Summary
تشكيل السفينة دماء جديدة وتعصيب متعاطفة مع لعب دور محوري في الأنسجة الدهنية ليعيد البناء. ومع ذلك، لا تزال هناك مسائل تقنية في تصور وقياس كمية الأنسجة الدهنية. نقدم هنا بروتوكولا للتسمية بنجاح والكمية مقارنة كثافة الأوعية الدموية والألياف العصبية في مختلف الأنسجة الدهنية.
Abstract
الدراسات التي أجريت مؤخرا قد أبرزت الدور الحاسم للأوعية وتعصيب متعاطفة في الأنسجة الدهنية ليعيد البناء أثناء تطوير السمنة. ولذلك فمن الضروري وضع طريقة سهلة وفعالة لتوثيق التغيرات الدينامية في الأنسجة الدهنية. هنا، نحن تصف نهجاً إيمونوفلوريسسينت تعديل كفاءة المشترك البقع الأوعية الدموية والألياف العصبية في الأنسجة الدهنية. مقارنة بالأساليب التقليدية ووضعت مؤخرا، نهجنا سهلة نسبيا لمتابعة وأكثر كفاءة في وسم الأوعية الدموية والألياف العصبية ذات الكثافة أعلى وأقل الخلفية. وعلاوة على ذلك، دقة أعلى للصور كذلك يسمح لنا بدقة قياس منطقة السفن، ومقدار المتفرعة، وطول الألياف ببرمجيات المصدر المفتوح. وكدليل على استخدام أسلوب لدينا، نحن إظهار تلك الأنسجة الدهنية براون (BAT) يحتوي على كميات أعلى من الأوعية الدموية والألياف العصبية مقارنة بالانسجة الدهنية البيضاء (وات). كذلك تجد أن وات تحت الجلد (سوات) قد بين حدى، المزيد من الأوعية الدموية والألياف العصبية مقارنة بوات البربخيه (أوت). لدينا أسلوب مما يوفر أداة مفيدة للتحقيق في الأنسجة الدهنية ليعيد البناء.
Introduction
الأنسجة الدهنية مفتاح الأيضية ووظائف الغدد الصماء1. أنه يوسع بشكل حيوي أو ينكمش استجابة لمختلف المواد الغذائية تؤكد2. الأنسجة النشطة إعادة عرض عملية تتكون من خطوات مسارات الفيزيولوجية متعددة بما في ذلك الأوعية والتليف وتشكيل ميكرونفيرونمينتس التهاب المحلية2،،من34. قد تؤدي بعض المحفزات المادية، مثل التعرض للبرد وممارسة، تتعاطف مع التنشيط، الأمر الذي يؤدي في نهاية المطاف إلى تشكيل السفينة دماء جديدة وتعصيب متعاطفة في الأنسجة الدهنية5،6. ترتبط هذه العمليات إعادة عرض محكم بالنتائج الاستقلابية الجهازية تشمل حساسية الأنسولين، السمة المميزة للنوع 2 من داء السكري2. وهكذا تصور هذه التغيرات الباثولوجية مهم جداً لفهم الوضع الصحي لكل الأنسجة الدهنية.
تولد الأوعية هو عملية تشكيل السفينة دماء جديدة. منذ الأوعية الدموية توفير الأوكسجين والمغذيات والهرمونات وعوامل النمو للأنسجة، تولد الأوعية اعتبرت خطوة رئيسية في الأنسجة الدهنية ليعيد البناء، الذي تم توثيقه مع تقنيات مختلفة6،7، 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13-ومع ذلك، لا تزال هناك أسئلة حول دقة الصور، وكفاءة إيمونوستينينج، وأساليب القياس الكمي لكثافة السفينة. بالمقارنة مع تشكيل السفينة دماء جديدة، تم التقليل تعصيب في الأنسجة الدهنية لفترة طويلة. ومؤخرا، تسنغ et al. 14 استخدام متقدمة إينترافيتال اثنين-فوتون مجهرية وأثبتت أن adipocytes تكون محاطة بطبقات من الألياف العصبية14. ومنذ ذلك الحين، بدأ الباحثون نقدر الدور المحوري تعصيب متعاطفة في التنظيم لفسيولوجيا الأنسجة الدهنية. وبالتالي، من المهم وضع نهج عملية وسهلة تعصيب العصب الدهنية الوثيقة.
هنا، لدينا تقرير أسلوب أمثل لتلطيخ المشترك من الأوعية الدموية والألياف العصبية استناداً إلى أن البروتوكولات السابقة. بهذه الطريقة، يمكننا أن نحقق صور واضحة للأوعية الدموية والألياف العصبية دون ضجيج الخلفية. وعلاوة على ذلك، نحصل على قرار عالية بما يكفي لإجراء قياس كمي للكثافات مع برمجيات المصدر المفتوح. باستخدام هذا النهج الجديد، يمكننا بنجاح مقارنة بالهياكل وكثافة الأوعية الدموية والألياف العصبية في مختلف المستودعات الدهنية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الإجراءات التي تتضمن مواضيع الحيوان عليها من مركز علوم الصحة "الحيوانية رعاية اللجنة من جامعة تكساس" في هيوستن (رقم بروتوكول الحيوان: الائتلاف المناهض للحرب-18-0057).
1-كاشف إعداد
- 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS، درجة الحموضة 7.4): جعل ل 1 لبرنامج تلفزيوني 1 x، حل ز 0.2 من بوكل وز 1.44 غ2هبو4، 8 غرام من كلوريد الصوديوم و 0.24 ز خ2ص4 في 800 مل ماء المقطر. ضبط درجة الحموضة 7.4 وملء مع الماء المقطر لتحقيق وحدة تخزين نهائي للأم 1
- بارافورمالدهيد 1% في برنامج تلفزيوني 1 x (1% منهاج عمل بيجين، wt/المجلد): إضافة إلى تحقيق وحدة تخزين نهائي من 50 مل، مل 3.125% 16 منهاج عمل بيجين (انظر الجدول للمواد) لمل 46.875 لبرنامج تلفزيوني 1 x. يخلط جيدا وتخزينها في 4 درجات مئوية لاستخدامها في وقت لاحق.
تنبيه: بارافورمالدهيد السامة. ينبغي أن تنفذ جميع الإجراءات تحت غطاء دخان لتجنب استنشاق والجلد الاتصال. - بولي سوربات 0.1% 20 (انظر الجدول للمواد) في برنامج تلفزيوني 1 x (1 × ببست، ودرجة الحموضة 7.4، المجلد/المجلد): إضافة إلى تحقيق وحدة تخزين نهائي من 50 مل، 0.05 مل من بولي سوربات مل 20 إلى 49، 95 من برنامج تلفزيوني 1 x. دوامة ومخزن عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
- أوكتوكسينول 1%-9 (انظر الجدول للمواد) في برنامج تلفزيوني 1 x (1 × برنامج تلفزيوني-تكساس، ودرجة الحموضة 7.4، المجلد/المجلد): لتحقيق وحدة تخزين نهائي من 10 مل، إضافة 0.1 مل من أوكتوكسينول-9 إلى 9.9 مل من س 1 برنامج تلفزيوني. دوامة ومخزن عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
- أزيد الصوديوم 2% (wt/المجلد): إضافة لإنتاج 10 مل أزيد الصوديوم 2%، 0.2 جم أزيد الصوديوم إلى 10 مل من 1 x برنامج تلفزيوني. يخلط جيدا وتخزينها في 4 درجات مئوية لاستخدامها في وقت لاحق.
- والغليسيرول 90% في برنامج تلفزيوني 1 x (المجلد/المجلد): لتحقيق وحدة تخزين نهائي من 10 مل، إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني 1 x إلى 9 مل الجلسرين. دوامة وتخزين في درجة حرارة الغرفة (RT) لاستخدامها في وقت لاحق.
2-ديسيكشن الحيوانات وجمع الأنسجة الدهنية
- استخدام الفئران الذكور C57BL/6J عمرها 6 في الأسبوع. تخدير الفئران مع إيسوفلوراني (4 – 5% لتحريض ثم 1%-2% للصيانة). بمجرد تخديره، إجراء منعكس تو-قرصه لتحديد عمق مخدر، إذا حكمنا من خلال عدم وجود ردود الفعل الدواسة. حالما يتم تخديره عميق من الفئران، تشريح الفئران بعد البروتوكول ك منشور مسبقاً15.
- تعقيم مقص حادة والجراحية منطقة الصدر (لا حاجة لحلاقة الشعر). فتح الصدر بقطع الحجاب الحاجز والاضلاع على طول السطح الأفقي مع حجم ~ 2 سم باستخدام مقص غير حادة. المشبك العلم الصدر مع هيموستات وتعكس ذلك بوضع هيموستات على رأسه.
- إجراء شق صغير في البطين الأيسر (~0.5 سم) مع مقص آيريس. إدراج إبرة نضح مقلوب الزيتون من خلال موقع شق والمشبك تلميح إبرة في المكان مع هيموستات. إرفاق الإبرة حقنه 50 مل تحتوي على بارافورمالدهيد تثبيت الحل (1% منهاج عمل بيجين، ودرجة الحموضة 7.4).
- فتح اتريوم الحق بقطع المقطع مع مقص آيريس كمنفذ التروية. بدء التروية بلطف ودفع باستمرار حقنه بمعدل التروية قريبة من 10 مل/دقيقة وقف دفع عندما يكون واضحا أي الدم السائل الخروج من المآخذ. وينبغي أن تتطلب العملية برمتها ~ 5 دقيقة.
تنبيه: تنفيذ هذه الخطوات تحت غطاء دخان لمنع التسمم من منهاج عمل بيجين. - تشريح الأنسجة الدهنية البيضاء والبنى من الفئران. استخدام مقص لقطع عينات الأنسجة إلى قطع صغيرة من قطع حوالي 5 × 5 × 3 مم3. نقل قطع صغيرة مع ملاقط معقمة الأنسجة تضمين أشرطة الكاسيت مع وضع العلامات المناسبة عينات الأنسجة على أشرطة الكاسيت.
- تزج الأشرطة التضمين يحتوي على عينات الأنسجة إلى الحل التثبيت (1% منهاج العمل في برنامج تلفزيوني 1 x، الرقم الهيدروجيني 7.4) في 4 درجات مئوية عن ح 24-48.
ملاحظة: الحل التثبيت ووقت التثبيت تختلف استناداً إلى أحجام من الأنسجة16،،من1718. - تغسل العينات مع الطازجة 1 × المخزن المؤقت برنامج تلفزيوني ثلاث مرات (0.5 مل/الغسيل).
تنبيه: تنفيذ هذه الخطوة تحت غطاء دخان. بارافورمالدهيد النفايات ينبغي التعامل معها بشكل صحيح وفقا لإجراءات التخلص من النفايات الخطرة.
ملاحظة: ويمكن تخزين الأنسجة في برنامج تلفزيوني 1 x في 4 درجات مئوية لمزيد من المعالجة.
3-جسم الحضانة
- قطع عينات الأنسجة الثابتة إلى حوالي 2 مم3 مكعبات مع مقص معقم. ل permeabilization، نقل العينات إلى 1.5 مل أنبوب يحتوي على 1 مل 1 × برنامج تلفزيوني-تكساس (1% أوكتوكسينول-9 في برنامج تلفزيوني 1 x، انظر الجدول للمواد، درجة الحموضة 7.4) وتدوير بلطف الأنابيب في RT 1 ح 18 لفة في الدقيقة.
- بعناية إزالة 1 × برنامج تلفزيوني-تكساس بالطموح. تغسل العينات 3 x بإضافة برنامج تلفزيوني 1 x مباشرة في نفس الأنابيب (لا حاجة لتغيير الأنابيب). أثناء كل غسل، عكس الأنابيب عدة مرات.
- لحظر، إضافة 0.5 مل من المخزن المؤقت حظر (جدول المواد) للعينات واحتضان في RT ح 2 مع تناوب لطيف.
- إعداد 0.4 مل من محلول جسم الأولية، تمييع 2 ميكروليتر لمكافحة--اندوموسين (العلامة للأوعية الدموية) 5 (1: 200) و 2 ميكروليتر من مكافحة – تيروزين hydroxylase (TH، العلامة للألياف العصبية) 5 (1: 200, 1 ميكروغرام/مل) الأجسام المضادة ("الجدول للمواد" للحصول على معلومات جسم) إلى 396 ميكروليتر من المخزن المؤقت لحظر. دوامة وتدور وصولاً إلى استرداد وحدة التخزين.
- للاحتضان جسم الأولى، بعناية إزالة المخزن المؤقت حظر من قطع الأنسجة. إضافة 100 ميكروليتر من الحل الأساسي جسم إعدادها في الخطوة 3.4 في أنابيب واحتضان في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظة: قد تختلف الوقت تمييع وحضانة جسم بين الأجسام المضادة المختلفة. من المستحسن إضافة أزيد الصوديوم 0.02 في المائة إلى حل جسم لمنع نمو الميكروبات. إعداد 0.4 مل من محلول جسم الأولية مع أزيد الصوديوم، إضافة 4 ميكروليتر من الأجسام المضادة (ميكروليتر 1 لكل) و 4 ميكروليتر من أزيد الصوديوم 2% إلى 392 ميكروليتر من المخزن المؤقت لحظر. - جمع الحل جسم الأولية لإعادة الاستخدام بعناية إذا رغبت في ذلك. تغسل العينات مع 1 x PBST (الرقم الهيدروجيني 7.4، 100 ميليلتر/يغسل) ثلاث مرات (30 دقيقة في كل) مع تناوب لطيف 18 لفة في الدقيقة.
- لإعداد حل جسم الثانوية، ميكروليتر 2 مخفف من فلوروفوري (موجه طول 495 نانومتر) مترافق الماعز المضادة IgG (1: 200) و 2 ميكروليتر من فلوروفوري (موجه طولها 650 nm) مترافق أرنب المضادة IgG (1: 200) (انظر الجدول للمواد) إلى 396 ميكروليتر من المخزن المؤقت لحظر. دوامة وتدور بإيجاز لجمع جميع السائل.
ملاحظة: حماية العينات من الضوء أثناء الإجراءات التالية. - للاحتضان جسم الثانية، إزالة المخزن المؤقت يغسل الماضي من العينات. إضافة 100 ميكروليتر من حل جسم الثانوية في الأنابيب واحتضان في RT ح 2 مع تناوب لطيف 18 لفة في الدقيقة.
- بعناية إزالة الحل جسم الثانوية. تغسل العينات 3 x 1 x PBST (الرقم الهيدروجيني 7.4، كل 30 دقيقة) مع تناوب لطيف 18 لفة في الدقيقة.
ملاحظة: عدم إعادة استخدام هذا الحل جسم الثانوية، كما أنها قد تكون ملوثة بكميات ضئيلة من الأجسام المضادة الابتدائي بالانسجة. - لإزالة البصرية، تزج العينات في 1 مل والغليسيرول 90% وتبقى العينات عند 4 درجة مئوية في الظلام حتى تصبح شفافة.
ملاحظة: مدة الغمر يعتمد على نوع النسيج والحجم. نموذجياً, يحتاج مكعب3 مم 2 من الأنسجة الدهنية البيضاء الحضانة بين عشية وضحاها، بينما نفس حجم البنى احتياجات عينة الأنسجة الدهنية لفترة أطول. - التقيد عازل سيليكون إلى الشريحة لإنشاء بئر لتصوير حجم. وبدلاً من ذلك، إرفاق عدة طبقات من شريط شفاف للشرائح وقطع مربع من الوسط إنشاء بئر (الشكل 2).
ملاحظة: ضبط عمق جيدا لتتناسب مع حجم العينة. ويستخدم في هذا البروتوكول، على عمق 1 ملم جيدا. - نقل العينات إلى البئر وملء مع المتوسطة التركيب بعناية (انظر الجدول للمواد). تكمن زلة غطاء على السطح وختم زوايا بكشف الغطاء مع متوسط اللزوجة العالية (انظر الجدول للمواد). واسمحوا تصاعد علاج متوسطة 24 ساعة في RT في الظلام.
ملاحظة: تأكد من أن ترك أي مسافة بين العينة وكشف الغطاء. تجنب فقاعات تحت بكشف الغطاء. تجنب وضع الضغط المفرط على العينات.
4. الحصول على الصور
- الحصول على الصور Z-المكدس (الرجوع إلى الخطوات 4.2 إلى 4.7) بهدف 20 x مجهر/برنامج [كنفوكل].
- بدء تشغيل النظام. انقر فوق علامة التبويب <التكوين> وتنشيط ليزر الأرجون والليزر 633 زناد. انقر فوق علامة التبويب <اكتساب>. في لوحة الخطوط <المرئية> الليزر، حرك مربعات التمرير كثافة المناظرة في اختيار خطوط الليزر 488 نانومتر و 633 نانومتر. في البداية، يمكن تعيين الكثافة إلى 20% – 30%. حدد مرآة ديتشوريك ثلاثية 488/561/633. تنشيط في بمتس بالنقر فوق خانات الاختيار <النشط>، اختيار PMT1 لانبعاث متحمس 488 نانومتر الليزر و PMT3 لأن الليزر 633 نانومتر. تعيين نطاق الطول الموجي إلى 500-550 نيوتن متر ل PMT1 و 650 750nm ل PMT3. حدد بسودوكولور لاستخدامها لعرض الصور بالنقر فوق المستطيل الملون بجوار كل PMT مزدوجة واختيار لون من القائمة المنبثقة.
- انقر فوق <لايف> التحقق من صورة العينات. استخدم مقبض z-موقف لتحديد ئرة تركيز داخل منطقة س وص للفائدة. ضبط سطوع الصور بضبط كثافة الليزر، وكسب الذكية والإزاحة. لكل قناة الأسفار، نفذ هذا التكيف في إطار وضع العرض <كلوت> (سريعة تبدو أعلى الجدول). انقر فوق الزر <كلوت> للدخول في وضع كلوت، الذي يتم عرض كسل مشبعة باللون الأزرق للمساعدة في تحديد مستوى السطوع المناسبة. انقر مرتين فوق الزر <كلوت> للعودة إلى وضع العرض بسيودوكولور.
ملاحظة: قد تختلف القيم العددية للإعداد بين كل تجربة. - أثناء المسح، أدر ض-موقف عكس اتجاه عقارب الساعة تحريك خطة التركيز على نهاية واحدة من حجم الاهتمام وثم انقر على السهم <نهاية> لتعيين موضع نهاية المسح الضوئي. ثم أدر ض-الموقف اتجاه عقارب الساعة لتحريك الطائرة من التركيز عن طريق العينة إلى الطرف الآخر من حجم الفائدة، وثم انقر على السهم <بدء> لتعيين موضع بدء المسح الضوئي.
ملاحظة: للمقارنة بين العينات المختلفة، تحديد وحدة التخزين Z نفسها لعينات مختلفة. - قم بضبط حجم z-الخطوة 3 ميكرومتر. تغيير جودة الصورة عن طريق تحديد شكل 1024 × 1024، سرعة 100 هرتز، وخط متوسط 2.
- حدد <ابدأ > الشروع في اقتناء صورة z-المكدس.
- لإسقاط الحد الأقصى من المكدس الصورة المكتسبة، انقر فوق علامة التبويب <عملية> وثم حدد <3D الإسقاط> <أداة>، وأدخل <الحد الأقصى> في القائمة الأسلوب بدون تغييرات إلى X، Y وتعيين زهير <عتبة> إلى 0. انقر فوق <تطبيق>. سوف تكون مكدسة حدة الأقصى Z-وحدة التخزين في صورة ثنائية الأبعاد التي سيتم عرضها (الشكل 4 أ).
5-تحليل شبكات الألياف العصبية والأوعية الدموية
-
تحليل 2D الصور عن طريق برمجيات المصدر المفتوح (انظر الجدول للمواد)19
- افتح الصور مكدسة في البرنامج. ضبط سفينة القطر وكثافة حتى تحديد كافة هياكل السفن يمكن أن يكون بشكل صحيح (الشكل 4 باء).
- حدد تشغيل تحليل وتصدير البيانات وفقا لإرشادات البرنامج.
-
تحليل 3D صور عن طريق البرمجيات المرخصة (انظر الجدول للمواد)
- فتح البيانات الخام للصور مع البرنامج. ضبط العتبة ومعلمات أخرى حتى يتم تحديد هياكل السفن في كل طبقة من z-وحدة التخزين بشكل صحيح (أرجع إلى دليل المستخدم لمزيد من التفاصيل في البرنامج) (الشكل 4).
- تحليل الأحرف قطاعات مختارة، وتصدير البيانات التالية بتوجيه البرنامج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وجمعت المنطقة البعيدة من الأنسجة الدهنية البيضاء البربخيه (أوت)، ومنطقة وسطى من دورسولومبار تحت الجلد بيضاء الأنسجة الدهنية (سوات)، ومنطقة وسطى من النسيج الدهني البنى إينتيرسكابولار (BAT). يتم الإشارة إلى المواقع لجمع هذه الأنسجة في الشكل 1.
رقم 1: تشريح الأنسجة الدهنية تحت الجلد الأبيض (سوات)، والأنسجة الدهنية البيضاء البربخيه (أوت) والأنسجة الدهنية براون (BAT) يشير إلى المناطق المستخدمة لجمع العينات- (أ) المناطق المبينة بخطوط متقطعة بيضاء تمثل سوات، وهو موقع النجمة البيضاء وأبرز موقع لجمع سوات. المناطق المبينة بخطوط متقطعة الأسود أوت، وهو موقع النجمة السوداء وأبرز موقع لجمع أوت. (ب) المناطق المبينة بخطوط متقطعة السوداء الخفافيش، وهو أبرز منطقة جمع الأنسجة بالعلامة النجمية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
بعد تلطيخ كل جبل، وقد شنت قطع الأنسجة في بئر عمق 1 مم (الشكل 2)
والمصورة بالمجهر [كنفوكل]. ونحن أول اختبار تأثير الخطوة المقاصة مع الاحتضان والغليسيرول 90% على جودة الصور. وجدنا أن الأوعية الدموية أكثر إيجابية كانت ملطخة بجسم α-اندوموسين في سوات والغليسيرول المحتضنة، مما يوحي بأن خطوة إزالة أمر حاسم لتلطيخ كاملة من الأوعية الدموية (الشكل 3، قارن الألواح A و B).
رقم 2: الرسومات التخطيطية للآبار لتصوير حجم. (A) الرسم التخطيطي للشريحة مع عازل سيليكون. (ب) الرسم التخطيطي للبئر مع طبقات متعددة من الأشرطة التي تبذلها لدينا مختبر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 3: مقارنة إذا الصور من الأوعية الدموية أككويريدويث أو بدون خطوة مسح ضوئي مع والغليسيرول 90%. (أ) الجامعة-جبل الفلورة (إذا كان) تلطيخ مع الأجسام المضادة اندوموسين (الأخضر) في سوات. كان عدم إخضاع العينة لخطوة مسح ضوئي (الخطوة 3، 10). (ب) الجامعة-جبل إذا تلطيخ مع الأجسام المضادة اندوموسين في سوات. وكان إخضاع العينة لمسح ضوئي والخطوة (الخطوة 3، 10) قبل تصاعد الخطوات (خطوات 3.11 و 3.12). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
ومع ذلك، لا يؤثر الخطوة المقاصة مع والغليسيرول سلامة أو شكل الأوعية الدموية (الشكل 3). ونظرا لهذه الآثار المفيدة، في التجارب التالية، تم تنفيذ الخطوة المقاصة.
ونحن كذلك مقارنة نتائج تحليلات 2D و 3D باستخدام برامج مختلفة (انظر الجدول للمواد). ووجدنا أن، بينما قدمت الصور 3D على ما يبدو أكثر تفصيلاً من المعلومات الهيكلية، الطرق التحليلية اثنين في نهاية المطاف لم تظهر اختلافات كبيرة من حيث عدد السفن (الشكل 4) فرع وطول.
الشكل 4: مقارنة بين تحليلات 2D و 3D في هيكل السفينة. (أ) أثر إسقاط الحد الأقصى على الصور. (ب) النتائج التحليلية من قبل البرنامج 2D (انظر الجدول للمواد). وبخاصة، تدل الخطوط الحمراء الهيكل المحدد، بينما تشير النقاط الزرقاء إلى نقاط العلامة التجارية. (ج) التحليل نتائج البرنامج ثلاثي الأبعاد (انظر الجدول للمواد). المنطقة الرمادية من المنطقة المختارة للتحليل. يشير الخط الأخضر إلى شرائح المقاسة وتشير النقاط الخضراء إلى العقد المقاسة. (د) المقارنة بين طول السفينة، والجزء المتعلق بأرقام وأرقام عقده التفريع عقده طرفية أرقام تحليلها بواسطة الطرق في 2D أو 3D. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
المنشورات السابقة قد أثبتت أن المستودعات الدهنية المختلفة تمتلك خصائص متغايرة1،18. هنا سعينا لتحديد ما إذا كانت الأوعية الدموية والألياف العصبية معرض أنماط مختلفة بين مستودعات استخدام أسلوب وضعت حديثا لدينا. ولتحقيق ذلك، أجرينا المشارك إذا تلطيخ مع α-اندوموسين (بالنسبة للأوعية الدموية) والأجسام المضادة لل α (للألياف العصبية) في الأنسجة الدهنية. من المثير للاهتمام، وأظهرت النتائج أن هناك إلى حد كبير أكثر من الأوعية الدموية والألياف العصبية في الخفافيش حدى (الشكل 5، قارن أسفل الممرات للممرات الأعلى والأوسط) بالمقارنة
الرقم 5: مقارنة بين الأوعية الدموية والألياف العصبية المكتسبة من مختلف المستودعات الدهنية. كل جبل إذا تلطيخ مع مكافحة--اندوموسين (الأخضر) ومكافحة تيروزين سوات أضداد hydroxylase (ال) (أحمر) في أوت (أ، ب، اندمجت في ج)، (د، ه، اندمجت في واو) وبات (ز، ح، اندمجت في أنا)- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
بين حدى، أظهرت سوات كثافة الأوعية الدموية أعلى مما أوت (الشكل 5، قارن الأوسط للممر العلوي). من المذكرة، بينما الألياف العصبية الموسع بالتوازي مع الأوعية الدموية، أنها لم تظهر الترجمة المشارك كبيرة (الشكل 5، الممرات المدمجة). كذلك نحن تقاس كمياً منطقة السفينة وعدد من الوصلات، وطول أنبوب مع أسلوب 2D ووجدت نتائج مماثلة كما هو موضح أعلاه (الشكل 6).
رقم 6: التحليل الكمي للأوعية الدموية وشبكات الألياف العصبية. (أ) النسبة المئوية لمساحة الأوعية الدموية في العينات من أوت، سوات، والخفافيش. (ب) العدد الوصلات من الأوعية الدموية الشبكات في أوت، سوات، والخفافيش. (ج) السفينة إجمالي طول شبكات الأوعية الدموية في أوت، سوات، والخفافيش. (د) النسبة المئوية لنفيه مجال الألياف في عينات أوت، سوات والخفافيش. (ه) عدد وصلات الألياف العصبية في أوت، سوات، والخفافيش. (و) المجموع طول الألياف العصبية في أوت، سوات، والخفافيش. التحليلات التي أجريت مع البرمجيات 2D. النتائج التي تحققت من الصور المعروضة في الشكل 5. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
باختصار، هذا النهج بنجاح شارك الملون الأوعية الدموية والألياف العصبية في مختلف الأنسجة الدهنية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إعادة عرض الأنسجة الدهنية يرتبط ارتباطاً مباشرا بالتقلبات الأيض أثناء السمنة التنمية1،2. الأوعية وتعصيب متعاطفة كلاهما ضروري لعملية إعادة عرض ديناميكية2،12. ولذلك، وضع نهج المطبقة لتصور الأوعية الدموية الجديدة، فضلا عن الألياف العصبية ذات أهمية كبيرة. وأبلغ الأساليب السابقة لتوثيق تولد الأوعية في الأنسجة الدهنية. ومع ذلك، تبقى بعض المسائل مع هذه النهج، بما في ذلك انخفاض الكفاءة وقرار صعب، وخلفية صاخبة. وفي الوقت نفسه، تعصيب متعاطف فقط قد اعترفت مؤخرا كخطوة حاسمة في الأنسجة الدهنية لعلم الأمراض14. حتى ولو كانت النتائج ذات الصلة للاهتمام، تتطلب أدوات الفحص المجهري متقدمة الأساليب المتبعة وهي مضيعة للوقت. هنا، نحن تقرير نهج سهلة لمتابعة تعديل من أعمالنا البروتوكول السابق لتلطيخ شارك الأوعية الدموية والألياف العصبية متعاطف. من المثير للاهتمام، نحن الملون بنجاح في الأوعية الدموية والألياف العصبية بدقة عالية، وتلطيخ لديه الصفات قابلة للمقارنة للصور تم الإبلاغ عنها سابقا18.
نحن سابقا الملون الأوعية الدموية في الأنسجة الدهنية التي إيمونوهيستوتشيميستري أو الفلورة مع جسم α-CD31، علامة على خلايا بطانية، على الشرائح جزءا لا يتجزأ من البارافين8،،من1320. بينما الأسلوب الذي يسمح لنا بالتمييز بين كثافة الأوعية الدموية بين مختلف المجموعات، ميكروفاسكولار السفن التي كانت إيجابية الملون لم تكن كاملة. وهنا اخترنا أسلوب الجامعة-جبل وتنفيذه إذا تلطيخ مع جسم α-اندوموسين، علامة أخرى للأوعية الدموية. مع هذا النهج الأمثل، كنا قادرين على تحقيق تلطيخ مع أكثر الأوعية الدموية، لا سيما ميكروبلود السفن. وعلاوة على ذلك، باستخدام هذا الأسلوب، منذ علينا تجنب الخطوات التي يمكن تنال من سلامة الأوعية الدموية، مثل البارافين التضمين والفورمالين تثبيت، حصلنا على صور ذات دقة أعلى وأكثر سفن سليمة. بنية متينة للسفن كذلك يسمح لنا لقياس ومقارنة أطوال والمتفرعة، والمناطق. من المذكرة، أضفنا خطوة مقاصة مع الجلسرين، حيث قطع الأنسجة يمكن أن تصبح أكثر شفافية، وهذه خطوة بسيطة لكنها حاسمة تعزز إلى حد كبير كفاءة18،المصبوغة21.
نظراً لمستويات عالية من محتويات المادة الدهنية في الأنسجة الدهنية، التي قد تحد من إمكانية الحصول على أجسام مضادة في المناطق الداخلية من الأنسجة، ونحن قص المستودعات إلى قطع صغيرة لضمان ربط الأجسام المضادة الكافية للبروتينات المستهدفة. وبالتالي، البقع أسلوبنا بنجاح المزيد من الأوعية الدموية والألياف العصبية من تلطيخ على أنسجة كاملة. ومع ذلك، قد تفقد المعلومات المكانية وبالتالي تؤثر على سلامة الألياف العصبية. لحل هذه المسألة واضحة وضمان الصور قابلة للمقارنة بين الفئران الفردية، يقترح جمع قطع صغيرة من نفس المناطق في مستودعات الدهنية. إذا كان كذلك هناك حاجة إلى مزيد من المعلومات المكانية، ينبغي الحصول على قطع أكبر لتلطيخ. لعينات أكبر، التثبيت أطول الأوقات مع جرعات كبيرة من FPA، تركيزات أعلى من المنظفات بيرميبيليزيشن، وقد تدعو الحاجة إلى فترات أطول من جسم الحضانة.
وقد تم التحقيق تعصيب الأنسجة الدهنية مؤخرا. جرى تطبيق تقنيات متقدمة متعددة لتصور الألياف العصبية14،17. هذه الأساليب أما باهظة الثمن أو تستغرق وقتاً طويلاً. هنا، نحن ببساطة يقوم وصمة عار إذا مع α-عشر (عصب متعاطفة مع علامة) ونجاح الملون ألياف العصب متعاطفة في ذات جودة عالية. الأهم من ذلك، أجرينا تلطيخ يشترك مع α-اندوموسين وال α للتحقيق في كيفية تفاعل الأوعية الدموية مع الألياف العصبية متعاطف أثناء إعادة عرض الأنسجة الدهنية.
من المذكرة، قارنا نتائج تحليلات 2D و 3D باستخدام البرمجيات المختلفة. ووجد أن، بينما قدم 3D صور أكثر تفصيلاً من المعلومات الهيكلية، لم تظهر الأساليب التحليلية اثنين فرق كبير من حيث الطول والتفرع للسفن. البرنامج نفسه عند تحليل باستخدام أسلوب ثلاثي الأبعاد، في نهاية المطاف، قد كشف بعض الإشارات الكاذبة التي تحتاج إلى تعديل يدوياً. نظراً لأن قد صمم البرنامج 2D عمدا لتحليل السفينة، ومن ثم اقترح لاستخدام هذا الأسلوب لقياس كمي الهيكل للسفن.
مع هذا الأسلوب، الأوعية الدموية والألياف العصبية في مختلف الأنسجة الدهنية قد شارك الملون، وعلى كثافة والمتفرعة، وأطوال بالمقارنة مع19. ووجد أن الأوعية الدموية والألياف العصبية أكثر سماكة في الخفافيش وات، مما يوحي بأنه بات مستودع الدهنية أكثر أيضي نشطة بالمقارنة. وعلاوة على ذلك، بالأوعية الدموية والأعصاب الكثافات في سوات كانت أعلى منها في أوت، مشيراً إلى أن مختلف حدى لها ملامح مختلفة يعيد البناء.
وفي الختام، هذا الأسلوب كفاءة المشترك البقع الأوعية الدموية والألياف العصبية في الأنسجة الدهنية5. وعلاوة على ذلك، هو بمثابة أداة مفيدة لدراسة التغيرات الدينامية في الأنسجة الدهنية أثناء تطوير السمنة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة المعهد الوطني للصحة (المعاهد الوطنية للصحة) منحة R01DK109001 (كانساس).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 805-545-180 | Lot: 116969 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Lot: 121944 |
| Amira 6.0 | Thermo Fisher Scientific | Licensed software | |
| Angio tool | National Institutes of Health | Open source software https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home |
|
| Anti-mouse endomucin antibody | R&D research system | AF4666 | Lot: CAAS0115101 |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | Pel Freez Biologicals | P40101-150 | Lot: aj01215y |
| Cover glasses high performance, D = 0.17 mm | Zeiss | 474030-9020-000 | |
| Cytoseal 280 | Thermo Fisher Scientific | 8311-4 | High-viscosity medium |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | |
| Paraformaldehyde,16% | TED PELLA | 170215 | |
| Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep | INVITROGEN | P24744 | Silicone isolator |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| SEA BLOCK Blocking Buffer | Thermo Fisher Scientific | 37527X3 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | |
| Tissue Path IV Tissue Cassettes | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Triton Χ-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Generic term: octoxynol-9 |
| Tube rotator and rotisseries | VWR | 10136-084 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Generic term: Polysorbate 20 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. Adipose tissue remodeling and obesity. Journal of Clinical Investigations. 121 (6), 2094-2101 (2011).
- Sun, K., et al. Endotrophin triggers adipose tissue fibrosis and metabolic dysfunction. Nature Communication. 5, 3485 (2014).
- Zhao, Y., et al. Divergent functions of endotrophin on different cell populations in adipose tissue. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 311 (6), E952-E963 (2016).
- Zhao, Y., et al. Transient Overexpression of VEGF-A in Adipose Tissue Promotes Energy Expenditure via Activation of the Sympathetic Nervous System. Molecular and Cellular Biology. , (2018).
- Xue, Y., et al. Hypoxia-independent angiogenesis in adipose tissues during cold acclimation. Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).
- Chen, S., et al. LncRNA TDRG1 enhances tumorigenicity in endometrial carcinoma by binding and targeting VEGF-A protein. BBA Molecular Basis of Disease. 1864 (9 Pt B), 3013-3021 (2018).
- Sun, K., et al. Dichotomous effects of VEGF-A on adipose tissue dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (15), 5874-5879 (2012).
- During, M. J., et al. Adipose VEGF Links the White-to-Brown Fat Switch With Environmental, Genetic, and Pharmacological Stimuli in Male Mice. Endocrinology. 156 (6), 2059-2073 (2015).
- Elias, I., et al. Adipose tissue overexpression of vascular endothelial growth factor protects against diet-induced obesity and insulin resistance. Diabetes. 61 (7), 1801-1813 (2012).
- Sung, H. K., et al. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17 (1), 61-72 (2013).
- Cao, Y. Angiogenesis and vascular functions in modulation of obesity, adipose metabolism, and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 18 (4), 478-489 (2013).
- Sun, K., et al. Brown adipose tissue derived VEGF-A modulates cold tolerance and energy expenditure. Molecular Metabolism. 3 (4), 474-483 (2014).
- Zeng, W., et al. Sympathetic neuro-adipose connections mediate leptin-driven lipolysis. Cell. 163 (1), 84-94 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Berry, R., et al. Imaging of adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).
- Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
- An, Y. A., et al. Angiopoietin-2 in white adipose tissue improves metabolic homeostasis through enhanced angiogenesis. eLife. 6, (2017).
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
