Summary
היווצרות כלי דם חדשים, העצבוב סימפטי לשחק תפקיד מרכזי ב שיפוץ רקמת שומן. עם זאת, נותרו בעיות טכניות ב להמחיש ומדידת באופן כמותי את רקמת שומן. כאן אנו מציגים פרוטוקול בהצלחה תווית ולהשוות באופן כמותי את הצפיפויות של כלי הדם, סיבי עצב ברקמות שומן שונות.
Abstract
מחקרים שנעשו לאחרונה הראו את תפקיד קריטי של אנגיוגנזה, העצבוב סימפטית ב רקמת שומן שיפוץ במהלך הפיתוח של השמנת יתר. לפיכך, פיתוח שיטה נוחה ויעילה לתעד את השינויים הדינמיים של רקמת שומן הכרחי. כאן, אנו מתארים בגישה immunofluorescent ששונה זה ביעילות משותפת כתמי כלי הדם, סיבי עצב ברקמות שומן. לעומת שיטות מסורתיות שפותח לאחרונה, הגישה שלנו היא יחסית קלה ויעילה יותר תיוג כלי הדם, סיבי עצב עם צפיפות גבוהה יותר ורקע פחות. יתר על כן, הרזולוציה גבוהה יותר של תמונות נוספות מאפשר לנו למדוד במדויק את האזור של ספינות, כמות הסתעפות, ואת אורך הסיבים על ידי תוכנת קוד פתוח. בתור הדגמה באמצעות השיטה שלנו, אנו מראים שאת רקמת שומן חום (בת) מכיל כמויות גבוהות יותר של כלי הדם, סיבי עצב לעומת שומן לבן (וואט). אנחנו עוד יותר מצאו כי בקרב WATs, וואט תת עורית (ימ מ) יש יותר כלי דם, סיבי עצב בהשוואה וואט epididymal (eWAT). השיטה שלנו ובכך מספק כלי שימושי עבור חוקרים רקמת שומן שיפוץ.
Introduction
רקמת שומן בעל מפתח מטבולית ופונקציות אנדוקרינית1. זה באופן דינמי מתרחבת או מתכווצת בתגובה אחרת מזין מדגיש2. הרקמה הפעילה שיפוץ תהליך מורכב מהשלבים מרובים פיזיולוגיים נתיבים/כולל אנגיוגנזה, פיברוזיס, בעיצוב של microenvironments דלקתית מקומית2,3,4. כמה לגירויים פיזיים, כגון חשיפה קר ופעילות גופנית, עלול לעורר ההפעלה סימפטי, מה שמוביל בסופו של דבר היווצרות כלי דם חדשים, העצבוב סימפטי רקמות adipose5,6. תהליכי שיפוץ אלה קשורות בחוזקה מערכתית תוצאות מטבולית כולל הרגישות לאינסולין, סימן ההיכר של סוג 2 סוכרת2. לפיכך, ויזואליזציה של שינויים פתולוגיים אלה חשוב מאוד להבנת מצב תקין של רקמות adipose שלם.
אנגיוגנזה הוא תהליך היווצרות כלי דם חדשים. מאז כלי הדם לספק חמצן, חומרים מזינים, הורמונים, גורמי גדילה לרקמות, אנגיוגנזה נחשב שלב מפתח רקמת שומן שיפוץ, אשר תועד עם טכניקות שונות6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. עם זאת, נותרו שאלות על הרזולוציה של תמונות, יעילות של immunostaining, ושיטות על כימות של צפיפות כלי. בהשוואה להיווצרות כלי דם חדשים, העצבוב של רקמת שומן כבר לא העריכה כראוי במשך זמן רב. לאחרונה, Zeng et al. 14 שימוש מתקדם מיקרוסקופ שני הפוטונים intravital והפגינו adipocytes מוקפים על ידי שכבות של סיבי עצב14. מאז, החוקרים החלו להעריך את תפקיד מרכזי של אוהדת העצבוב בוויסות של רקמת שומן פיזיולוגיה. לפיכך, פיתוח גישה העצבוב עצב אדיפוז מסמך קל ומעשי חשוב.
כאן, אנו מדווחים על שיטה ממוטב עבור ההכתמה משותפת של כלי הדם, סיבי עצב על סמך הפרוטוקולים הקודמים שלנו. בשיטה זו, ניתן להשיג תמונות ברורות של כלי הדם, סיבי עצב ללא רקע רועש. יתר על כן, אנו משיגים רזולוציה גבוהה מספיק לביצוע מדידה כמותית של צפיפויות עם תוכנת קוד פתוח. באמצעות גישה חדשה זו, בהצלחה ונוכל להשוות את המבנים ואת צפיפות של כלי הדם, סיבי עצב ב מחסני אדיפוז שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים המכיל נושאים בעלי חיים אושרו על-ידי החיה רווחה הוועדה של אוניברסיטת טקסס למדעי הבריאות במרכז יוסטון (מספר פרוטוקול בעלי חיים: הרפתקאות בטבע-18-0057).
1. מגיב הכנה
- 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS, pH 7.4): כדי להפוך 1 ליטר ל- 1 x PBS, להמיס 8 גרם של NaCl, 0.2 גרם אשלגן כלורי, g 1.44 של Na-2-HPO-4ו- 0.24 גר'2פו ח'4 ב- 800 מ ל מים מזוקקים. להתאים את ה-pH 7.4 ולאחר מילוי עם מים מזוקקים כדי להשיג נפח סופי של 1 ל'
- paraformaldehyde 1% ב- PBS 1 x (1% מחברים, wt/כרך): כדי להשיג נפח סופי של 50 מ ל, להוסיף מ 3.125 ל 16% מחברים (ראה טבלה של חומרים) 46.875 מ של 1 x PBS. מערבבים היטב ולאחסן ב 4 ° C לשימוש מאוחר יותר.
התראה: Paraformaldehyde הוא רעיל. כל ההליכים צריכה להתבצע תחת ברדס fume כדי למנוע שאיפת העור קשר. - 0.1% polysorbate 20 (ראה טבלה של חומרים) ב- PBS 1 x (1 x PBST, pH 7.4, כרך/כרך): כדי להשיג נפח סופי של 50 מ ל, להוסיף מ 0.05 ל polysorbate מ ל 20 כדי 49.95 של PBS 1 x. מערבולת, חנות ב 4 ° C עד כחודש.
- 1% octoxynol-9 (ראה טבלה של חומרים) ב- PBS 1 x (1 x PBS-TX, pH 7.4, כרך/כרך): כדי להשיג נפח סופי של 10 מ"ל, להוסיף 0.1 מ"ל של octoxynol-9 9.9 מ ל 1 x PBS. מערבולת, חנות ב 4 ° C עד כחודש.
- אזיד הנתרן 2% (wt/כרך): כדי לייצר 10 מ"ל של אזיד הנתרן 2%, להוסיף 0.2 גר' אזיד הנתרן 10 מ"ל של PBS 1 x. מערבבים היטב ולאחסן ב 4 ° C לשימוש מאוחר יותר.
- גליצרול 90% ב- PBS 1 x (vol/כרך): כדי להשיג נפח סופי של 10 מ"ל, להוסיף 1 מ"ל של PBS 1 x 9 מ של גליצרול. מערבולת, חנות בטמפרטורת החדר (RT) לשימוש מאוחר יותר.
2. בעלי חיים Ddissection ואוסף רקמת שומן
- השתמש בת שבוע 6 C57BL/6J עכברים זכרים. עזים ומתנגד העכברים עם איזופלוריין (4% – 5% עבור אינדוקציה ואז 1% – 2% לצורך תחזוקה). ברגע מרדימים, לבצע רפלקס הבוהן-קמצוץ כדי לקבוע את עומק הרדמה, אם לשפוט לפי העדר רפלקסים פדלים. ברגע העכברים הם מרדימים עמוקות, לנתח העכברים בעקבות פרוטוקול שפורסמו בעבר15.
- לחטא את המספריים בוטה ואת האזור הכירורגי של בית החזה (אין צורך לגלח את השיער). פתח את התיבה על ידי גזירה את הסרעפת והצלעות לאורך פני השטח לרוחב בגודל של ~ 2 ס מ בעזרת מספריים בוטה. תהדק את הדגל החזה עם עוצר דימום ומשקפים אותה על ידי לשים את עוצר דימום על הראש.
- עושים חתך קטן לתוך החדר השמאלי (~0.5 ס מ) עם מספריים איריס. המחט של זית שקצהו זלוף דרך החתך, מהדק את מחט במקום עם עוצר דימום. לצרף את המחט מזרק 50 מ ל המכיל paraformaldehyde קיבוע פתרון (1% מחברים, pH 7.4).
- פתח אטריום ימין על-ידי המקטע גזירה במספריים איריס כמו ששקע זלוף. להתחיל את הטפטוף על ידי בעדינות, ללא הרף דוחף את המזרק בקצב זלוף קרוב 10 מ"ל לדקה תפסיק לדחוף כאשר הנוזל יציאה לשקע היא ברורה של דם. כל התהליך צריך לדרוש ~ 5 דקות.
התראה: בצע שלבים אלה ברדס fume כדי למנוע רעילות של כדורגלן. - לפרק רקמות adipose לבן וחום של העכברים. להשתמש במספריים לפרוץ את דגימות רקמה חתיכות קטנות של חתיכות כ 5 x 5 x 3 מ מ3. העבר של גושים קטנים הפינצטה סטיריליים לתוך הרקמה הטבעה קלטות עם תיוג מתאים של דגימות רקמה על הקלטות.
- לטבול הקלטות ההטבעה המכיל דגימות רקמה לתוך הפתרון קיבעון (1% מחברים ב- 1 x PBS, pH 7.4) ב 4 מעלות צלזיוס במשך 24-48 שעות.
הערה: הפתרון קיבוע והשעה קיבוע משתנים בהתאם בגדלים רקמות16,17,18. - לשטוף את הדגימות עם טרי 1 x מאגר PBS שלוש פעמים (0.5 mL/לשטוף).
התראה: לבצע שלב זה ברדס fume. הפסולת paraformaldehyde צריך להיות מטופל כראוי על פי הנהלים סילוק פסולת מסוכנת.
הערה: יכול להיות מאוחסן ברקמות 1 x PBS ב 4 ° C לשם עיבוד נוסף.
3. נוגדן דגירה
- חותכים את דגימות רקמה קבוע כ 2 מ מ3 קוביות עם המספריים מעוקר. עבור permeabilization, להעביר את הדגימות לתוך צינור 1.5 mL המכיל 1 מ ל 1 x PBS-TX (1% octoxynol-9 ב 1 x PBS, ראה טבלה עבור חומרים, pH 7.4) ולסובב בעדינות את הצינורות-RT עבור h 1-18 סל ד.
- הסר בזהירות את 1 x PBS-TX על ידי השאיפה. לשטוף את הדגימות 3 x על-ידי הוספת מגניב 1 x ישירות לתוך הצינורות אותו (אין צורך לשנות את הצינורות). במהלך כל כביסה, היפוך הצינורות מספר פעמים.
- לחסימת, להוסיף 0.5 מ של מאגר חסימה (טבלה של חומרים) הדגימות, תקופת דגירה-RT של 2 h עם סיבוב עדין.
- כדי להכין 0.4 מ של נוגדן ראשוני פתרון, למהול 2 μL של אנטי - endomucin (דה מרקר של כלי הדם) 5 (1:200) ו- 2 μL של אנטי – טירוזין hydroxylase (TH, דה מרקר של סיבי עצב) 5 (1:200, µg 1/mL) נוגדנים (טבלה של חומרים למידע נוגדנים) לתוך μL 396 מאגר חסימה. מערבולת, ספין למטה כדי לשחזר אמצעי האחסון.
- עבור הדגירה נוגדן ראשון, הסר בזהירות המאגר החוסמים חתיכות רקמה. להוסיף 100 μL של נוגדן ראשוני פתרון מוכן בשלב 3.4 לתוך צינורות, דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
הערה: דילול נוגדן וזמן הדגירה עשויים להשתנות בין נוגדנים שונים. מומלץ להוסיף 0.02% אזיד הנתרן הפתרון נוגדנים כדי למנוע צמיחת חיידקים. כדי להכין 0.4 מ של נוגדן ראשוני פתרון עם אזיד הנתרן, להוסיף 4 μL של נוגדנים (1 μL של כל אחד) ו- 4 μL של אזיד הנתרן 2% μL 392 מאגר חסימה. - בזהירות לאסוף את הפתרון נוגדן ראשוני לשימוש חוזר במידת הצורך. לשטוף את הדגימות עם 1 x PBST (pH 7.4, µL 100/לשטוף) שלוש פעמים (30 דקות כל אחד) עם סיבוב עדין-18 סל ד.
- הכנת נוגדנים משניים פתרון, שתדללו 2 μL של fluorophore (גל אורך 495 ננומטר) מצומדת עז אנטי איג (1:200), 2 μL של fluorophore (גל באורך 650 ננומטר) מצומדת ארנב אנטי איג (1:200) (ראה טבלה של חומרים) לתוך μL 396 של מאגר חסימה. מערבולת, ספין בקצרה כדי לאסוף את כל הנוזל.
הערה: להגן על הדגימות אור במהלך ההליכים הבאים. - הדגירה הנוגדן השני, להסיר המאגר שטיפת האחרון מדגימות. להוסיף 100 μL של נוגדנים משניים פתרון לתוך צינורות, תקופת דגירה-RT של 2 h עם סיבוב עדין-18 סל ד.
- הסר בזהירות את הפתרון נוגדנים משניים. לשטוף את הדגימות 3 x 1 x PBST (pH 7.4, 30 דקות) עם סיבוב עדין-18 סל ד.
הערה: לא חוזר זה פתרון נוגדנים משניים, כמו זה יכול להיות מזוהם עם כמויות זעירות של נוגדנים העיקרי שהביא הרקמות. - לאישור אופטי, לטבול את הדגימות ב 1 מ"ל של 90% גליצרול, שומרים את הדגימות ב 4 ° C בחושך עד שהם הופכים לשקופים.
הערה: משך טבילה תלוי רקמה סוג וגודל. בדרך כלל, קוביה3 2 מ מ של שומן לבן צריך הדגירה לילה, בעוד באותו גודל חום רקמת שומן מדגם לצרכי יותר. - דבקים isolator סיליקון לשקופית כדי ליצור טוב עבור אמצעי הדמיה. לחלופין, לצרף מספר שכבות של השקוף השקופיות ולאחר לגזור ריבוע באמצע כדי ליצור באר (איור 2).
הערה: להתאים את עומק טוב כדי להתאים לגודל המדגם. ב פרוטוקול זה, משמש לעומק טוב 1 מ מ. - בזהירות להעביר את הדגימות לתוך הבאר ולמלא אותה עם המדיום הרכבה (ראה טבלה של חומרים). לשים מכסה על פני השטח. ואטמו את הפינות של תגית כיסוי גבוה צמיגות בינונית (ראה טבלה של חומרים). לתת את התרופה הרכבה בינונית במשך 24 שעות ביממה במלון RT בחשכה.
הערה: ודא כי אין מקום שנשאר בין מדגם לבין מכסה. להימנע בועות תחת תגית כיסוי. הימנע מהנחת לחץ רב מדי על הדגימות.
4. ייבוא תמונות
- לרכוש תמונות Z-מחסנית (עיין צעדים 4.2 – 4.7), שמטרתה 20 x מיקרוסקופ קונפוקלי/תוכנה.
- התחל את המערכת. לחץ על הכרטיסיה <תצורה> ולהפעיל על לייזר ארגון ועל הנה 633 לייזר. לחץ על הכרטיסיה <רכוש>. בחלונית קווי לייזר ' <גלוי>, הזז את המחוונים בעוצמה המתאימה כדי לבחור את קווי לייזר של 488 ננומטר, 633 ננומטר. בתחילה, עוצמות ניתן להגדיר עד 20% – 30%. בחר את המראה dichoric טריפל 488/561/633. הפעל את PMTs על ידי לחיצה על <פעיל> בתיבות הסימון, בחירת PMT1 עבור הפליטה נרגש על ידי 488 ננומטר לייזר PMT3 בשביל זה לייזר nm 633. הגדר טווח אורך הגל 500-550 ננומטר עבור PMT1 ו- 650-750nm עבור PMT3. בחר את psudocolor כדי לשמש עבור תצוגת תמונה כפול לחיצה על המלבן צבעוניים לצד כל PMT ובחירה צבע מהתפריט הנפתח.
- לחץ על <Live> כדי לבדוק את התמונה של דגימות. השתמש את כפתור z-מיקום כדי לבחור מטוס של מוקד בתוך האזור XY עניין. להתאים את הבהירות של התמונות על-ידי כיוונון עוצמת לייזר, חכם ורווח היסט. בכל אחד מהערוצים פלורסצנטיות, לבצע התאמה זו תחת מצב התצוגה <QLUT> (מהירה נראה את הטבלה). לחץ על לחצן <QLUT> כדי להיכנס למצב QLUT, שבה פיקסלים רווי מוצגים בכחול כדי לסייע ההגדרה של רמת הבהירות המתאים. לחץ פעמיים על לחצן <QLUT> כדי לחזור מצב התצוגה מדומה.
הערה: ערכים מספריים של הגדרת עשויים להשתנות בין כל ניסוי. - בזמן הסריקה, סובב את כפתור Z-מיקום השעון כדי להעביר את התוכנית של המוקד קצה אחד של אמצעי האחסון של עניין ולאחר מכן לחץ על החץ <סוף> כדי להגדיר את המיקום סיום הסריקה. לאחר מכן סובב את כפתור Z-מיקום השעון כדי לעבור למישור המוקד דרך הדגימה הקצה השני של אמצעי האחסון של עניין ולאחר מכן לחץ על החץ <בגין> כדי להגדיר את המיקום בגין סריקה.
הערה: עבור ההשוואה בין מדגמים שונים, להגדיר באותו Z-אמצעי אחסון עבור מדגמים שונים. - להתאים את גודל z-צעד 3 מיקרומטר. לשנות איכות התמונה על-ידי בחירת תבנית של 1024 x 1024, מהירות של 100 הרץ, קו ממוצע של 2.
- בחר <התחל > ליזום את רכישת התמונה z-מחסנית.
- עבור תמונה מוקרנת מרבי של הערימה התמונה נרכשת, לחץ על הכרטיסיה <תהליך> ואז <כלי>, בחר <3D הקרנה> הזן <המרבי> ברשימה שיטה ללא שינויים ל- X, Y וערכת צ <הסף> 0. לחץ על <להחיל>. העוצמה המקסימלית של Z-אמצעי האחסון יערמו תמונה דו-ממדית, אשר יוצגו (איור 4A).
5. ניתוח של כלי הדם ושל רשתות סיבי עצב
-
ניתוח של 2D תמונות באמצעות תוכנת קוד פתוח (ראה טבלה של חומרים)19
- פתח את תמונות מוערמות בתוכנה. להתאים את כלי השיט קוטר ועוצמה עד לבחירת כל המבנים קיבול יכול להיות כראוי (איור 4B).
- בחרו להפעיל ניתוח , לייצא את הנתונים בעקבות הנחיה של התוכנה.
-
ניתוח של 3D תמונות באמצעות התוכנה מורשה (ראה טבלה של חומרים)
- פתח את הנתונים הגולמיים של תמונות עם התוכנה. התאם את הסף ופרמטרים אחרים עד המבנים כלי בכל שכבה של z-אמצעי האחסון נבחרו כראוי (עיין במדריך למשתמש לקבלת פרטים בתוכנה) (איור 4C).
- לנתח את התווים שנבחרו מקטעי ולייצא את הנתונים בעקבות ההדרכה של התוכנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אזור דיסטלי של רקמת שומן לבן epididymal (eWAT), אזור המדיאלי dorsolumbar לבן רקמת השומן התת עורית (ימ מ) ואזור המדיאלי של רקמת שומן חום interscapular (בת) נאספו. המיקומים לאיסוף רקמות אלו מסומנים באיור1.
איור 1: אנטומיה של רקמת השומן הלבן התת עורית (ימ מ) epididymal שומן לבן (eWAT), רקמת שומן חום (בת) מציין אזורים המשמשת לאיסוף הדגימות. (א) האזורים המוקף לבן קווים מקווקווים מייצגים הימ מ, והוא המיקום כוכבית לבן מסומן האתר לאיסוף הימ מ. האזורים המתוארים באמצעות קווים מקווקווים שחור eWAT, המיקום כוכבית שחור מודגש הוא האתר לאיסוף eWAT. (B) האזורים המתוארים באמצעות קווים מקווקווים שחור בת הינם אזור הרקמה אוסף מסומן באמצעות הכוכבית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
לאחר כולה-הר מכתים, חתיכות רקמה רכוב בטוב של 1 מ מ עומק (איור 2)
תמונה עם מיקרוסקופ קונפוקלי. בדקנו קודם את ההשפעה של השלב סליקה עם 90% גליצרול דגירה על איכות של התמונות. מצאנו כי יותר כלי דם היו מוכתמים חיובי α-endomucin נוגדנים בימ מודגרות גליצרול, רומז השלב חישוף הוא קריטי עבור צביעת מלאה של כלי הדם (איור 3, להשוות לוחות A ו- B).
איור 2: דיאגרמות מן הבארות עבור אמצעי הדמיה- (A) דיאגרמה של שקופית עם isolator סיליקון. (B) תרשים של באר עם שכבות מרובות של סרטים שנעשו על ידי המעבדה שלנו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: השוואה של אם תמונות של כלי הדם acquiredwith או ללא שלב ניקוי אופטי עם 90% גליצרול. (א) כולה-הר immunofluorescence (אם) צביעת עם נוגדן anti-endomucin (ירוק) את הימ מ. המדגם היה נתון לא לשלב סליקה אופטי (שלב 3.10). (B) כולה-הר אם מכתים עם נוגדן anti-endomucin את הימ מ. המדגם היה נתון בשלב סליקה אופטי (שלב 3.10) לפני השלבים הרכבה (שלבים 3.11 ו- 3.12). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
עם זאת, הצעד סליקה עם גליצרול לא השפיעה על תקינות או צורה של כלי הדם (איור 3). לאור אלה השפעות מועילות, בניסויים הבאים, הצעד סליקה בוצעה.
בהמשך השווינו את התוצאות של הבדיקות 2D and 3D באמצעות תוכנות שונות (ראה טבלה של חומרים). מצאנו כי בעוד תמונות 3D ככל הנראה סיפק מידע מפורט יותר מבניים, שתי השיטות האנליטיות בסופו של דבר לא הראה הבדלים משמעותיים מבחינת אורך, סניף מספר בכלי הדם (איור 4).
איור 4: השוואה של ניתוחים 2D and 3D על מבנה כלי השיט. (א) האפקט של תמונה מוקרנת מרבי על התמונות. (B) התוצאות האנליטיות על ידי תוכנת 2D (ראה טבלה של חומרים). במיוחד, הקווים האדומים מציינים שלד שנבחר, בעוד נקודות כחולות מציינות מיתוג נקודות. (ג) אנליטית התוצאות על ידי תוכנת תלת-ממד (ראה טבלה של חומרים). האזור האפור הוא האזור שנבחר לצורך ניתוח. הקו הירוק מציין את מקטעי נמדד ומציינים נקודות ירוקות הצמתים נמדד. (D) השוואת כלי השיט אורך, קטע מספרים, מספרי צומת הסתעפות וצומת מסוף מספרי נותחו על ידי שיטות 2D או 3D. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
פרסומים קודמים הראו כי מחסני אדיפוז שונים בעלי מאפיינים הטרוגנית1,18. כאן אנחנו ביקשו לקבוע אם כלי הדם, סיבי עצב התערוכה דפוסים שונים בין מחסני בשיטה החדשה שפותחה שלנו. כדי להשיג זאת, נוכל לבצע שיתוף אם מכתים עם α-endomucin (עבור כלי דם), נוגדני ה-α (עבור סיבי עצב) רקמת שומן. מעניין, התוצאות הראו כי היו באופן משמעותי יותר כלי דם, סיבי עצב בעיר בת לעומת WATs (איור 5, להשוות בין נתיבים התחתון כדי מסלולים העליונה והאמצעית)
איור 5: השוואה של כלי הדם סיבי עצב רכשה ממחסני אדיפוז שונה. כולה-הר אם מכתים עם אנטי-endomucin (ירוק), אנטי-טירוזין נוגדני hydroxylase (ה) (אדום) eWAT (A, B, התמזגו ב C), ימ מ (D, E, התמזגו ב F) בת (G, H, התמזגו ב אני). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
בקרב WATs, הימ מ הציג צפיפות כלי דם גבוהה יותר מאשר eWAT (איור 5, להשוות באמצע ליין העליון). ראוי לציין, תוך סיבי העצב התרחב במקביל כלי הדם, הם לא הראה לוקליזציה שותף משמעותי (איור 5, מסלולים הממוזג). בהמשך באופן כמותי מדדנו באזור כלי השיט, מספר צמתים, ואת אורך צינור עם שיטת 2D, נמצאו תוצאות דומות כמפורט לעיל (איור 6).
איור 6: אנליזה כמותית של כלי הדם ורשתות סיבי עצב. (א) האחוז של כלי דם באזור הדגימות של eWAT, ימ מ, בת. רשתות (B) מספר צמתים כלי דם eWAT, ימ מ, בת. (ג) הספינה סה כ אורך רשתות כלי דם eWAT, ימ מ, ואת בת. (D) האחוז של נווה אזור סיבים הדגימות של eWAT, ימ מ, בת. (E) מספר צמתים של סיבי העצב eWAT, ימ מ, ואת בת. (F) סה כ אורך של סיבי עצב eWAT, ימ מ, ואת בת. הבדיקות בוצעו עם תוכנה 2D. התוצאות הושגו מן התמונות שהוצגו באיור5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
לסיכום, גישה זו בהצלחה משותפת מוכתם כלי הדם, סיבי עצב ברקמות שומן שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
רקמת שומן שיפוץ מקושר ישירות dysregulation מטבולית במהלך השמנה פיתוח1,2. אנגיוגנזה העצבוב אוהדת הן חיוניות דינמי שיפוץ תהליך2,12. לפיכך, פיתוח גישה ישימה להמחיש את כלי דם חדשים, כמו גם סיבי עצב הן חשיבות רבה. שיטות קודמות דווחו לתיעוד אנגיוגנזה רקמת שומן. עם זאת, כמה בעיות להישאר עם גישות אלה, כולל יעילות נמוכה, רזולוציה הקפדניים של רעש רקע. בינתיים, העצבוב סימפטי רק הוכר לאחרונה שלב קריטי רקמת שומן פתולוגיה14. אף-על-פי הממצאים הקשורים מעניינים, שיטות יישומית דורשות כלים מיקרוסקופיה מתקדמת, גוזלת זמן. כאן, אנו מדווחים easy-to-בצע גישה שונה מפרוטוקול הקודם שלנו על שיתוף צביעת כלי הדם ולא סימפטי סיבי עצב. מעניין, אנחנו בהצלחה את כלי הדם ואת סיבי עצב עם רזולוציה גבוהה מוכתמות ההכתמה יש תכונות דומות שדווחה בעבר תמונות18.
אנחנו קודם לכן מוכתמת כלי הדם ברקמות adipose אימונוהיסטוכימיה או immunofluorescence עם הנוגדן α-CD31, סמן של תאי אנדותל, פרפין-מוטבע שקופיות8,13,20. בעוד השיטה מאפשרת לנו להבחין בין צפיפות כלי דם בין קבוצות שונות, כלי microvascular זה היו מוכתמים חיובי היו לא מלאה. כאן בחרנו בשיטה כולה-הר וביצע אם מכתים עם נוגדן α-endomucin, עוד סמן על כלי הדם. מתוך תפיסה זו ממוטבת, הצלחנו להשיג מכתים עם יותר כלי דם, כלי microblood במיוחד. יתר על כן, בשיטה זו, מאז נמנענו צעדים כגון קיבוע ההטמעה והשיוך פורמלין פרפין, אשר יש פוטנציאל לפגום את תקינות כלי הדם, השגנו תמונות עם רזולוציה גבוהה יותר וכלי שלם יותר. המבנה unimpaired של כלי נוסף אפשר לנו למדוד ולהשוות את אורכי, מסעף ואזורי. ראוי לציין, הוספנו שלב ניקוי עם גליצרול, חתיכות רקמה יכול להיות שקוף יותר, שלב זה פשוט אבל קריטי משמעותי משופר היעילות של ה18,מכתימים21.
עקב רמות גבוהות של השומנים תוכן בתוך רקמת שומן, אשר עלולה להגביל את הנגישות של נוגדנים לאזורים הפנימיים של הרקמה, חתכנו את מחסני לחתיכות קטנות כדי להבטיח נוגדן נאותה מחייב החלבונים היעד. לכן, השיטה שלנו כתמי בהצלחה יותר כלי דם, סיבי עצב מאשר כתמים על כל רקמות. עם זאת, הוא עלול לאבד מידע מרחבי, ומכאן להשפיע על השלמות של סיבי העצב. כדי לפתור את הבעיה לכאורה ולהבטיח שהתמונות דומות בין עכברים בודדים, הוא הציע לאסוף את חתיכות קטנות מן האזורים זהה ב- מחסני אדיפוז. אם נוסף דרוש יותר מידע מרחבי, צריכה להתקבל גדולים יותר עבור צביעת. עבור מדגמים גדולים, קיבוע יותר פעמים עם מינונים גבוהים יותר של FPA, ריכוז גבוה של חומרי ניקוי עבור permeabilization, ייתכן שיהיה צורך תקופות ארוכות יותר של נוגדן הדגירה.
העצבוב רקמת שומן נחקר לאחרונה. טכניקות מתקדמות מרובים הוחלו להמחיש סיבי עצב14,17. שיטות אלה הם יקרים או זמן רב. כאן, אנחנו פשוט לבצע אם הכתם עם ה-α (סמן העצבים הסימפתטית), בהצלחה צבעונית סיבי העצב סימפטי באיכות גבוהה. יותר חשוב לנו לבצע ההכתמה במשותף עם α-endomucin, ה-α לחקור איך כלי הדם המרצד בסיבי העצבים הסימפתטית במהלך שיפוץ רקמת שומן.
ראוי לציין, השווינו את התוצאות מניתוחי 2D and 3D באמצעות תוכנות שונות. נמצא כי בעוד תמונות 3D מספק מידע מפורט יותר מבניים, שתי השיטות האנליטיות לא הראה הבדל משמעותי מבחינת האורך, הסתעפות של כלי. בסופו של דבר, בעת ניתוח בשיטת תלת-ממד, התוכנה עצמה עשויה לזהות כמה אותות כוזבים צריכים להיות מותאמים באופן ידני. בהתחשב בכך התוכנה 2D מיועד בכוונה כלי ניתוח, ובכך הוא הציע להשתמש בשיטה זו למדידת באופן כמותי את המבנה של כלי.
בשיטה זו, כלי דם, סיבי עצב ברקמת שומן שונים היו שיתוף מוכתם, שלהם צפיפויות, מסעף אורכי היו לעומת19. התברר כי כלי הדם והן סיבי עצב הם הרבה יותר עבה בעיר בת לעומת וואט, רומז בת הוא מחסן אדיפוז פעיל יותר סמויה. יתר על כן, כלי דם וצפיפות עצב את הימ מ היו גבוהים יותר מאשר eWAT, המציינת שונים הוואטים יש פרופילים שיפוץ שונים.
לסיכום, בשיטה זו ביעילות משותפת כתמי הדם של סיבי עצב רקמת שומן5 יתר על כן, הוא משמש כלי שימושי עבור לימוד השינויים הדינמיים של רקמת שומן במהלך הפיתוח השמנת יתר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) מענק R01DK109001 (K.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 805-545-180 | Lot: 116969 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Lot: 121944 |
| Amira 6.0 | Thermo Fisher Scientific | Licensed software | |
| Angio tool | National Institutes of Health | Open source software https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home |
|
| Anti-mouse endomucin antibody | R&D research system | AF4666 | Lot: CAAS0115101 |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | Pel Freez Biologicals | P40101-150 | Lot: aj01215y |
| Cover glasses high performance, D = 0.17 mm | Zeiss | 474030-9020-000 | |
| Cytoseal 280 | Thermo Fisher Scientific | 8311-4 | High-viscosity medium |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | |
| Paraformaldehyde,16% | TED PELLA | 170215 | |
| Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep | INVITROGEN | P24744 | Silicone isolator |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| SEA BLOCK Blocking Buffer | Thermo Fisher Scientific | 37527X3 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | |
| Tissue Path IV Tissue Cassettes | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Triton Χ-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Generic term: octoxynol-9 |
| Tube rotator and rotisseries | VWR | 10136-084 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Generic term: Polysorbate 20 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. Adipose tissue remodeling and obesity. Journal of Clinical Investigations. 121 (6), 2094-2101 (2011).
- Sun, K., et al. Endotrophin triggers adipose tissue fibrosis and metabolic dysfunction. Nature Communication. 5, 3485 (2014).
- Zhao, Y., et al. Divergent functions of endotrophin on different cell populations in adipose tissue. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 311 (6), E952-E963 (2016).
- Zhao, Y., et al. Transient Overexpression of VEGF-A in Adipose Tissue Promotes Energy Expenditure via Activation of the Sympathetic Nervous System. Molecular and Cellular Biology. , (2018).
- Xue, Y., et al. Hypoxia-independent angiogenesis in adipose tissues during cold acclimation. Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).
- Chen, S., et al. LncRNA TDRG1 enhances tumorigenicity in endometrial carcinoma by binding and targeting VEGF-A protein. BBA Molecular Basis of Disease. 1864 (9 Pt B), 3013-3021 (2018).
- Sun, K., et al. Dichotomous effects of VEGF-A on adipose tissue dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (15), 5874-5879 (2012).
- During, M. J., et al. Adipose VEGF Links the White-to-Brown Fat Switch With Environmental, Genetic, and Pharmacological Stimuli in Male Mice. Endocrinology. 156 (6), 2059-2073 (2015).
- Elias, I., et al. Adipose tissue overexpression of vascular endothelial growth factor protects against diet-induced obesity and insulin resistance. Diabetes. 61 (7), 1801-1813 (2012).
- Sung, H. K., et al. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17 (1), 61-72 (2013).
- Cao, Y. Angiogenesis and vascular functions in modulation of obesity, adipose metabolism, and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 18 (4), 478-489 (2013).
- Sun, K., et al. Brown adipose tissue derived VEGF-A modulates cold tolerance and energy expenditure. Molecular Metabolism. 3 (4), 474-483 (2014).
- Zeng, W., et al. Sympathetic neuro-adipose connections mediate leptin-driven lipolysis. Cell. 163 (1), 84-94 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Berry, R., et al. Imaging of adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).
- Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
- An, Y. A., et al. Angiopoietin-2 in white adipose tissue improves metabolic homeostasis through enhanced angiogenesis. eLife. 6, (2017).
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
