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Immunology and Infection

सह दाग रक्त वाहिकाओं और वसा ऊतक में तंत्रिका तंतुओं

Published: February 13, 2019 doi: 10.3791/59266
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Center for Metabolic and Degenerative Diseases, the Brown Foundation of Institute of Molecular Medicine, University of Texas Health Science Center at Houston, 2Microscopy Core, the Brown Foundation of Institute of Molecular Medicine, University of Texas Health Science Center at Houston

Summary

नई रक्त वाहिका गठन और सहानुभूति इन्नेर्वतिओन वसा ऊतक remodeling में निर्णायक भूमिका निभाते हैं । हालांकि, वहां तकनीकी मुद्दों visualizing और मात्रात्मक वसा ऊतक मापने में रहते हैं । यहाँ हम सफलतापूर्वक लेबल और मात्रात्मक विभिन्न वसा ऊतकों में रक्त वाहिकाओं और तंत्रिका तंतुओं के घनत्व तुलना करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं ।

Abstract

हाल के अध्ययनों में मोटापे के विकास के दौरान वसा ऊतक remodeling में angiogenesis और सहानुभूति इन्नेर्वतिओन की महत्वपूर्ण भूमिका पर प्रकाश डाला है । इसलिए, वसा ऊतक में गतिशील परिवर्तन दस्तावेज़ के लिए एक आसान और कुशल विधि विकसित करना आवश्यक है । यहां, हम एक संशोधित immunofluorescent दृष्टिकोण का वर्णन है कि कुशलता से सह दाग रक्त वाहिकाओं और वसा ऊतकों में तंत्रिका तंतुओं । पारंपरिक और हाल ही में विकसित तरीकों की तुलना में, हमारे दृष्टिकोण का पालन करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है और उच्च घनत्व और कम पृष्ठभूमि के साथ रक्त वाहिकाओं और तंत्रिका तंतुओं लेबलिंग में अधिक कुशल. इसके अलावा, छवियों के उच्च संकल्प आगे हमें सही जहाजों के क्षेत्र को मापने के लिए अनुमति देता है, शाखाओं में बंटी की राशि है, और खुला स्रोत सॉफ्टवेयर के द्वारा फाइबर की लंबाई । एक प्रदर्शन के रूप में हमारे विधि का उपयोग कर, हम बताते है कि ब्राउन वसा ऊतक (चमगादड़) रक्त वाहिकाओं और सफेद वसा ऊतक (वाट) की तुलना में तंत्रिका तंतुओं की उच्च मात्रा में शामिल हैं । हम आगे पाते है कि वाटों के बीच, चमड़े के नीचे वाट (स्वात) और अधिक रक्त वाहिकाओं और epididymal वाट (eWAT) की तुलना में तंत्रिका तंतुओं है । हमारे विधि इस प्रकार वसा ऊतक remodeling की जांच के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है ।

Introduction

वसा ऊतक कुंजी चयापचय और अंत में स्रावी कार्यों1. यह गतिशील रूप से फैलता है या अलग पोषक तत्वों के जवाब में सिकुड़ती2तनाव । angiogenesis, फाइब्रोसिस, और स्थानीय भड़काऊ microenvironments2,3,4का आकार देने सहित सक्रिय ऊतक remodeling प्रक्रिया के कई शारीरिक रास्तों/ कुछ शारीरिक उत्तेजनाओं, जैसे कि शीत जोखिम और व्यायाम, सहानुभूति सक्रियण ट्रिगर हो सकता है, जो अंततः नए रक्त वाहिका गठन और वसा ऊतकों में सहानुभूति इन्नेर्वतिओन की ओर जाता है5,6. इन remodeling प्रक्रियाओं को कसकर इंसुलिन संवेदनशीलता सहित प्रणालीगत चयापचय परिणामों के लिए लिंक कर रहे हैं, प्रकार की पहचान 2 मधुमेह2. इस प्रकार, इन रोग परिवर्तन के दृश्य पूरे वसा ऊतकों की स्वस्थ स्थिति को समझने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है ।

Angiogenesis नए रक्त वाहिनियों के गठन की प्रक्रिया है. के बाद से रक्त वाहिकाओं ऑक्सीजन प्रदान करते हैं, पोषक तत्वों, हार्मोन, और ऊतकों को विकास कारकों, angiogenesis वसा ऊतक remodeling है, जो विभिंन तकनीकों6,7 के साथ प्रलेखित किया गया है में एक महत्वपूर्ण कदम माना गया है, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. हालांकि, वहां छवियों, immunostaining की दक्षता, और पोत घनत्व के ठहराव के लिए तरीकों के संकल्प के बारे में सवाल रहते हैं । नए रक्त वाहिका गठन की तुलना में, वसा ऊतक में इन्नेर्वतिओन एक लंबे समय के लिए आंका गया है । हाल ही में, Zeng एट अल। 14 उन्नत intravital दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी का इस्तेमाल किया और दिखाया कि adipocytes तंत्रिका तंतुओं की परतों से घिरे हुए हैं14. तब से, शोधकर्ताओं ने वसा ऊतक फिजियोलॉजी के विनियमन में सहानुभूति इन्नेर्वतिओन की निर्णायक भूमिका की सराहना करने के लिए शुरू कर दिया है । इस प्रकार, वसा तंत्रिका इन्नेर्वतिओन दस्तावेज़ के लिए एक आसान और व्यावहारिक दृष्टिकोण विकसित करना महत्वपूर्ण है ।

यहां, हम सह के लिए एक अनुकूलित विधि रिपोर्ट रक्त वाहिकाओं और तंत्रिका तंतुओं के दाग हमारे पिछले प्रोटोकॉल के आधार पर । इस विधि के साथ, हम शोर पृष्ठभूमि के बिना रक्त वाहिकाओं और तंत्रिका तंतुओं की स्पष्ट छवियों को प्राप्त कर सकते हैं । इसके अलावा, हम एक संकल्प है कि खुला स्रोत सॉफ्टवेयर के साथ घनत्व की मात्रात्मक माप प्रदर्शन के लिए पर्याप्त उच्च है प्राप्त करते हैं । इस नए दृष्टिकोण का उपयोग करके, हम सफलतापूर्वक संरचनाओं और विभिन्न वसा डिपो में रक्त वाहिकाओं और तंत्रिका तंतुओं के घनत्व की तुलना कर सकते हैं ।

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Protocol

पशु विषयों से युक्त सभी प्रक्रियाओं ह्यूस्टन में टेक्सास स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र के विश्वविद्यालय के पशु कल्याण समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है (पशु प्रोटोकॉल संख्या: AWC-18-0057) ।

1. रिएजेंट तैयारी

  1. 1x फॉस्फेट-खारा (पंजाब, पीएच ७.४): 1x पंजाब के 1 एल बनाने के लिए, NaCl, KCl के ०.२ ग्राम, एनए2HPO4, और KH2पीओ4 के ०.२४ ग्राम के 8 जी भंग पानी की ८०० मिलीलीटर में । ७.४ के लिए पीएच समायोजित करें और आसुत जल के साथ भरने के लिए 1 एल के एक अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए ।
  2. 1x पंजाबन में 1% paraformaldehyde (1% पीएफए, wt/vol): ५० मिलीलीटर के अंतिम खंड को प्राप्त करने के लिए, 16% पीएफए की ३.१२५ मिलीलीटर ( सामग्री की तालिकादेखें) को 1x पंजाबियों की ४६.८७५ मिलीलीटर में जोड़ें । अच्छी तरह से मिलाएं और बाद में उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    सावधानी: Paraformaldehyde विषाक्त है । सभी प्रक्रियाओं एक धुएं हुड के नीचे किया जाना चाहिए सांस लेना और त्वचा से बचने के लिए संपर्क करें ।
  3. ०.१% polysorbate 20 ( सामग्री की तालिकादेखें) 1x पंजाब में (1x PBST, pH ७.४, vol/): ५० मिलीलीटर के अंतिम खंड को प्राप्त करने के लिए, polysorbate 20 के ०.०५ मिलीलीटर को जोड़ने 1x पंजाब के ४९.९५ मिलीलीटर । भंवर और 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  4. 1% octoxynol-9 ( सामग्री की तालिकादेखें) 1x पंजाब में (1x पंजाब-TX, pH ७.४, vol/): 10 मिलीलीटर के अंतिम खंड को प्राप्त करने के लिए, octoxynol-9 के ०.१ मिलीलीटर को 1x पंजाब के ९.९ मिलीलीटर में जोड़ें । भंवर और 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  5. 2% सोडियम azide (wt vol): 2% सोडियम azide के 10 मिलीलीटर का उत्पादन करने के लिए, ०.२ ग्राम सोडियम azide के 10 मिलीलीटर 1x पंजाब के जोड़ें । अच्छी तरह से मिलाएं और बाद में उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  6. 1x पंजाब में ९०% ग्लिसरॉल (vol/10 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए, 1x पंजाबियों के 1 मिलीलीटर ग्लिसरॉल के 9 मिलीलीटर जोड़ें । भंवर और कमरे के तापमान (आरटी) में बाद में उपयोग के लिए स्टोर ।

2. पशु Ddissection और वसा ऊतक संग्रह

  1. का प्रयोग करें 6 सप्ताह पुराने C57BL/6J पुरुष चूहों । Anesthetize के साथ चूहों को isoflurane (4% – 5% प्रेरण के लिए तो 1% – रखरखाव के लिए 2%). एक बार anesthetized, संवेदनाहारी गहराई का निर्धारण करने के लिए एक पैर की अंगुली चुटकी पलटा प्रदर्शन, पेडल सजगता की कमी को देखते हुए. एक बार चूहों गहरी anesthetized हैं, काटना पहले प्रकाशित15के रूप में प्रोटोकॉल का पालन चूहों ।
  2. कुंद कैंची और छाती के सर्जिकल क्षेत्र (कोई बाल दाढ़ी की जरूरत है) निष्फल । कुंद कैंची का उपयोग ~ 2 सेमी का एक आकार के साथ पार्श्व सतह के साथ डायाफ्राम और पसलियों काटने से छाती खोलो । hemostat के साथ छाती झंडा दबाना और इसे सिर पर hemostat डाल द्वारा प्रतिबिंबित ।
  3. आईरिस कैंची के साथ छोड़ दिया निलय (~ ०.५ सेमी) में एक छोटा सा चीरा बनाओ । चीरा साइट के माध्यम से एक जैतून इत्तला दे दी छिड़काव सुई डालें और hemostat के साथ जगह में सुई टिप दबाना । एक ५० मिलीलीटर paraformaldehyde निर्धारण समाधान (1% पीएफए, पीएच ७.४) युक्त सिरिंज के लिए सुई संलग्न ।
  4. छिड़काव आउटलेट के रूप में आईरिस कैंची के साथ धारा काटने के द्वारा सही atrium खोलें । धीरे से छिड़काव शुरू और लगातार 10 मिलीलीटर के करीब एक छिड़काव दर पर सिरिंज धक्का/जब तरल पदार्थ आउटलेट से बाहर निकलने किसी भी खून का स्पष्ट है धक्का बंद करो । पूरी प्रक्रिया ~ 5 मिनट की आवश्यकता चाहिए ।
    सावधानी: पीएफए से विषाक्तता को रोकने के लिए एक धुएं डाकू के तहत इन चरणों का प्रदर्शन ।
  5. चूहों से सफेद और भूरे वसा के ऊतकों को काटना । का प्रयोग करें कैंची की मात्रा के छोटे टुकड़ों में ऊतक के नमूनों को तोड़ने के लिए लगभग 5 x 5 x 3 मिमी3। कैसेट पर ऊतक नमूनों की उचित लेबलिंग के साथ ऊतक embedding कैसेट में निष्फल चिमटी के साथ छोटे हिस्से स्थानांतरण ।
  6. निर्धारण समाधान (1x पंजाब में 1% पीएफए, पीएच ७.४) में ऊतक के नमूनों से युक्त embedding कैसेटों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 24-48 घंटे के लिए विसर्जित करें ।
    नोट: निर्धारण समाधान और निर्धारण समय ऊतकों के आकार के आधार पर बदलती हैं16,17,18.
  7. ताजा 1x पंजाबियों बफर के साथ नमूनों धो तीन बार (०.५ मिलीलीटर/
    सावधानी: एक धुएं डाकू के तहत इस कदम का प्रदर्शन । paraformaldehyde अपशिष्ट उचित रूप से खतरनाक अपशिष्ट निपटान प्रक्रियाओं के अनुसार संभाला जाना चाहिए ।
    नोट: आगे की प्रोसेसिंग के लिए ऊतकों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x पंजाबस में संग्रहित किया जा सकता है ।

3. एंटीबॉडी की मशीन

  1. निश्चित ऊतक नमूनों में लगभग 2 मिमी3 क्यूब्स निष्फल कैंची के साथ कट । permeabilization के लिए, एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में नमूने स्थानांतरण 1x पंजाबियों की 1 मिलीलीटर-TX (1% octoxynol 1x पंजाब में 9, सामग्री के लिए टेबलदेखें, पीएच ७.४) और धीरे से 1 के लिए आरटी पर ट्यूबों को घुमाएगी 18 rpm में एच ।
  2. ध्यान से आकांक्षा ने 1x पंजाब-TX को हटा दें । एक ही ट्यूबों में सीधे 1x पंजाबियों को जोड़कर 3x नमूने धो (कोई ट्यूबों बदलने की जरूरत है) । प्रत्येक धोने के दौरान, कई बार ट्यूबों पलटना ।
  3. ब्लॉकिंग के लिए, बफर अवरुद्ध (सामग्री की तालिका) के नमूनों और कोमल रोटेशन के साथ 2 एच के लिए आरटी पर मशीन के ०.५ मिलीलीटर जोड़ें ।
  4. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के ०.४ मिलीलीटर तैयार करने के लिए, विरोधी endomucin के 2 μL पतला (रक्त वाहिकाओं के मार्कर) 5 (1:200) और विरोधी के 2 μL — tyrosine hydroxylase (गु, तंत्रिका तंतुओं के मार्कर) 5 (1:200, 1 µ g/एमएल) एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका एंटीबॉडी जानकारी के लिए) में ३९६ बफ़र अवरुद्ध की μL । भंवर और नीचे स्पिन करने के लिए मात्रा ठीक है ।
  5. पहली एंटीबॉडी मशीन के लिए, ध्यान से ऊतक हिस्सा से अवरुद्ध बफर हटा दें । प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के १०० μL में जोड़ें ३.४ ट्यूबों में और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर में तैयार ।
    नोट: एंटीबॉडी कमजोर पड़ने और मशीन समय अलग एंटीबॉडी के बीच भिंन हो सकते हैं । यह माइक्रोबियल विकास को रोकने के लिए एंटीबॉडी समाधान करने के लिए ०.०२% सोडियम azide जोड़ने के लिए सिफारिश की है । सोडियम azide के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के ०.४ मिलीलीटर तैयार करने के लिए, एंटीबॉडी के 4 μL (प्रत्येक के 1 μL) और 2% सोडियम μL के 4 azide अवरुद्ध बफर के ३९२ μL में जोड़ें ।
  6. ध्यान से यदि वांछित पुनः प्रयोग के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान इकट्ठा । 1x PBST (pH ७.४, १०० µ l/धो) के साथ नमूनों को तीन बार (30 मिनट प्रत्येक) 18 rpm पर कोमल रोटेशन के साथ धो लें ।
  7. माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान की तैयारी के लिए, fluorophore के 2 μL पतला (लहर लंबाई ४९५ एनएम) संयुग्मित विरोधी बकरी आईजीजी (1:200) और μL के 2 fluorophore (तरंग लंबाई ६५० एनएम) संयुग्मित विरोधी खरगोश आईजीजी (1:200) ( सामग्री की तालिकादेखें) में ३९६ μL के बफ़र ब्लॉक कर रहा है । भंवर और स्पिन संक्षेप में सभी तरल इकट्ठा करने के लिए ।
    नोट: निंन कार्यविधियों के दौरान प्रकाश से नमूनों को सुरक्षित रखें ।
  8. दूसरी एंटीबॉडी की मशीन के लिए, नमूनों से पिछले धोने बफर निकालें । जोड़ें १०० माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के μL ट्यूबों और आरटी में 18 rpm पर कोमल रोटेशन के साथ 2 एच के लिए ।
  9. द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान को सावधानीपूर्वक निकालें । के नमूने 3x धो 1x PBST के साथ (पीएच ७.४, 30 मिनट प्रत्येक) 18 rpm में कोमल रोटेशन के साथ ।
    नोट: इस द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान का पुन: उपयोग न करें, क्योंकि यह ऊतकों द्वारा लाए गए प्राथमिक एंटीबॉडी की मात्रा का पता लगाने के साथ दूषित हो सकता है ।
  10. ऑप्टिकल क्लीयरेंस के लिए, नमूनों को ९०% ग्लिसरॉल के 1 मिलीलीटर में विसर्जित करें और नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में रखें जब तक कि वे पारदर्शी न हो जाएं ।
    नोट: विसर्जन अवधि ऊतक प्रकार और आकार पर निर्भर करता है । आम तौर पर, सफेद वसा ऊतक के 2 मिमी3 घन रातोंरात गर्मी की जरूरत है, जबकि एक ही आकार ब्राउन वसा ऊतक नमूना अब जरूरत है ।
  11. वॉल्यूम इमेजिंग के लिए एक अच्छी तरह से बनाने के लिए स्लाइड करने के लिए एक सिलिकॉन अलग का पालन करें । वैकल्पिक रूप से, स्लाइड करने के लिए पारदर्शी टेप की कई परतें अनुलग्न करें और एक वर्ग के बीच में कटौती करने के लिए एक अच्छी तरह से (चित्रा 2) बनाने के लिए ।
    नोट: नमूना आकार फिट करने के लिए अच्छी तरह से गहराई समायोजित करें । इस प्रोटोकॉल में, एक 1 मिमी अच्छी तरह से गहराई का उपयोग किया जाता है ।
  12. ध्यान से अच्छी तरह से नमूने हस्तांतरण और बढ़ते मध्यम ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ भरें । सतह पर एक कवर पर्ची रखना और उच्च चिपचिपापन मध्यम के साथ कवर पर्ची के कोनों सील ( सामग्री की तालिकादेखें) । अंधेरे में आरटी पर 24 ज के लिए बढ़ते मध्यम इलाज करते हैं ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि नमूना और कवर स्लिप के बीच कोई रिक्ति नहीं बची है. कवर स्लिप के नीचे बुलबुले से बचें । नमूनों पर अत्यधिक दबाव रखने से बचें ।

4. छवि अधिग्रहण

  1. अधिग्रहण Z-ढेर छवियां (4.2 कदम का उल्लेख-4.7) एक फोकल माइक्रोस्कोप के 20x उद्देश्य के साथ/
  2. सिस्टम प्रारंभ करें । <विन्यास> टैब पर क्लिक करें और आर्गन लेजर और HeNe ६३३ लेजर सक्रिय. <प्राप्त> टैब पर क्लिक करें । लेजर लाइंस पैनल >दृश्यमान< में, ४८८ एनएम और ६३३ एनएम के लेजर लाइनों का चयन करने के लिए इसी तीव्रता स्लाइडर्स ऊपर ले जाएं । शुरू में, तीव्रता 20%-30% करने के लिए सेट किया जा सकता है । 488/561/633 ट्रिपल dichoric मिरर का चयन करें । सक्रिय> चेक बॉक्स < पर क्लिक करके PMTs को सक्रिय करें, ४८८ एनएम लेजर और ६३३ एनएम लेजर के लिए PMT3 द्वारा उत्साहित उत्सर्जन के लिए PMT1 का चयन । तरंग दैर्ध्य रेंज सेट करने के लिए 500 – 550 एनएम के लिए PMT1 और 650-750nm के लिए PMT3. प्रत्येक PMT के पास रंगीन आयत को डबल क्लिक करके और पॉप-अप मेनू से रंग चुनकर छवि प्रदर्शन के लिए उपयोग किए जाने वाले psudocolor का चयन करें.
  3. <लाइव> पर क्लिक करें नमूनों की छवि की जांच करने के लिए । ब्याज की XY क्षेत्र के भीतर ध्यान का एक विमान का चयन करने के लिए z-स्थिति घुंडी का प्रयोग करें । लेजर तीव्रता ट्यूनिंग, स्मार्ट लाभ और ऑफसेट द्वारा छवियों की चमक को समायोजित करें । प्रत्येक प्रतिदीप्ति चैनल के लिए, यह समायोजन <QLUT> (त्वरित लुक अप तालिका) प्रदर्शन मोड के अंतर्गत निष्पादित करें । <QLUT> बटन पर क्लिक करें QLUT मोड, जिसमें संतृप्त पिक्सल नीले रंग में प्रदर्शित करने के लिए उपयुक्त चमक स्तर की सेटिंग सहायता में प्रवेश कर रहे हैं । pseudocolor प्रदर्शन मोड पर वापस जाने के लिए <QLUT> बटन पर दो बार क्लिक करें ।
    नोट: सेटिंग के संख्यात्मक मान प्रत्येक प्रयोग के बीच भिन्न हो सकते हैं.
  4. स्कैनिंग करते समय, Z-स्थिति घुंडी उल्टी की योजना के लिए ब्याज की मात्रा के एक छोर पर ध्यान केंद्रित करने के लिए ले जाने के लिए बारी है और फिर स्कैनिंग अंत स्थिति सेट करने के लिए <अंत> arrowhead पर क्लिक करें । तो, ब्याज की मात्रा के दूसरे छोर करने के लिए नमूना के माध्यम से ध्यान के विमान को स्थानांतरित करने के लिए Z-स्थिति घुंडी दक्षिणावर्त बारी और फिर < पर क्लिक करें > स्कैनिंग शुरू स्थिति स्थापित करने के लिए arrowheadशुरूकरते हैं ।
    नोट: विभिंन नमूनों के बीच तुलना के लिए, अलग नमूनों के लिए एक ही Z-मात्रा परिभाषित करें ।
  5. z-चरण आकार को 3 µm में समायोजित करें । १०२४ x १०२४, १०० हर्ट्ज की गति, और 2 की पंक्ति औसत का एक स्वरूप का चयन करके छवि गुणवत्ता बदलें ।
  6. z-स्टैक छवि प्राप्ति आरंभ करने के लिए> < प्रारंभ करें चुनें.
  7. अधिग्रहित की गई छवि स्टैक की अधिकतम प्रोजेक्शन के लिए, <प्रक्रिया> टैब पर क्लिक करें और फिर <टूल>, <3d प्रोजेक्शन> चुनें और विधि सूची में <अधिकतम> दर्ज करें बिना X, Y और Z. Set करने के लिए परिवर्तन <थ्रेशोल्ड0 > । < पर क्लिक करें >लागू होतेहैं । Z-मात्रा की अधिकतम तीव्रता एक 2d छवि है जो (चित्र 4a) दिखाया जाएगा में खड़ी हो जाएगी ।

5. रक्त वाहिका और तंत्रिका फाइबर नेटवर्क का विश्लेषण

  1. खुला स्रोत सॉफ्टवेयर के माध्यम से 2d छवियों का विश्लेषण (सामग्री की तालिका देखें)19
    1. सॉफ़्टवेयर में स्टैक्ड छवियां खोलें । पोत व्यास और तीव्रता समायोजित जब तक सभी पोत संरचनाओं को ठीक से चुना जा सकता है (चित्रा 4B) ।
    2. विश्लेषण चलाएं चुनें और सॉफ़्टवेयर के मार्गदर्शन के बाद डेटा निर्यात करें ।
  2. लाइसेंस प्राप्त सॉफ्टवेयर के माध्यम से 3 डी छवियों का विश्लेषण (सामग्री की तालिका देखें)
    1. सॉफ्टवेयर के साथ छवियों के कच्चे डेटा खोलें । सीमा और अन्य पैरामीटर्स को तब तक समायोजित करें जब तक कि z-वॉल्यूम की प्रत्येक परत में पोत संरचनाएं ठीक से चयनित न हों (सॉफ़्टवेयर में विवरण के लिए उपयोगकर्ता मार्गदर्शिका देखें) (चित्र 4c) ।
    2. चयनित सेगमेंट वर्णों का विश्लेषण करें और सॉफ़्टवेयर के मार्गदर्शन के बाद डेटा को निर्यात करे.

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Representative Results

epididymal सफेद वसा ऊतक के बाहर क्षेत्र (eWAT), dorsolumbar चमड़े के नीचे के क्षेत्र में सफेद वसा ऊतक (स्वाट), और interscapular ब्राउन वसा ऊतक (बैट) के औसत दर्जे क्षेत्र एकत्र किए गए । इन ऊतकों को एकत्रित करने के लिए स्थान चित्रा 1में दर्शाया गया है ।

Figure 1
चित्र 1: चमड़े के नीचे सफेद वसा ऊतक (स्वात), epididymal सफेद वसा ऊतक (eWAT), और ब्राउन वसा ऊतक (बैट) के एनाटॉमी नमूनों को इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया क्षेत्रों को इंगित करता है । (क) सफ़ेद डैश्ड रेखाओं द्वारा उल्लिखित क्षेत्र स्वात का प्रतिनिधित्व करते हैं, और सफ़ेद तारांकन हाइलाइट किया गया स्थान स्वात को एकत्रित करने के लिए साइट है । काली डैश्ड रेखाओं द्वारा बाह्यरेखांकित क्षेत्र eWAT हैं, और eWAT एकत्रित करने के लिए काली तारांकन हाइलाइट स्थान साइट है । (ख) काली डैश्ड रेखाओं द्वारा उल्लिखित क्षेत्र चमगादड़ हैं, और टिशू संग्रह क्षेत्र तारांकन चिह्न द्वारा हाइलाइट किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

पूरे-माउंट धुंधला होने के बाद, ऊतक हिस्सा 1 मिमी गहराई (चित्रा 2) की एक अच्छी तरह से बढ़ रहे थे

और फोकल माइक्रोस्कोप के साथ छवि । हम पहले छवियों की गुणवत्ता पर ९०% ग्लिसरॉल मशीन के साथ समाशोधन कदम के प्रभाव का परीक्षण किया । हमने पाया है कि अधिक रक्त वाहिकाओं सकारात्मक α के साथ दाग थे-ग्लिसरॉल-endomucin एंटीबॉडी में स्वाट, सुझाव है कि समाशोधन कदम रक्त वाहिकाओं के धुंधला पूरा करने के लिए महत्वपूर्ण है (चित्रा 3, पैनल ए और बी की तुलना) ।

Figure 2
चित्रा 2: खंड इमेजिंग के लिए कुओं के चित्र । (a) एक सिलिकॉन के साथ एक स्लाइड के आरेख को अलग । (ख) हमारी प्रयोगशाला द्वारा किए गए टेप के कई परतों के साथ एक अच्छी तरह से चित्र । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: यदि रक्त वाहिकाओं की छवियों की तुलना acquiredwith या ऑप्टिकल समाशोधन ९०% ग्लिसरॉल के साथ कदम के बिना । (क) पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस (यदि) विरोधी के साथ धुंधला-endomucin एंटीबॉडी (हरी) स्वात में । नमूना ऑप्टिकल क्लियरिंग चरण (चरण ३.१०) के अधीन नहीं था । (ख) पूरे-माउंट अगर विरोधी के साथ धुंधला endomucin एंटीबॉडी स्वात में । नमूना ऑप्टिकल समाशोधन चरण (चरण ३.१०) से पहले बढ़ते कदम (चरण ३.११ और ३.१२) के अधीन किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

हालांकि, ग्लिसरॉल के साथ समाशोधन कदम अखंडता या रक्त वाहिकाओं के आकार (चित्रा 3)को प्रभावित नहीं किया । इन लाभकारी प्रभावों को देखते हुए, निम्न प्रयोगों में, समाशोधन चरण का प्रदर्शन किया गया.

हम आगे अलग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 2d और 3 डी विश्लेषण के परिणामों की तुलना में ( सामग्री की तालिकादेखें) । हमने पाया है कि, जबकि 3 डी छवियां जाहिरा तौर पर और अधिक विस्तृत संरचनात्मक जानकारी प्रदान की, दो विश्लेषणात्मक तरीके अंततः लंबाई और जहाजों की शाखा संख्या के मामले में महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखा था (चित्रा 4) ।

Figure 4
चित्रा 4: पोत संरचना पर 2d और 3d विश्लेषण की तुलना । (क) छवियों पर अधिकतम प्रोजेक्शन का प्रभाव । (ख) 2d सॉफ्टवेयर द्वारा विश्लेषणात्मक परिणाम ( सामग्री की तालिकादेखें) । नीले डॉट्स ब्रांडिंग अंक का संकेत है, जबकि विशेष रूप से, लाल लाइनों, चयनित कंकाल इंगित करते हैं । (ग) 3 डी सॉफ्टवेयर द्वारा विश्लेषणात्मक परिणाम ( सामग्री की तालिकादेखें) । धूसर क्षेत्र विश्लेषण के लिए चयनित क्षेत्र है । हरे रंग की रेखा मापा क्षेत्रों इंगित करता है और हरे डॉट्स मापा नोड्स संकेत मिलता है । (घ) पोत की लंबाई की तुलना, खंड संख्या, शाखाकरण नोड नंबर, और टर्मिनल नोड संख्या 2d या 3 डी तरीकों से विश्लेषण किया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

पिछले प्रकाशनों का प्रदर्शन किया है कि विभिंन वसा डिपो विषम संपत्तियों1,18के अधिकारी । यहां हम निर्धारित करने के लिए कि रक्त वाहिकाओं और तंत्रिका तंतुओं हमारे नव विकसित विधि का उपयोग कर डिपो के बीच अलग पैटर्न प्रदर्शन की मांग की । इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, हम सह प्रदर्शन अगर α-endomucin (रक्त वाहिकाओं के लिए) और α-TH (तंत्रिका तंतुओं के लिए) वसा ऊतक में एंटीबॉडी के साथ धुंधला । दिलचस्प है, परिणाम से पता चला कि वहां काफी अधिक रक्त वाहिकाओं और वाटों की तुलना में बल्ले में तंत्रिका तंतुओं थे (5 चित्रा, ऊपर और मध्य गलियों के लिए नीचे गलियों की तुलना)

Figure 5
चित्रा 5: रक्त वाहिकाओं और तंत्रिका फाइबर अलग वसा डिपो से अधिग्रहीत की तुलना. पूरे माउंट अगर विरोधी के साथ धुंधला endomucin (हरा) और विरोधी tyrosine hydroxylase (गु) (लाल) eWAT में एंटीबॉडी (ए, बी, सीमें विलय), स्वात (डी, ई, एफमें विलय) और चमगादड़ (जी, एच, में विलय I). कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

वाटों के अलावा, स्वात eWAT से उच्च रक्त वाहिका घनत्व का प्रदर्शन (5 चित्रा, मध्य लेन के बीच तुलना) । तंत्रिका तंतुओं रक्त वाहिकाओं के साथ समानांतर में विस्तार किया, जबकि नोट की, वे महत्वपूर्ण सह स्थानीयकरण (चित्रा 5, विलय लेन) नहीं दिखा था । हम आगे मात्रात्मक पोत क्षेत्र, जंक्शनों की संख्या, और 2 डी विधि के साथ ट्यूब की लंबाई मापा और ऊपर वर्णित समान परिणाम के रूप में (चित्रा 6) पाया ।

Figure 6
चित्रा 6: संवहनी और तंत्रिका फाइबर नेटवर्क का मात्रात्मक विश्लेषण. (क) eWAT, स्वात, और बैट के नमूनों में रक्त वाहिका क्षेत्र का प्रतिशत. (ख) eWAT, स्वात, और बल्ले में संवहनी नेटवर्क के जंक्शनों की संख्या । (ग) eWAT, स्वात, और बल्ले में संवहनी नेटवर्क के कुल पोत लंबाई । (घ) eWAT, स्वात और बैट के नमूनों में नेवे फाइबर क्षेत्र का प्रतिशत. (ङ) eWAT, स्वाती, और बैट में तंत्रिका तंतुओं के जंक्शनों की संख्या. (च) eWAT, स्वात, और बल्ले में तंत्रिका तंतुओं की कुल लंबाई । 2 डी सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण किया गया । चित्रा 5में प्रस्तुत चित्र से परिणाम प्राप्त हुए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

संक्षेप में, यह दृष्टिकोण सफलतापूर्वक सह-दाग रक्त वाहिकाओं और विभिन्न वसा ऊतकों में तंत्रिका तंतुओं ।

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Discussion

वसा ऊतक पुनर्मॉडलिंग सीधे मोटापा विकास के दौरान चयापचय dysregulation से जुड़ा हुआ है1,2. Angiogenesis और सहानुभूति इन्नेर्वतिओन दोनों गतिशील remodeling प्रक्रिया2,12के लिए आवश्यक हैं । इसलिए, एक लागू दृष्टिकोण विकसित करने के लिए नए रक्त वाहिकाओं कल्पना के रूप में के रूप में अच्छी तरह से तंत्रिका तंतुओं बहुत महत्व के हैं । पिछले तरीकों वसा ऊतक में angiogenesis दस्तावेजीकरण के लिए सूचित किया गया है । हालांकि, कुछ मुद्दों पर इन तरीकों के साथ रहते हैं, कम दक्षता, उपद्रव संकल्प, और शोर पृष्ठभूमि सहित. इस बीच, सहानुभूति इन्नेर्वतिओन केवल वसा ऊतक पैथोलॉजी14में एक महत्वपूर्ण कदम के रूप में हाल ही में मांयता प्राप्त किया गया है । हालांकि संबंधित निष्कर्षों दिलचस्प हैं, लागू तरीकों उंनत माइक्रोस्कोप उपकरणों की आवश्यकता है और समय लेने वाली हैं । यहां, हम सह-दाग रक्त वाहिकाओं और सहानुभूति तंत्रिका तंतुओं के लिए हमारे पिछले प्रोटोकॉल से संशोधित एक आसान अनुवर्ती दृष्टिकोण की रिपोर्ट । दिलचस्प है, हम सफलतापूर्वक रक्त वाहिकाओं और उच्च संकल्प के साथ तंत्रिका तंतुओं सना हुआ, और धुंधला पहले छवियों18की रिपोर्ट के तुलनीय गुण है ।

हम पहले α-CD31 एंटीबॉडी, endothelial कोशिकाओं के एक मार्कर के साथ immunohistochemistry या इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा वसा ऊतकों में रक्त वाहिकाओं सना हुआ, तेल पर-8,13,20स्लाइड एंबेडेड । जबकि विधि हमें विभिंन समूहों के बीच रक्त वाहिका घनत्व भेद करने की अनुमति देता है, microvascular जहाजों कि सकारात्मक दाग थे पूरा नहीं किया गया । यहाँ, हम एक पूरी-माउंट विधि चुना और एक α-endomucin एंटीबॉडी, रक्त वाहिकाओं के लिए एक और मार्कर के साथ धुंधला अगर प्रदर्शन किया. इस अनुकूलित दृष्टिकोण के साथ, हम और अधिक रक्त वाहिकाओं, विशेष रूप से microblood जहाजों के साथ दाग को प्राप्त करने में सक्षम थे । इसके अलावा, इस विधि में, के बाद से हम ऐसे आयल embedding और formalin निर्धारण, जो रक्त वाहिकाओं की अखंडता ख़राब करने की क्षमता है के रूप में कदम से परहेज, हम उच्च संकल्प और अधिक बरकरार जहाजों के साथ छवियों को प्राप्त की । जहाजों की unimpair संरचना आगे हमें मापने के लिए और उनकी लंबाई की तुलना, शाखाओं, और क्षेत्रों की अनुमति दी । ध्यान दें की, हम ग्लिसरॉल के साथ एक समाशोधन कदम जोड़ा है, तो ऊतक हिस्सा अधिक पारदर्शी हो सकता है, और यह सरल लेकिन महत्वपूर्ण कदम काफी धुंधला18,21की दक्षता बढ़ाया ।

वसा ऊतक में लिपिड सामग्री के उच्च स्तर के कारण, जो ऊतक के भीतरी क्षेत्रों के लिए एंटीबॉडी की पहुंच की सीमा हो सकती है, हम छोटे टुकड़ों में डिपो में कटौती करने के लिए पर्याप्त लक्ष्य प्रोटीन के लिए बाध्यकारी एंटीबॉडी सुनिश्चित करते हैं । इसलिए, हमारी विधि सफलतापूर्वक अधिक रक्त वाहिकाओं और पूरे ऊतकों पर दाग से तंत्रिका तंतुओं दाग । हालांकि, यह स्थानिक जानकारी खो सकते है और इसलिए तंत्रिका तंतुओं की अखंडता को प्रभावित । इस स्पष्ट मुद्दे को सुलझाने और छवियों व्यक्तिगत चूहों के बीच तुलना कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए, यह वसा डिपो में एक ही क्षेत्र से छोटे हिस्सा इकट्ठा करने का सुझाव दिया है. यदि और अधिक स्थानिक जानकारी की जरूरत है, बड़ा हिस्सा धुंधला के लिए प्राप्त किया जाना चाहिए । बड़े नमूनों के लिए, FPA की उच्च खुराक के साथ अब निर्धारण बार, permeabilization के लिए डिटर्जेंट की उच्च सांद्रता, और एंटीबॉडी गर्मी की लंबी अवधि की जरूरत हो सकती है ।

हाल ही में वसा टिशू इन्नेर्वतिओन की जांच की गई है । कई उन्नत तकनीक तंत्रिका तंतुओं14,17कल्पना करने के लिए लागू किया गया है. इन पद्धतियों या तो महंगा है या समय लेने वाली । यहां, हम सिर्फ एक अगर α के साथ दाग-गु (एक सहानुभूति तंत्रिका मार्कर) और सफलतापूर्वक एक उच्च गुणवत्ता में सहानुभूति तंत्रिका तंतुओं दाग प्रदर्शन किया । इससे भी महत्वपूर्ण बात, हम सह α-endomucin और α-गु के साथ दाग की जांच करने के लिए कैसे रक्त वाहिकाओं वसा ऊतक remodeling के दौरान सहानुभूति तंत्रिका तंतुओं के साथ साथ खेलना प्रदर्शन किया ।

नोट की, हम अलग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 2d और 3 डी विश्लेषण से परिणामों की तुलना में । यह पाया गया कि, जबकि 3 डी छवियों और अधिक विस्तृत संरचनात्मक जानकारी प्रदान की, दो विश्लेषणात्मक तरीके लंबाई और जहाजों के बंटी के मामले में महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखा था । अंततः, जब 3 डी विधि के साथ विश्लेषण, सॉफ्टवेयर ही कुछ गलत संकेत है कि मैंयुअल रूप से समायोजित करने की आवश्यकता का पता लगा सकते हैं । यह देखते हुए कि 2d सॉफ्टवेयर जानबूझकर पोत विश्लेषण के लिए डिज़ाइन किया गया है, यह इस प्रकार मात्रात्मक जहाजों की संरचना को मापने के लिए इस विधि का उपयोग करने का सुझाव दिया है ।

इस विधि के साथ, रक्त वाहिकाओं और विभिन्न वसा ऊतक में तंत्रिका तंतुओं सह दाग थे, और उनके घनत्व, शाखाओं में बंटी, और लंबाई की तुलना में थे19. यह पाया गया कि दोनों रक्त वाहिकाओं और तंत्रिका तंतुओं बहुत बल्ले में वाट की तुलना में मोटा है, सुझाव है कि चमगादड़ एक अधिक चयापचय सक्रिय वसा डिपो है । इसके अलावा, स्वात में रक्त वाहिका और तंत्रिका घनत्व eWAT की तुलना में अधिक थे, यह दर्शाता है कि अलग वाटों अलग remodeling प्रोफाइल है ।

अंत में, इस विधि कुशलता से सह दाग रक्त वाहिकाओं और वसा ऊतक5में तंत्रिका तंतुओं । इसके अलावा, यह मोटापा विकास के दौरान वसा ऊतक में गतिशील परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में कार्य करता है ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन को नेशनल इंस्टिट्यूट ऑफ हेल्थ (NIH) ग्रांट R01DK109001 (टू कृष्णसिंह) ने सपोर्ट किया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 805-545-180 Lot: 116969
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 711-605-152 Lot: 121944
Amira 6.0 Thermo Fisher Scientific Licensed software
Angio tool National Institutes of Health Open source software
https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home
Anti-mouse endomucin antibody R&D research system AF4666 Lot: CAAS0115101
Anti-tyrosine hydroxylase antibody Pel Freez Biologicals P40101-150 Lot: aj01215y
Cover glasses high performance, D = 0.17 mm Zeiss 474030-9020-000
Cytoseal 280 Thermo Fisher Scientific 8311-4 High-viscosity medium
Glycerol Fisher G33-500
Paraformaldehyde,16% TED PELLA 170215
Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep INVITROGEN P24744 Silicone isolator
ProLong Diamond Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36965 Mounting medium
SEA BLOCK Blocking Buffer Thermo Fisher Scientific 37527X3
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002-100G
Tissue Path IV Tissue Cassettes Thermo Fisher Scientific 22-272416
Triton Χ-100 Sigma-Aldrich X100 Generic term: octoxynol-9
Tube rotator and rotisseries VWR 10136-084
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379 Generic term: Polysorbate 20

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References

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Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K.… More

Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (144), e59266, doi:10.3791/59266 (2019).

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