Summary
新しい血管の形成と交感神経支配は、脂肪組織リモデリングの極めて重要な役割を果たします。しかし、可視化と脂肪組織を定量的測定の技術的な問題が残っています。ここで正常にラベルを付け、血管や脂肪組織における神経線維の密度を定量的に比較するためのプロトコルを提案する.
Abstract
最近の研究では、血管新生、脂肪組織の肥満の開発中に改造の交感神経支配の重要な役割を強調しています。したがって、脂肪組織に動的な変更を文書化する簡単で効率的な手法の開発が必要です。ここでは、効率的に汚れ血管や脂肪組織における神経線維の共同修正蛍光アプローチについて述べる。伝統的なと最近開発された方法と比較して、我々 のアプローチは比較的わかりやすいより効率良く血管と神経線維の密度は高く、少ない背景をラベリングします。さらに、さらに画像の高解像度では、オープン ソース ソフトウェアによって血管、分岐、量、繊維の長さの領域を正確に測定することが出来ます。提案手法を用いて実証、その褐色脂肪組織 (BAT) に血管や神経線維の白色脂肪組織 (WAT) と比較してより高い金額が含まれているを示す.さらに、間で WATs、皮下ワット (sWAT) はより多くの血管や精巣上体のワット (eWAT) と比較して神経線維を見つける。本手法は、したがって脂肪組織リモデリングを調査するための便利なツールを提供します。
Introduction
脂肪組織はキー代謝と内分泌機能1。それを動的に拡大または縮小に対して異なる栄養強調2。複数の生理学的なパス/ステップ成っているプロセスを改造するアクティブな組織血管新生、線維化、ローカル炎症性微小2,3,4の形成など。いくつかの物理的な刺激、寒冷、運動などは、最終的に新しい血管の形成と脂肪組織5,6の交感神経支配につながる交感神経活性化を引き起こす可能性があります。これらの改造のプロセスは、インスリン感受性、2 型糖尿病の2型の特徴を含む全身の代謝の結果にしっかりとリンクされます。したがって、これらの病理組織学的変化の可視化は、全体の脂肪組織の健康状態を理解する大切です。
血管新生は、新しい血管の形成のプロセスです。血管新生は、さまざまなテクニック6,7,と記載されているが脂肪組織のリモデリングにおける重要なステップと考えられている血管は、酸素、栄養素、ホルモン、および組織に成長因子を提供するので8,9,10,11,12,13。 ただし、イメージの解像度、免疫染色と血管密度の定量化法の効率についての質問が残っています。新しい血管の形成に比べると、脂肪質ティッシュの神経支配は、長い時間の過小に評価されています。最近では、曽ら.14使用生体 2 光子励起顕微鏡と脂肪細胞が神経線維14の層で囲まれていることを示した。それ以来、研究者は脂肪組織の生理機能の調節に交感神経支配の重要な役割を理解し始めています。したがって、ドキュメント脂肪神経に簡単で実用的なアプローチを開発する重要です。
ここでは、血管と神経線維の私達の以前のプロトコルに基づいて共同の汚損のための最適化手法を報告する.この方法では、血管と神経線維騒々しい背景なしの鮮明な画像を実現します。さらに、我々 は、オープン ソース ソフトウェアと密度の定量的測定を実行するために十分に高い解像度を取得します。この新しいアプローチを使用して、構造体と血管と異なる脂肪拠点における神経線維の密度正常に比較できます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
動物の主題を含むすべてのプロシージャは、ヒューストン動物福祉委員会のテキサス大学健康科学センターによって承認されている (動物のプロトコル番号: AWC-18-0057)。
1. 試薬の準備
- リン酸緩衝生理食塩水 (PBS、pH 7.4) x 1: 1 × PBS の 1 L をするためには、800 mL の蒸留水で KH2PO4 0.24 g の Na2HPO4、1.44 g、KCl の 0.2 g 塩化ナトリウム 8 g を溶解します。7.4 と蒸留水 1 L の最終巻を達成するために記入するために pH を調整します。
- 1 × PBS (1 %pfa、wt/巻) で 1% パラホルムアルデヒド: 50 mL の最終的なボリュームを達成するために 16% の 3.125 mL を加える PFA (材料表参照) 46.875 mL の 1x PBS に。よく混合し、後で使用するための 4 ° C で保存します。
注意:パラホルムアルデヒドは有毒であります。すべてのプロシージャは、ヒューム フード吸入を避けるために、皮膚の下に実施されなければなりません。 - 1 × PBS (PBST、pH 7.4 の巻/巻 × 1) で 0.1% ポリソルベート 20 (材料の表参照): 50 mL の最終的なボリュームを達成するためにポリソルベート 20 に 49.95 mL の 1x PBS の 0.05 mL を加えます。渦と 4 ° C、1 ヶ月でストア。
- 1 %octoxynol-9 (材料の表を参照) 1 × PBS (PBS テキサス州、pH 7.4 の巻/巻 × 1) で: 9.9 mL の 1x PBS に 0.1 mL octoxynol 9 を追加 10 mL の最終的なボリュームを達成するために。渦と 4 ° C、1 ヶ月でストア。
- 2% アジ化ナトリウム (wt/巻): 2% アジ化ナトリウム 10 mL を生成するためのアジ化ナトリウム 0.2 g を 10 mL の 1x PBS に追加。よく混合し、後で使用するための 4 ° C で保存します。
- 1 × PBS (巻/巻) で 90% のグリセロール: グリセロールの 9 mL に 1 mL の 1x PBS を追加 10 mL の最終的なボリュームを達成するために。渦と部屋の温度 (RT) 後で使用するためにストアします。
2. 動物 Ddissection と脂肪組織のコレクション
- 6 週齢の c57bl/6 j 男性マウスを使用します。イソフルラン (誘導の 4-5%、維持のため 1-2%) とマウスを麻酔します。麻酔、一度つま先ピンチ反射ペダル反射の欠如から判断すると、麻酔の深さを確認するを実行します。マウスは麻酔が深く、一度以前に発行された15としてプロトコル、マウスを解剖します。
- 鋏は使いよう 】 と胸 (髪の毛を剃る必要はありません) の外科領域を消毒します。横隔膜と鋏は使いよう 】 を使用した 〜 2 cm のサイズと外側面に沿って肋骨を切断することによって胸を開きます。止血と胸のフラグをクランプし、頭の上、止血を置くことによってそれを反映します。
- アイリス ハサミで左心室 (~0.5 cm) に小切開を確認します。切開サイトを通じてオリーブ先端灌流針を挿入し、止血の場所に針の先端をクランプします。針を含むパラホルムアルデヒド固定液 (1 %pfa、pH 7.4) 50 mL シリンジに接続します。
- セクションの切断によって灌流のコンセントのアイリス ハサミで右心房を開きます。によって血流を穏やかにスタートし、出口を出る流体が血のクリアを押し込むを止めます 10 mL/分連続灌流速度で近くに注射器を押します。全体のプロセスは、~ 5 分必要です。
注意:PFA から毒性を防ぐためにヒューム フードの下でこれらの手順を実行します。 - マウスから白と茶色の脂肪組織を解剖します。はさみを使用して、組織サンプルを塊約 5 × 5 × 3 mm3の小さな断片に分割します。小さな塊を滅菌ピンセットでカセットをカセットに組織サンプルの適切なラベリングで埋め込み組織に移転します。
- 固定の解決に組織サンプルを含む埋め込みカセットを浸す (1 %1 × PBS、pH 7.4 で PFA) 24-48 h の 4 ° C で。
注:固定の解決および固定時間の組織16,17,18のサイズも異なります。 - (0.5 mL/ウォッシュ) 回 x 3 PBS バッファー新鮮な 1 サンプルを洗います。
注意:ヒューム フードの下でこの手順を実行します。パラホルムアルデヒドの廃棄物は、有害廃棄物の廃棄手順によると適切に処理する必要があります。
注:組織は、さらなる処理のための 4 ° C で 1 × PBS に格納できます。
3. 抗体の孵化
- 固定ティッシュ サンプルを約 2 mm3キューブに滅菌はさみでカットします。透過性、1 の 1 mL を含む 1.5 mL チューブにサンプルを転送 PBS テキサス州 x (1 × PBS で 1% octoxynol 9 参照用テーブル、pH 7.4) と優しく 18 rpm で 1 h の RT でチューブを回転します。
- 丁寧に、1 x の吸引によってテキサス州の PBS。サンプル 3 を洗って同じ管 (チューブを変更する必要はありません) に直接 1 × PBS を加えることによって x。各洗浄中に何回かチューブを反転します。
- ブロック、0.5 mL のブロック バッファー (資材表) をサンプルに追加し、RT で緩やかな回転で 2 時間インキュベートします。
- 一次抗体溶液 0.4 mL を準備、希釈する反 - endomucin (血管のマーカー) 5 (1: 200) の 2 μ L とアンチの 2 μ L-チロシン水酸化酵素 (TH、神経線維のマーカー) 5 (1: 200、1 μ G/ml) 抗体 (材料表抗体について) ブロック バッファーの 396 μ L に。渦とスピン回復ボリューム ダウン。
- 最初の抗体の孵化の組織塊からブロック バッファーを慎重に取り外します。チューブに手順 3.4 で一次抗体溶液の 100 μ L を追加し、4 ° C で一晩インキュベートします。
注:異なる抗体抗体の希釈と潜伏期間が異なる場合があります。微生物の増殖を防ぐために抗体溶液を 0.02% アジ化ナトリウムを追加することをお勧めします。アジ化ナトリウムと一次抗体溶液 0.4 mL を準備するには、ブロック バッファーの 392 μ L に抗体 (それぞれの 1 μ L) の 4 μ L と 2% アジ化ナトリウムの 4 μ L を追加します。 - 必要な場合、慎重に再利用のための一次抗体ソリューションを収集します。1 サンプルを洗う x PBST (pH 7.4 では、100 μ L/ウォッシュ) 18 rpm で緩やかな回転で (各 30 分) を 3 回します。
- 二次抗体の解決、fluorophore (波長さ 495 nm) の 2 μ L 希釈調製共役抗やぎ igg 抗体 (レバレッジ) と蛍光 (波長さ 650 nm) の 2 μ L 共役抗うさぎ IgG (1: 200) (材料の表を参照してください) の 396 μ L にバッファーを妨げる。渦とすべての液体を収集するために、簡単にスピンします。
注:以下の手順で、光からサンプルを保護します。 - 2 番目の抗体の孵化のサンプルから最後の洗浄バッファーを削除します。チューブに二次抗体溶液 100 μ L を追加し、, RT で 2 h 18 rpm で緩やかな回転で。
- 二次抗体溶液を慎重に取り外します。サンプル 3 を洗って 1 x 18 rpm で緩やかな回転で x PBST (pH 7.4 では、各 30 分)。
注:一次抗体、組織によってもたらされる微量で汚染する可能性があります、この二次抗体の解決を再利用しません。 - 光のクリアランスのため 90% のグリセロールの 1 mL に試料を浸すし、透明になるまで、4 ° C で暗闇の中でサンプルを保ちます。
注:浸漬時間は、組織の種類とサイズによって異なります。通常、白色脂肪組織の 2 mm3キューブは、同じサイズ褐色脂肪組織サンプル ニーズ長い間の一晩インキュベートを必要があります。 - ボリューム イメージングのための井戸を作成するスライドにシリコーン アイソレータを遵守します。また、スライドに透明テープのいくつかの層を添付し、井戸を作成する中間の正方形をカット(図 2).
注:サンプル サイズに合わせて、井戸の深さを調整します。このプロトコルでは 1 mm も深さが使用されます。 - 慎重に井戸にサンプルを転送し、メディアをマウントでそれを埋める (材料の表を参照してください)。表面のカバー スリップを置くし、高粘度の媒体とカバー スリップの隅をシール (材料の表を参照してください)。暗闇の中で常温 24 h の取付中治療をしましょう。
注:サンプルとカバー スリップの領域が残っていないことを確認します。カバー スリップの下で泡を避けるため。サンプルに過度の圧力を配置しないでください。
4. 画像の取得
- 共焦点顕微鏡/ソフトウェアの 20 × 対物 z 画像 (4.2 – 4.7 の手順を参照) を取得します。
- システムを起動します。<設定> タブをクリックし、アルゴン レーザーや 633 HeNe レーザーをアクティブにします。<取得>] タブをクリックします。<表示> レーザー線パネルの上に移動対応する強度スライダー 488 のレーザー ラインを選択する nm と 633 nm。当初は、強度は 20-30% を設定できます。488/561/633 トリプル dichoric ミラーを選択します。タマを 633 nm レーザーの励起 488 nm レーザーと PMT3 による排出の PMT1 を選択する <アクティブ> のチェック ボックスをクリックしてアクティブにします。500-550 nm に PMT3 のための PMT1 と 650-750 nm の波長範囲を設定します。ダブル各 PMT の横に色付きの四角形をクリックすると、ポップアップ メニューから色を選択することによって、イメージの表示に使用する psudocolor を選択します。
- <ライブ> サンプルの画像をチェックするをクリックします。Z 位置のノブを使ってな XY 領域内でフォーカスの面を選択します。レーザー光源の強度、スマートのゲインとオフセットの調整によって、画像の明るさを調整します。各蛍光チャネル <QLUT> (クイック Look Up Table) ディスプレイ モードでこの調整を実行します。適切な明るさの設定を支援するために青色で表示される飽和ピクセルの QLUT モードを入力するには、<QLUT> ボタンをクリックします。擬似カラー表示モードに戻るに <QLUT> ボタンを 2 回クリックします。
注:設定の数値は、各実験の間で異なる場合があります。 - スキャン中に回して Z 位置ノブにフォーカスの計画を興味のボリュームの一方の端に移動し、[スキャンの終了位置を設定するのには <終了> 矢印をクリックします。時計回りに関心のボリュームのもう一方の端に試料をフォーカスの面を移動する Z 位置のノブを入れます、スキャンの開始位置を設定する <開始> 矢印上をクリックします。
注:異なるサンプル間の比較、異なるサンプルの同じ Z ボリュームを定義します。 - 3 μ m 1024 x 1024 の形式を選択することにより画像の品質の変更、100 Hz の速度と 2 の線のなかに z ステップ サイズを調整します。
- 選択 <開始 > z スタック画像集録を開始します。
- 取得した画像のスタックの最大投影の <プロセス> タブをクリックし、[<ツール> <3 D 投影> を選択し、入力 X に <最大> 変更せずメソッド リスト Y と Z. セット<しきい値> 0 に。<適用> をクリックします。Z ボリュームの最大強度は、(図 4 a) 表示される 2D イメージに積み上げされます。
5. 血管と神経線維ネットワークの解析
-
オープン ソース ソフトウェアを介して画像の 2次元解析 (材料の表を参照)19
- ソフトウェアのスタックのイメージを開きます。容器構造を正しくすることができますすべての選択 (図 4 b) まで血管径と強度を調整します。
- 分析を実行を選択し、ソフトウェアのガイダンスに従ってデータをエクスポートします。
-
ライセンスされたソフトウェアを介して画像 3 D の解析 (材料の表を参照)
- ソフトウェアと画像の raw データを開きます。Z ボリュームのそれぞれの層で血管構造が正しく選択されるまで、しきい値およびその他のパラメーターを調整する (詳細については、ソフトウェアのユーザー ガイドを参照してください) (図 4)。
- 選択したセグメント文字を分析し、ソフトウェアのガイダンスに従ってデータをエクスポートします。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
精巣上体の白色脂肪組織 (eWAT) の遠位領域、内側部硬度皮下白色脂肪組織 (sWAT)、肩甲骨間褐色脂肪組織 (BAT) の内側の領域が採集されました。これらの組織を収集するための場所は、図 1に示されます。
図 1: 皮下白色脂肪組織 (sWAT)、精巣上体の白色脂肪組織 (eWAT) および褐色脂肪組織 (BAT) の解剖学は、サンプルを収集するために使用される領域を示します。(A) 地域枠は白破線を表す sWAT と強調した白のアスタリスクの位置は sWAT の収集のためのサイト。EWAT、黒の破線で示した地域は、強調表示されます黒アスタリスク場所 eWAT を収集するサイトでは。(B) 黒の破線で示した領域が、バットとアスタリスクによって組織コレクション領域が強調表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
井戸の深さ 1 mm (図 2) に搭載され組織塊全取り付ける染色後
共焦点顕微鏡画像。まず、画像の品質に 90% のグリセロールの孵化と清算のステップの効果をテストしました。清算のステップは血管の完全な染色の重要なことを示唆しているより多くの血管がグリセロール培養 sWAT の α endomucin 抗体で染色積極的にことがわかった (図 3パネル A と B を比較)。
図 2: ボリューム イメージング用井戸の図。(A)シリコーン アイソレータとスライドの図。(B)研究室によって作られたテープの複数の層で井戸の図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 場合の比較画像 90% グリセロールと光クリア ステップの有無血管ますの。(A)全体マウント蛍光抗体法 (IF) sWAT の抗 endomucin 抗体 (緑) で染色します。サンプル光クリア ステップ (ステップ 3.10) にさらされなかった。(B)全取り付ける場合は sWAT の抗 endomucin 抗体を用いた染色します。このサンプルは、取り付け手順 (手順 3.11 と 3.12) の前に光のクリア ステップ (ステップ 3.10) にさらされました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
ただし、整合性または血管(図 3)の形状、グリセロールと清算のステップは影響しなかった。次の実験でこれらの有益な効果を与え、清算のステップを行った。
我々 はさらに別のソフトウェアを使用して 2 D と 3 D の解析の結果を比較 (材料の表を参照してください)。我々 は、3 D 画像はどうやらより詳細な構造情報を提供、2 つの分析方法最終的に示さなかった有意差 (図 4) の血管の長さおよび分岐の数の面で発見します。
図 4: 血管構造の 2次元および 3次元解析の比較。(A)画像上に投影で最大の効果。(B) 2D ソフトウェアによって解析の結果 (材料の表を参照してください)。特に、赤の線は、青の点線は、ブランディングのポイント間選択したスケルトンを示します。3 D ソフトウェアによって (C)、分析結果 (材料の表を参照してください)。灰色の領域は、分析のため選択した領域です。緑の線は測定セグメントを表し、緑のドットを示す測定ノード。(D) 容器の長さ、セグメント番号、分岐ノード番号、ターミナル ノードの比較数字 2 D または 3 D の方法で分析します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
以前の出版物は、異なる脂肪デポが異種プロパティ1,18を所有していることを示しています。ここで我々 は、血管と神経線維が新開発法を用いて拠点間で異なるパターンを示すかどうかを決定ましょう。これを達成するため、共同の場合 (血管) の α endomucin と脂肪組織における α-TH (神経線維) の抗体染色を行った。興味深いことに、結果より多くの血管と神経線維 (図 5、上部と中間の車線に比較下の車線) の寺院と比較してバットが大幅、
図 5: 血管および神経線維別脂肪デポから取得の比較。全体マウント アンチ endomucin (緑) と反チロシン染色する場合 eWAT (A B、 Cに合併) の水酸化酵素 (TH) (赤) 抗体 sWAT (D E、 Fに合併) とバット (G, H、マージ私).この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
WATs、間 sWAT 展示、eWAT より血管密度が高い (図 5、トップ車線中央を比較)。ノートでは、神経線維、血管と並行して展開中の重要な共局在 (図 5、マージされたレーン) は示さなかった。我々 はさらに定量的船エリア、ジャンクション、および 2D の方法 (図 6) 上記と同様の結果を見つけたとチューブの長さの数を測定しました。
図 6: 血管の定量的解析と神経線維ネットワーク。(A) eWAT、sWAT、バットのサンプルの血管領域の割合。EWAT、血管のジャンクションの数 (B) ネットワーク、sWAT し、バットします。(C) 総血管 eWAT、sWAT とバットの血管網の長さ。Neve の割合 (D) 繊維地区 eWAT のサンプルは、sWAT やバットします。(E) 接合バット、sWAT、eWAT 神経線維の数。(F) 総 eWAT、sWAT、バットで神経線維の長さ。2 D ソフトウェアで解析を行った。結果は、図 5に示す画像から達成されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
要約すると、このアプローチ成功共同染色血管や脂肪組織における神経線維。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
肥満の開発1,2の間に代謝不全に直接リンクは脂肪組織リモデリングします。血管新生と交感神経支配は、動的な改造プロセス2,12のために不可欠です。したがって、非常に重要なは、神経線維と同様、新しい血管を可視化に適用可能なアプローチを開発します。以前の方法は、脂肪組織の血管新生を文書化するために報告されています。ただし、これらのアプローチは、低効率、うるさい解像度やノイズの多い背景などといくつかの問題が残っています。一方、交感神経支配は、脂肪組織の病理学の14の重要なステップとして最近に認識のみされています。関連の調査結果は興味深いが、応用方法は顕微鏡の高度なツールを必要とし、時間がかかる。ここでは、私たち以前の議定書共同血管や神経の交感神経線維を染色から変更容易に続くアプローチを報告します。興味深いことに、我々 は正常に血管や高解像度の神経線維を染色、染色質以前に報告された画像18に匹敵します。
我々 は以前免疫組織化学またはパラフィン埋め込まれたスライド8,13,20の内皮細胞のマーカーである α CD31 抗体を蛍光抗体法によって脂肪組織内の血管を染色しました。メソッドでは、異なるグループの間の血管密度を区別するために私たちことができます、間積極的に染色された微小血管が不完全だった。ここでは、我々 は全体マウント方法を選んだ場合は α endomucin 抗体、血管のための別のマーカーの染色を行い。この最適化されたアプローチより多くの血管、特に microblood 容器の汚損を達成することができました。さらに、この方法で我々 は血管の整合性を損なう可能性がある、パラフィン埋め込むとホルマリン固定などのステップを避けるので画像を得た高い解像度とよりそのまま船。さらに、血管の健常者の構造で測定し、その長さ、分岐、および面積を比較できました。注記のうち、組織塊がより透明になることができる、この単純ですが重要なステップが染色18,21の効率を大幅に向上、グリセロールと清算のステップを追加しました。
組織の内部の領域に対する抗体のアクセシビリティを制限可能性があります、脂肪組織中の脂質含量の高いレベルのためターゲット蛋白質に結合する十分な抗体を確保するための小さな断片に停車場をカットします。したがって、本手法より多くの血管と神経線維全体組織の染色よりも正常に汚れ。しかし、空間情報が失われる、それ故に神経線維の整合性に影響を与える可能性があります。この明らかな問題を解決し、画像が個々 のマウスの中で対等が確実には、脂肪のデポの同じ地域から小さな塊を収集することをお勧めします。詳細については空間が必要になる場合、汚損のためより大きなチャンクを得られなければならない.大きいサンプルの透過性、洗剤濃度が高い、FPA の高用量と時間が長く固定と抗体の孵化の長い期間が必要であります。
脂肪組織の神経支配は、最近検討されています。複数の高度なテクニックは、神経線維の14,17を可視化に適用されています。これらのメソッドは、高価なまたは時間のかかる。単に α TH (交感神経マーカー) と正常に場合は染色を行い、ここで高品質で交感神経の神経線維を染色します。さらに、α endomucin と血管が脂肪組織リモデリング中の交感神経線維の相互作用方法を調査するため α 回共同染色を行った。
注記のうち、異なるソフトウェアを使用して、2 D と 3 D の解析の結果を比較しました。3 D 画像より詳細な構造情報を提供、2 つの分析方法には長さと血管の分岐に関して有意差認められなかった、それが見つかりました。最終的には、3 D による分析、ソフトウェア自体は手動で調整する必要があるいくつかの偽の信号を検出してがあります。考えると 2 D のソフトウェアの容器解析の設計意図的、血管の構造を定量的に測定するこのメソッドを使用するため勧めします。
この方法では、血管と別の脂肪組織における神経線維が共同染色とその密度、分岐、および長さが比較された19。血管と神経線維がワット、バットがより代謝活性の高い脂肪デポと比較してバットではるかに厚いことがわかった。また、血管や神経密度 sWAT でより高かった、eWAT WATs は別のそれを示す異なる改造プロファイルを持っています。
結論としては、この効率的に共同汚れ法血管や脂肪組織5における神経線維。さらに、それは肥満の開発の間に脂肪組織のダイナミックな変化を研究するための有用なツールとして機能します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
この研究は、(k. s.)、健康 (NIH) 助成金 R01DK109001 の国立研究所によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 805-545-180 | Lot: 116969 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Lot: 121944 |
| Amira 6.0 | Thermo Fisher Scientific | Licensed software | |
| Angio tool | National Institutes of Health | Open source software https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home |
|
| Anti-mouse endomucin antibody | R&D research system | AF4666 | Lot: CAAS0115101 |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | Pel Freez Biologicals | P40101-150 | Lot: aj01215y |
| Cover glasses high performance, D = 0.17 mm | Zeiss | 474030-9020-000 | |
| Cytoseal 280 | Thermo Fisher Scientific | 8311-4 | High-viscosity medium |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | |
| Paraformaldehyde,16% | TED PELLA | 170215 | |
| Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep | INVITROGEN | P24744 | Silicone isolator |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| SEA BLOCK Blocking Buffer | Thermo Fisher Scientific | 37527X3 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | |
| Tissue Path IV Tissue Cassettes | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Triton Χ-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Generic term: octoxynol-9 |
| Tube rotator and rotisseries | VWR | 10136-084 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Generic term: Polysorbate 20 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. Adipose tissue remodeling and obesity. Journal of Clinical Investigations. 121 (6), 2094-2101 (2011).
- Sun, K., et al. Endotrophin triggers adipose tissue fibrosis and metabolic dysfunction. Nature Communication. 5, 3485 (2014).
- Zhao, Y., et al. Divergent functions of endotrophin on different cell populations in adipose tissue. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 311 (6), E952-E963 (2016).
- Zhao, Y., et al. Transient Overexpression of VEGF-A in Adipose Tissue Promotes Energy Expenditure via Activation of the Sympathetic Nervous System. Molecular and Cellular Biology. , (2018).
- Xue, Y., et al. Hypoxia-independent angiogenesis in adipose tissues during cold acclimation. Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).
- Chen, S., et al. LncRNA TDRG1 enhances tumorigenicity in endometrial carcinoma by binding and targeting VEGF-A protein. BBA Molecular Basis of Disease. 1864 (9 Pt B), 3013-3021 (2018).
- Sun, K., et al. Dichotomous effects of VEGF-A on adipose tissue dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (15), 5874-5879 (2012).
- During, M. J., et al. Adipose VEGF Links the White-to-Brown Fat Switch With Environmental, Genetic, and Pharmacological Stimuli in Male Mice. Endocrinology. 156 (6), 2059-2073 (2015).
- Elias, I., et al. Adipose tissue overexpression of vascular endothelial growth factor protects against diet-induced obesity and insulin resistance. Diabetes. 61 (7), 1801-1813 (2012).
- Sung, H. K., et al. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17 (1), 61-72 (2013).
- Cao, Y. Angiogenesis and vascular functions in modulation of obesity, adipose metabolism, and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 18 (4), 478-489 (2013).
- Sun, K., et al. Brown adipose tissue derived VEGF-A modulates cold tolerance and energy expenditure. Molecular Metabolism. 3 (4), 474-483 (2014).
- Zeng, W., et al. Sympathetic neuro-adipose connections mediate leptin-driven lipolysis. Cell. 163 (1), 84-94 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Berry, R., et al.
- Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
- An, Y. A., et al. Angiopoietin-2 in white adipose tissue improves metabolic homeostasis through enhanced angiogenesis. eLife. 6, (2017).
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
