 NM, som er omtrent lik to ganger tykkelsen av en fosfolipid bilayer17 i fravær av deformeres krefter.
 
Området på underlaget okkupert av en immobilisert exosome ble rundet som en sirkel med diameter lik gjennomsnittlig avstand fra vesicle ' s "sentrum av massen" til sin grense på glimmer overflate. Fordelingen av disse projeksjons diametre er vist i figur 12a og har gjennomsnittet lik 69,6 NM. Den oppnådde høyde og diameter distribusjoner ytterligere kvantifisere den betydelige virkningen av elektrostatisk overflate immobilisering på forvrengt form av immobilisert exosomes.
 
Robusthet og repeterbarhet av protokoll prosedyrene ble bekreftet ved å reanalysering det samme MCF-7-prøven tre ganger, fra prøveklargjøring til bildebehandling, med hver gjentakelse som resulterer i statistisk likhet med de som ble vist i Figur 12.

Deformasjon av immobilisert blemmer forårsaket av elektrostatiske krefter kan kompenseres eller tolkes for å gi et innblikk i egenskapene til avbildet EV ' er. For eksempel kan AFM data brukes til å anslå den globular størrelsen på blemmer i løsningen. Som et utgangspunkt, kan vi beregne volumet innkapslet av membranen konvolutter av immobilisert blemmer. Volumet er funnet ved å integrere forskjellen mellom overflaten nivå av identifiserte blemmer og underlaget høyde under dem. Underlaget nivå under blemmer er ikke direkte tilgjengelig, men kan anslås av Laplace eller alternativ interpolering av datapunkter for ledige substrat rundt blemmer. Innenfor Gwyddion utføres en slik volum beregning ved hjelp av distribusjon av funksjonen ulike korn egenskaper . Resultatet som eksporteres fra Gwyddion kan deretter tilordnes til diameteren av volum ekvivalente kuler.

Anvendelsen av den beskrevne algoritmen til AFM data for 561 analysert hydrert MCF-7 blemmer produsert fordelingen av diametre av volum-ekvivalent kuler vist i figur 12b. Denne fordelingen anslår størrelsen på membran blemmer i medfødt globular form i en biofluid før deres elektrostatisk fiksering på glimmer overflaten. Den vesicle dimensjonering innhentet fra analysen av AFM data ble sammenlignet med resultatene av fryse-TEM Imaging av samme utvalg og ble funnet å være i tett enighet3 (figur 12b). Sammenligningen av hydrodynamisk diametere målt ved NTA med de oppnådde vesicle størrelsene (figur 1) indikerer at mobiliteten av exosomes er mye mindre enn forventet fra størrelsen på deres blemmer BESTEMMES fra AFM og fryse-tem Målinger. Forskjellen mellom hydrodynamisk og vesicle størrelser karakteriserer tykkelsen av koronale lag rundt exosomal blemmer.

Figure 1
Figur 1: sammenligning av hydrodynamisk og geometriske diametre på EV ' r. Den geometriske størrelsen på exosomal vesicle er vesentlig mindre enn sin hydrodynamisk størrelse bestemmes fra sin diffusjon i en væske. Forskjellen er det koronale laget som er formet av membran-bøyd og adsorberes molekyler som hindrer mobiliteten til EV ' r. Dette tallet er modifisert fra referanse3 og gjengitt med tillatelse.

Figure 2
Figur 2: egenskaper av AFM sonde. Geometrien og dimensjonene av AFM sonden kan spesifiseres ved hjelp av modell tips funksjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: korreksjon av bildebehandling gjenstand forårsaket av spissen-sample convolution. Ved å utføre Surface Rekonstruksjon, kan ervervet AFM data rettes for spissen gjenstander.  Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: korreksjon for en vippe i underlaget. Plane Level bestemmer planet av underlaget og trekker den fra AFM data. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: korrigering av avvik i skanne rader. En konvensjonell algoritme for å justere skanne dataene er å finne en gjennomsnittlig høyde langs hver skanne linje og trekker resultatet fra den tilsvarende raden med datapunkter i bildet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: rettelse av hullene i de justerte dataene. Vanlige skannefeil, kjent som arr, kan fjernes fra AFM data ved å bruke Fjern arr funksjon.  Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: justering av et substrat ved null høyde. Flat base alternativet i Level-menyen kan brukeren plassere underlaget overflaten på basisnivå som tilsvarer null høyde.  Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: identifisering av immobilisert blemmer på skannet overflate. (A) overflate-immobilisert exosomes identifiseres som korn stikker over underlaget av en bruker-valgt høyde terskel angitt i Merk av terskel. (B) utfallet av identifikasjonen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9: analyse av AFM data. Fordelingen av høyeste høyder over underlaget innenfor området okkupert av identifiserte exosomes vises som kompilert av korn distribusjoner verktøyet.  Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 10
Figur 10: virkningen av overflaten modifikasjon og EV konsentrasjon av overflate tettheten av immobilisert blemmer. (A) AFM høyde bilde av fersk kløyvde glimmer substrat etter 12 h INKUBASJONS med MCF-7 exosome prøve etterfulgt av rengjøring med di vann og tørking. Immobilisering av EV ' r fra væsken til underlaget er ineffektiv uten å formidle en positiv ladning til glimmer ' s overflate. Få partikler sett i skanningen er trolig et resultat av ufullstendig fjerning av MCF-7 prøven før underlaget ble tørket. (B) høyden skanning av glimmer overflate i luften etter behandling med nikkel klorid viser underlaget fri for forurensninger. Paneler (C) og (D) viser AFM høyde skanninger innhentet etter endring av overflate ladning og inkubasjons med samme MCF-7 sample som i panel (A) for 24 h og 12 h, henholdsvis. Overflate konsentrasjonen av immobilisert blemmer er overdrevet tett etter 24 h inkubasjons. 12 h-inkubasjons fører til færre exosomes immobilisert på overflaten og skanne data som er enklere å analysere nøyaktig.  Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 11
Figur 11: AFM bilder av HYDRERT MCF-7 exosomes elektrostatisk immobilisert på den modifiserte glimmer overflaten. (A) høyde bildet. (B) tilsvarende AFM fase bildet bekrefter at korn i høyden bildet er myke nanopartikler, som bør forventes for membran blemmer. (C) høyde data for de tre blemmer krysset av linjen som vises i panel (A) illustrerer en flat form forårsaket av elektrostatisk tiltrekning av exosomes til positivt ladet overflaten av modifisert glimmer. (D) formen forvrengning er tydelig i en forstørret visning immobilisert vesicle eske i panel (A) og dens tverrsnitt. Fase bildet av samme vesicle vises i (E). Dette tallet er modifisert fra referanse3 og gjengitt med tillatelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 12
Figur 12: dimensjonal karakterisering av hydrert blemmer immobilisert på overflaten og estimering av deres globular størrelse i løsningen. (A) fordelingen av topp høyder over overflaten (rød kurve) har gjennomsnittet lik 7,9 NM. Området okkupert av immobilisert exosomes har 69,6 NM gjennomsnittlig diameter (blå kurve). (B) AFM høyde bilde for en av de immobilisert exosomes illustrerer dens svært Oblate form forårsaket av elektrostatiske krefter. Den globular størrelsen på exosomal blemmer i løsningen kan anslås ved å matche volumer omsluttet av overflate-immobilisert og sfærisk membran konvolutter. (C) størrelsesfordelingen av globular blemmer i løsningen (rød kurve) ble bestemt fra AFM data 561 immobilisert blemmer. Den vesicle størrelser i fryse-TEM bilder (blå kurve) er i samsvar med AFM resultater. Dette tallet er modifisert fra referanse3 og gjengitt med tillatelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 13
Figur 13: overflate konsentrasjon og størrelse segregering gjenstander under passiv deponering av EV ' r fra fordamper væske. (A) skanning elektron MIKROSKOPI (SEM) bildet viser at overflaten konsentrasjonen av exosomes passivt avsatt fra en tørking væske er romlig variabel når overflaten immobilisering fra en suspendere biofluid ikke er utført. (B) passiv deponering av EV ' r fra et tørke prøve forårsaker blemmer størrelse segregering. Den betydelige størrelses variasjonen er kvantifisert av sannsynligheten tetthet funksjoner (PDF) for blemmer i ulike regioner i bildet (A) definert av hvite diagonale linjer. Dette tallet er endret fra referanse1 og gjengitt med tillatelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 14
Figur 14: Cup-formet geometri av desiccated blemmer passivt avsatt på overflaten under væsken fordampning. Overflate uttørking av blemmer som ikke immobilisert av elektrostatiske krefter, er kjent for å resultere i en kopp-formet utseende ofte observert i SEM-bilder av EV-biler. Dette tallet er endret fra referanse1 og gjengitt med tillatelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Immobilisering av EV ' r fra en biologisk væske, overflateskanning, og bildeanalyse er de viktigste trinnene i den utviklede protokollen for AFM karakterisering av EV ' r i væske. Antall blemmer mottagelig for AFM Imaging skalaer med avbildet areal og overflate konsentrasjonen av blemmer immobilisert på underlaget. Med et negativt Zeta-potensiale for EV ' a og exosomes18, oppfordrer vi elektrostatisk fiksering av EV ' r fra væskeprøver til AFM-underlaget. Immobilisering er effektiv når overflaten er positivt ladet. Før EV immobilisering, kan den positive overflaten lade må formidles til underlaget, som i tilfelle av glimmer-en lagdelt silikat mineral med generell formel KAl2(AlSi3O10) (Oh)2. Fersk kløyvde glimmer overflate er nær helt flatt, noe som er ideelt for Imaging nanopartikler av AFM, men overflaten ladningen er negativ og dermed må endres. Protokollen beskriver prosedyren for å formidle en positiv overflate endring til AFM underlaget. De representative resultatene viser markant forbedring av EV-fiksering fra en biofluid til det modifiserte glimmer underlaget.
 
Når bildebehandling hydrert blemmer, er det viktig å minimere prøve fordampning som forårsaker overflaten deponering gjenstander og konvektive renn og øker den flytende konsentrasjonen av blemmer med tiden, noe som fører til høyere overflate konsentrasjon av immobilisert EV ' er enn forventet, spesielt ved langvarig incubations. Sonde-holdere som er eksplisitt utformet for væskeprøver, eliminerer eller reduserer fordamping og bør brukes til å avbilde hydrert EV-er. Uspesifisert bindinger til skanning sonden er redusert i nærvær av ioniske arter. Derfor, ved bildebehandling hydrert, er det best å dekke underlaget med et bufret medium, for eksempel PBS, i stedet for DI vann.

Viktigheten av overflate immobilisering
Den konsekvente og forutsigbare immobilisering til EV ' r på det modifiserte underlaget fjerner den primære kilden til variasjon i AFM-resultatene. Alle nedstrøms trinn, fra skanning til dataanalyse, er lettere kontrolleres ved valg av instrumentering, sonder, skanning parametere, og dataanalyse sekvens og algoritmer. Brukeren bør være oppmerksom på oppstrøms variasjon i biologiske prøver og EV-isolasjons protokoller, som er viktige problemer utenfor omfanget av dette arbeidet.

Vi anbefaler å utføre overflate immobilisering av EV på modifisert glimmer overflate fra flytende prøver selv når målet er å karakterisere desiccated blemmer i luften-behovet er mindre tydelig siden blemmer vil uunngåelig innskudd på ethvert substrat som væsken fordamper. Faktisk, AFM resultater for desiccated EV innhentet uten å endre Mica overflate kostnader, som er et nødvendig skritt for elektrostatisk immobilisering av EV ' r fra en væske, har blitt rapportert i de siste19,20,21 . Når EV ' er ikke er festet til overflaten fra væsken prøven, men deres passiv deponering av fordampning vil produsere gjenstander kollektivt kjent som en kaffe ring effekt22. To slike gjenstander, som forekommer som en tørking flytende forsvinner, er illustrert i SEM-bildet (figur 13a) av serum exosomes deponert ved fordampning på en negativt ladet glassoverflaten. Betydelige variasjoner i overflate konsentrasjonen av utløst blemmer er umiddelbart åpenbare. Den andre gjenstand, kvantifisert i figur 13b, er betydelig variasjon i vesicle størrelser i ulike områder innenfor omkretsen av tørket prøven. Gitt disse gjenstandene, kan AFM karakterisering av passivt avsatt blemmer fra en tørking væske produsere partisk eller inkonsekvent resultater med mindre hele arealet i utgangspunktet okkupert av en nå tørket flytende prøven skannes.

To ytterligere spørsmål bør vurderes når Imaging den desiccated prøvene innhentet uten fast immobilisering av blemmer på underlaget. Recall at vår protokoll instruerer brukerne til å grundig vaske overflaten med DI vann etter blemmer er immobilisert fra en flytende prøve. Dette trinnet har til hensikt å hindre ioniske og andre ikke-flytande oppløsninger fra forming overflaten innskudd under fordampning av komplekse biofluids med betydelig OSMOLARITETSSYSTEM. Hvis EV ' r ikke er fast, vil grundig vasking løsne et stort antall blemmer fra overflaten, potensielt avvik resultatene og la for få partikler til analyse. En annen vanlig vanskelighetsgrad, redusert med immobilizing EV ' er på modifisert glimmer overflate før AFM Imaging, er vedheft av partikler til sonden23 og villedende gjenstander forårsaket av dette fenomenet.
 
Kontroll av overflate tettheten til immobilisert EV ' r
De to lett kontrollerbar faktorene identifisert i protokollen tillater brukeren å tilpasse overflate konsentrasjonen av immobilisert EV ' r på modifisert glimmer substrat: konsentrasjonen av blemmer i væsken prøven og tiden prøven er inkubert på underlaget. En høy tetthet av immobilisert blemmer, oppnås med lengre inkubasjons ganger og høyere konsentrasjon av EV ' r i væsken, øker antall blemmer analysert under skanning og den statistiske kraften av konklusjoner ankom ved analyse av AFM Data. Samtidig, en overdrevent tett overflate konsentrasjon, som i tilfellet vist i figur 10c der partikler tett dekke hele overflaten uten mellomliggende områder av underlaget, kompliserer bildeanalyse og tolkning av resultatene og kan føre til skanning gjenstander forårsaket av samspillet mellom tett linjeavstand partikler.

Påvirkning av elektrostatisk screening og hydrodynamisk mobilitet for EV ' r
Den gjennomsiktige kontrollen over overflate konsentrasjonen av immobilisert EV ' r som en funksjon av faktorer som påvirker det tillater en bruker å tilpasse eksperimentelle forhold for å møte de spesifikke behovene til en studie. Når du utfører tilpasning, er det viktig å erkjenne at den elektrostatiske overflaten immobilisering er en transport-begrenset prosess påvirket av ioniske styrken av biofluid.

Konsentrasjonen av ioniske og positivt ladet arter omvendt påvirker Debye lengde over hvilke overflaten og vesicle kostnader er vist. Utover denne lengden, de elektrostatiske kreftene er ubetydelige. Grense laget av underlaget er elektrostatisk tiltrekning vil være mye mindre i ionically PBS enn i DI vann. Denne forskjellen innebærer at etter en kort inkubasjons som tilsvarer den tiden som er nødvendig for å tømme lag av væske der de elektrostatiske attraksjonene er filt, vil en overflate tetthet av EV ' immobilisert fra suspensjonen i DI vann være høyere enn fra PBS suspensjon, forutsatt at konsentrasjonen av EV ' r er den samme i begge væsker. Sett annerledes, må mer blemmer være immobilisert å tømme en tykkere attraksjon lag i DI vann enn i PBS under ellers identiske forhold.

Etter at blemmer er utarmet fra grensen laget, blir immobilisering en helt transport-begrenset prosess. I dette regimet, vil frekvensen av deponering ikke avhenge av suspendere medium (f. eks DI vann eller PBS) så lenge viskositet er den samme og transporten er helt diffusive. Imidlertid kan transport av blemmer inn i attraksjonen grensen laget ikke være helt diffusive. For eksempel, hvis prøven i en fastsittende dråpe på AFM underlaget delvis fordamper under inkubasjons, væsken inne i drop vil bli utsatt for fordampning-drevet flyt, og transport av blemmer mot underlaget vil ha, begge deler, diffusive og konvektive bidrag. Når fordampning ikke er tilstrekkelig kontrollert, vil bidraget fra en konvektive transport være betydelig, og frekvensen av immobilisering vil være høyere enn forventet. Virkningen av konvektive transport vil endres med tykkelsen av attraksjonen laget, som i seg selv avhenger av ioniske innholdet i væsken. Videre vil fordampning forsterke vesicle immobilisering på underlaget ved å konsentrere EV ' r i løsningen. Ved høyere EV konsentrasjoner, konsentrasjonen gradient mellom attraksjonen laget og tilstøtende væsken vil øke, og skaper en større termodynamisk drivkraft til migrasjon av blemmer mot underlaget.

Immobilisert blemmer kan representere en flytende prøve med en skjevhet. For tilfellet når frekvensen av immobilisering er begrenset av diffusjon, blemmer med mindre hydrodynamisk størrelser, bestemmes av kombinasjonen av vesicle størrelse og tykkelsen på koronale lag rundt det (figur 1), er mer sannsynlig å gå inn i attraksjon laget på grunn av deres høyere mobilitet. Etter den første perioden vil hydrodynamically små EV ' r bli overrepresentert på underlaget i forhold til deres bidrag til EV-populasjonen i væske prøven. Legg merke til at en mindre hydrodynamisk størrelse ikke automatisk peker på EV ' r med mindre vesicle størrelser på grunn av heterogenitet i tykkelsen på det koronale lag3. Den partisk representasjonen unngås med lang incubations som bryter ut hele populasjonen av EV ' r i væsken ved dens immobilisering på underlaget. Når en bruker tar sikte på å immobilizing alle EV ' r fra biofluid, for å unngå overdrevent tett dekning av overflaten med immobilisert blemmer, kan det være nødvendig å redusere EV-konsentrasjonen i væsken under området som foreslås i protokollen.

Deformasjon av EV ' r på underlaget
Ekstracellulære blemmer i sitt eget hydrert tilstand og etter uttørking kan karakteriseres av AFM, som beskrevet i protokollen. De elektrostatiske kreftene24 som nakkens EV ' er på Mica overflaten forvrenger også formen fra globular geometri der de finnes i løsningen. Virkningen av uttørking på størrelse og morfologi av immobilisert EV ' r kan analyseres ved å skanne det samme overflateområdet før og etter prøven er tillatt å tørke.

Det er lærerikt å undersøke virkningen av prøve forberedelsene på formen av desiccated EV ' r. De elektrostatisk immobilisert EV ' r opprettholder den svært Oblate geometrien etter tørking, men blir ytterligere slått sammen av uttørking. Høyden over overflaten av desiccated blemmer blir mindre enn i figur 12a, mens deres fotavtrykk området øker (data ikke vises). På den annen side, når blemmer er avsatt passivt under væsken fordampning og uten tidligere immobilisering på overflaten, har de en tendens til å oppnå en kopp-form geometri upon uttørking, som lenge har vært observert i SEM bilder og, mer nylig, i AFM Skanner. Denne cupped formen er nå anerkjent som en prøveforberedelse gjenstand25 forårsaket av ikke-ensartethet i kapillær krefter under overflaten uttørking, som mechanistically forklart i figur 141.
 
Image analyse og tolkning av AFM data
Responsen på elektrostatiske og kapillær krefter som opptrer for å forvrenge formen på EV ' r gir verdifull informasjon om strukturelle og egenskapene til EV ' r. For eksempel, et flerdimensjonalt sett av Biofysiske egenskaper, for eksempel den deformert størrelse og form Hentet fra AFM data, ble nylig brukt til å demonstrere muligheten til å skille mellom exosomes skilles ut av forskjellige vert celler5. Skjevheter kan også tas hensyn til og kompensert. For eksempel viste vi hvordan du bruker AFM data for å karakterisere den globular størrelsen på blemmer i løsningen ved å estimere diameteren av kuler som kapsler inn samme volum som immobilisert exososmes3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne erkjenner økonomisk støtte fra National Science Foundation (pris nummer IGERT-0903715), University of Utah (Department of Chemical Engineering Seed Grant og graduate Research Fellowship Award), og Skolkovo Institute of Science og teknologi (Skoltech Fellowship).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM/STM Controller  Bruker Multimode Nanoscope V This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air. 
AFM/STM metal specimen discs (10 mm) TedPella 16207 Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means.
AFM/STM Mica discs (10 mm) TedPella 50 Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters
AFM probe for imaging in the air Bruker TESP-V2 High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air.
AFM probe for soft sample imaging in liquid Bruker MLCT Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation.  The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy.
Double sided tape Spectrum 360-77705 Used to fix the mica disk on the metal specimen disc.
ExoQuick-TC System Biosciences EXOTC50A-1 ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media. 
Glass probe AFM holder for imaging in liquid Bruker  MTFML-V2 This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM.  The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation.  The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation.  The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids.
Gwyddion Czech Metrology Institute. Version 2.52 Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques.
Lint-free blotting paper GE Healthcare Whatman  Grade GB003 Blotting Paper Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate.  
Lint-free cleanroom wipes Texwipe AlphaWipe TX1004 Use these polyester wipes for surface cleaning. 
Nickel(II) chloride (NiCl2) Sigma-Aldrich 339350 Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water
Phosphate Buffered Saline (1x) Gibco 10010023 PBS, pH 7.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chernyshev, V. S., et al. Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).
  2. Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 881-906 (2018).
  3. Skliar, M., et al. Membrane proteins significantly restrict exosome mobility. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).
  4. Parisse, P., et al. Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles. European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).
  5. Ito, K., et al. Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning. Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).
  6. Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles. Nanotechnology. 29, 132001 (2018).
  7. Meyer, R. L. Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions. Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).
  8. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).
  9. Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).
  10. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750 (2019).
  11. Weng, Y., et al. Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling. The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).
  12. Nečas, D., Klapetek, P. Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis. Open Physics. 10, 181-188 (2012).
  13. Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling. ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).
  14. Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).
  15. Zhou, Y., et al. Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4, 34 (2013).
  16. Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features. FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).
  17. Briegel, A., et al. Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).
  18. Akagi, T., et al. On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells. PLOS ONE. 10, e0123603 (2015).
  19. Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).
  20. Radeghieri, A., et al. Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).
  21. Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes. Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11 (2016).
  22. Deegan, R. D., et al. Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops. Nature. 389, 827-829 (1997).
  23. Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy. Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).
  24. Pastré, D., et al. Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study. Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).
  25. van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).

Tags

Biokjemi Atomic Force mikroskopi exosomes og ekstracellulære blemmer overflate immobilisering dimensjonal karakterisering morfologiske karakterisering Biofysiske karakterisering størrelse på membran blemmer hydrert og desiccated prøver bildeanalyse
Imaging av ekstracellulære blemmer av Atomic Force mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Skliar, M., Chernyshev, V. S.… More

Skliar, M., Chernyshev, V. S. Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (151), e59254, doi:10.3791/59254 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter