Summary
Nye blodkar dannes og sympatiske innervation spille centrale roller i fedtvæv remodellering. Der er dog stadig tekniske problemer i visualisering og kvantitativ måling af fedtvæv. Her præsenterer vi en protokol for at med held etiket og kvantitativt sammenligne tætheder af blodkar og nerve fibre i forskellige fedtvæv.
Abstract
Nylige undersøgelser har fremhævet den afgørende rolle af angiogenese og sympatiske innervation i fedtvæv remodeling under udviklingen af fedme. Det er derfor nødvendigt at udvikle en nem og effektiv metode til at dokumentere de dynamiske ændringer i fedtvæv. Her, beskriver vi en modificeret immunfluorescent tilgang, der effektivt Co pletter blodkar og nerve fibre i fedtvæv. Sammenlignet med traditionelle og nyligt udviklede metoder, er vores tilgang relativt let at følge og mere effektiv i mærkning af blodkar og nerve fibre med højere tætheder og mindre baggrund. Desuden, den højere opløsning af billederne yderligere tillader os at præcist at måle området af skibe, mængden af filialer, og længden af fibrene af open source-software. Som en demonstration ved hjælp af vores metode, viser vi, at brunt fedtvæv (BAT) indeholder større mængder af blodkar og nerve fibre i forhold til hvidt fedtvæv (WAT). Vi yderligere find, blandt for WATs subkutane WAT (sWAT) har flere blodkar og nerve fibre i forhold til epididymis WAT (eWAT). Vores metode giver således et nyttigt redskab til at undersøge fedtvæv remodellering.
Introduction
Fedtvæv er nøglen metaboliske og endokrine funktioner1. Det dynamisk udvides eller formindskes i svar på forskellige næringsstoffer understreger2. Den aktive væv remodellering proces består af flere fysiologisk stier/trinene herunder angiogenese, fibrose og formning af lokale inflammatoriske microenvironments2,3,4. Nogle fysiske stimuli, såsom koldt eksponering og motion, kan udløse sympatisk aktivering, hvilket i sidste ende fører til nye blodkar dannes og sympatiske innervation i fedtvæv5,6. Disse remodeling processer er knyttet tæt til systemisk metabolisk resultater herunder insulinfølsomhed, kendetegnende for type 2 diabetes2. Visualisering af disse patologiske ændringer er således meget vigtigt at forstå hele fedtvæv sund status.
Angiogenese er processen med nye blodkar dannes. Da blodkar, der leverer ilt, næringsstoffer, hormoner og vækstfaktorer til væv, angiogenese har været betragtet som et vigtigt skridt i fedtvæv remodeling, som er blevet dokumenteret med forskellige teknikker6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. men der er stadig spørgsmål om opløsning af billederne, effektiviteten af immunfarvning og metoder til kvantificering af fartøjet tæthed. I forhold til nye blodkar dannes, har været undervurderet innervation i fedtvæv i lang tid. For nylig, Zeng mfl. 14 brugt avanceret intravital to-foton mikroskopi og demonstreret at adipocytter er omgivet af lag af nervefibre14. Siden da, er forskere begyndt at sætte pris på den afgørende rolle af sympatiske innervation i regulering af fedtvæv fysiologi. Derfor er udvikle en nem og praktisk tilgang til dokument adipøst nerve innervation vigtigt.
Her rapporterer vi en optimeret metode for Co farvning af blodkar og nerve fibre baseret på vores tidligere protokoller. Med denne metode, kan vi opnå tydelige billeder af blodkar og nerve fibre uden støjende baggrund. Desuden, vi får en beslutning, der er høj nok til at udføre kvantitativ måling af tætheder med open source software. Ved hjælp af denne nye tilgang, kan vi med held sammenligne strukturer og tætheder af blodkar og nerve fibre i forskellige fedt depoter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer indeholdende animalske emner er blevet godkendt af dyrs velfærd Udvalget af University of Texas Health Science Center i Houston (animalske protokolnummer: AWC-18-0057).
1. reagens
- 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS, pH 7,4): for at gøre 1 L 1 x PBS, opløse 8 g NaCl, 0,2 g af KCl, 1.44 g Na2HPO4og 0,24 g KH2PO4 i 800 mL destilleret vand. PH indstilles til 7,4 og fyld med destilleret vand til at opnå en endelige mængden af 1 L.
- 1% PARAFORMALDEHYD i 1 x PBS (1% PFA, wt/vol): for at opnå en endelige rumfang 50 mL, tilsættes 3,125 mL 16% PFA (Se Tabel af materialer) til 46.875 mL 1 x PBS. Bland godt og opbevares ved 4 ° C til senere brug.
Forsigtighed: PARAFORMALDEHYD er giftigt. Alle procedurer bør gennemføres under et stinkskab at undgå indånding og hudkontakt. - 0,1% Polysorbat 20 (Se tabel over materialer) i 1 x PBS (1 x PBST, pH 7,4, vol/vol): for at opnå en endelige rumfang 50 mL, tilsættes 0,05 mL af Polysorbat 20 til 49,95 mL 1 x PBS. Vortex og opbevares ved 4 ° C i op til 1 måned.
- 1% octoxynol-9 (Se Tabel af materialer) i 1 x PBS (1 x PBS-TX, pH 7,4, vol/vol): for at opnå en endelige mængden af 10 mL, tilsættes 0,1 mL af octoxynol-9 9,9 mL 1 x PBS. Vortex og opbevares ved 4 ° C i op til 1 måned.
- 2% natriumazid (wt/vol): for at producere 10 mL 2% natriumazid, tilsættes 0,2 g natriumazid til 10 mL af 1 x PBS. Bland godt og opbevares ved 4 ° C til senere brug.
- 90% glycerol i 1 x PBS (vol/vol): for at opnå en endelige mængden af 10 mL, tilsættes 1 mL PBS, 1 x 9 mL glycerol. Vortex og opbevares ved stuetemperatur (RT) til senere brug.
2. animalske Ddissection og fedtvæv samling
- Bruge 6 uger gamle C57BL/6J mandlige mus. Bedøver mus med isofluran (4-5% for induktion derefter 1-2% for vedligeholdelse). Når bedøvede, udføre en tå-knivspids reflex for at bestemme den bedøvende dybde, at dømme efter manglen pedal reflekser. Når musene er dybt bedøvede, dissekere musene efter protokollen som tidligere udgivet15.
- Sterilisere sløv saks og kirurgisk område af brystet (ingen grund til at barbere håret). Åbn brystet ved at skære mellemgulvet og ribben langs den laterale overflade med en størrelse på ~ 2 cm ved hjælp af sløv saks. Klemme flaget brystet med hemostat og afspejler det ved at sætte hemostat over hovedet.
- Gør et lille snit ind i venstre hjertekammer (~0.5 cm) med iris saks. Indsæt en oliven-tippes perfusion nål gennem webstedet indsnit og klemme nål spidsen på plads med hemostat. Vedhæfte nålen til en 50 mL sprøjte indeholdende PARAFORMALDEHYD fiksering løsning (1% PFA, pH 7,4).
- Åbn højre atrium ved afsnit skæring med iris saks som perfusion outlet. Start perfusion af blidt og kontinuerligt at skubbe sprøjten til en perfusion tæt på 10 mL/min. Stop skubbe når væsken forlader forretningen er klart for enhver blod. Hele processen skal kræve ~ 5 min.
Forsigtighed: Udfør disse trin under et stinkskab at forhindre toksicitet fra PFA. - Dissekere hvidt og brunt fedtvæv fra mus. Brug saks til at bryde vævsprøver i små stykker i bidder ca 5 x 5 x 3 mm,3. Overføre de små bidder med steriliseret pincet ind i vævet indlejring kassetter med ordentlig mærkning af vævsprøver på kassetter.
- Fordybe de indlejring kassetter, der indeholder vævsprøver oploesningen fiksering (1% PFA i 1 x PBS, pH 7,4) ved 4 ° C i 24-48 timer.
Bemærk: Fiksering løsning og fiksering tid varierer baseret på størrelser af væv16,17,18. - Vask prøver med frisk 1 x PBS buffer, tre gange (0,5 mL pr. vask).
Forsigtighed: Udføre dette trin under et stinkskab. PARAFORMALDEHYD affald skal håndteres korrekt ifølge farligt affald bortskaffelse procedurer.
Bemærk: Væv kan gemmes i 1 x PBS ved 4 ° C til videreforarbejdning.
3. antistof inkubation
- Skær de faste vævsprøver i ca 2 mm3 terninger med steriliseret saksen. For permeabilization, overføre prøverne til en 1,5 mL rør indeholdende 1 mL af 1 x PBS-TX (1% octoxynol-9 i 1 x PBS, se tabel for materialer, pH 7,4) og forsigtigt dreje rør på RT for 1 h på 18 rpm.
- Fjern forsigtigt 1 x PBS-TX ved aspiration. Vaske prøver 3 x ved at tilføje 1 x PBS direkte i de samme rør (ingen grund til at ændre rør). Under hver vask, invertere rør flere gange.
- For at blokere, tilføje 0,5 mL blokerende buffer (Table of Materials) til prøverne og inkuberes ved RT for 2 h med blide rotation.
- For at forberede 0,4 mL af primære antistof, fortyndes 2 μl af anti - endomucin (markør af blodkar) 5 (1:200) og 2 μl anti — tyrosin hydroxylase (TH, markør af nervefibre) 5 (1:200, 1 µg/mL) antistoffer (tabel af materialer antistof oplysninger) i 396 μL blokerende buffer. Vortex og spin-ned for at genoprette lydstyrken.
- For det første antistof inkubation, forsigtigt fjerne de blokerende buffer fra væv klumper. Tilsæt 100 μL af primære antistof rengøringsopløsning i trin 3.4 i rør og inkuberes ved 4 ° C natten over.
Bemærk: Antistof fortynding og inkubering tid kan variere blandt forskellige antistoffer. Det anbefales at tilføje 0,02% natriumazid til antistof løsning til at undgå mikrobiel vækst. For at forberede 0,4 mL af primære antistof løsning med natriumazid, tilsættes 4 μL af antistoffer (1 μL af hver) og 4 μL af 2% natriumazid til 392 μL blokerende buffer. - Omhyggeligt indsamle den primære antistof løsning til genbrug, hvis det ønskes. Vaske prøver med 1 x PBST (pH 7,4, 100 µL pr. vask) tre gange (30 min) med blide rotation på 18 rpm.
- For udarbejdelse af sekundær antistof løsning, fortyndet 2 μl af fluorophore (bølge længde 495 nm) konjugerede anti-ged IgG (1:200) og 2 μl af fluorophore (bølge længde 650 nm) konjugerede anti-kanin IgG (1:200) (Se Tabel af materialer) i 396 μL af blokerende buffer. Vortex og spin kort at indsamle al væsken.
Bemærk: Beskytte prøverne fra lys under de følgende procedurer. - For det andet antistof inkubation, skal du fjerne den sidste vaskebuffer fra prøver. Tilsæt 100 μL af sekundær antistof løsning i rør og inkuberes ved RT for 2 h med blide rotation på 18 rpm.
- Fjern forsigtigt sekundær antistof løsningen. Vaske prøver 3 x med 1 x PBST (pH 7,4, 30 min) med blide rotation på 18 rpm.
Bemærk: Denne sekundære antistof løsning, må ikke genbruges, da det kan være forurenet med spormængder af primære antistoffer bragt af væv. - For optisk clearance, fordybe prøver i 1 mL 90% glycerol og beholde prøverne ved 4 ° C i mørke, indtil de bliver gennemsigtige.
Bemærk: Fordybelse varighed afhænger af vævstype og størrelse. Typisk, en 2 mm3 terning af hvidt fedtvæv behov natten inkubation, mens de samme størrelse brunt fedtvæv prøve behov længere. - Overhold en silikone isolator til diaset for at skabe et godt for volumen billeddannelse. Alternativt kan du vedhæfte flere lag af gennemsigtige tape til dias og skære en firkant ud af midten for at skabe et godt (figur 2).
Bemærk: Justere godt dybden til at passe stikprøvestørrelsen. I denne protokol bruges en 1 mm og dybde. - Omhyggeligt overføre prøverne i brønden og fyld den med montering medium (Se Tabel af materialer). Lægge et cover glide på overfladen og forsegle hjørner af forsiden underkjole med høj viskositet medium (Se Tabel af materialer). Lad montering medium kur mod 24 h i RT i mørket.
Bemærk: Sikre, at ingen plads der er tilbage mellem prøve og dække slip. Undgå bobler under cover slip. Undgå at placere uforholdsmæssigt stort pres på prøverne.
4. billede erhvervelse
- Erhverve Z-stak billeder (Se trin 4.2-4.7) med 20 x mål af en Konfokal mikroskop/software.
- Starte systemet. Klik på fanen <Configuration> og aktivere argon laser og HeNe 633 laser. Klik på fanen <erhverve>. I panelet <synlig> laser linjer flytte skyderne tilsvarende intensitet at vælge laser linjer af 488 nm og 633 nm. I første omgang, kan intensiteterne indstilles til 20-30%. Vælg 488/561/633 tredobbelt dichoric spejl. Aktivere PMTs ved at klikke på <aktive> afkrydsningsfelter, vælge PMT1 for emission ophidset af 488 nm laser og PMT3 hertil af 633 nm laser. Angive bølgelængdeområdet til 500 – 550 nm for PMT1 og 650-750nm for PMT3. Vælg psudocolor der skal bruges til visning af dobbelt klikke på det farvede rektangel ved siden af hver ydelse og vælge en farve på lokalmenuen.
- Klik på <Live> kontrollere billede af prøver. Brug z-Position knop til at vælge en flyet af fokus inden for det pågældende område, XY. Justere lysstyrken på billeder af tuning laser intensitet, smart gevinst og offset. For hver kanal, fluorescens, udføre denne justering under <QLUT> (hurtig ser op tabel) display mode. Klik på knappen <QLUT> til at angive den QLUT tilstand, som mættede pixel vises i blåt for at støtte fastsættelsen af passende lysstyrkeniveau. Klik to gange på knappen <QLUT> for at gå tilbage til pseudocolor display mode.
Bemærk: Numeriske værdier for indstillingen kan variere mellem hvert forsøg. - Mens scanning, drej Z-Position knappen mod uret for at flytte planen af fokus til den ene ende af omfanget af interesse og derefter klikke på <ende> pilespids til at indstille den scanning endestop. Derefter Drej Z-Position knappen med uret til at flytte flyet af fokus gennem modellen til anden enden af mængden af interesse og derefter klikke på <Begin> pilespids til at angive positionen scanning begin.
Bemærk: Til sammenligning mellem forskellige prøver, definere den samme Z-volumen for forskellige prøver. - Juster z-trin størrelse til 3 µm. Skift billedkvaliteten ved at vælge et format på 1024 x 1024, hastighed af 100 Hz og linje gennemsnittet af 2.
- Vælg <Start > at indlede z-stakken billede erhvervelse.
- For maksimal projektionen af den erhvervede billedstak, skal du klikke på <processen> fanen og derefter <værktøj>, Vælg <3D projektor> og indtaste <maksimale> på listen uden ændringer til X, Y og Z. sæt <Tærskel> 0. Klik på <anvende>. Den maksimale intensitet af Z-volumen vil blive stablet i et 2D-billede, som vil blive vist (figur 4A).
5. analyse af blodkar og Nerve Fiber netværk
-
Analyse af 2D billeder via open source-software (se tabel af materialer)19
- Åbn de stablede billeder i softwaren. Justere fartøj diameter og intensitet , indtil alle fartøj strukturer kan være korrekt valgt (figur 4B).
- Vælg Kør analyse og eksportere data følgende vejledning af softwaren.
-
Analyse af 3D billeder via den licenserede software (se tabel af materialer)
- Åbn de rå data over billeder med softwaren. Justere tærsklen og andre parametre, indtil fartøjet strukturer i hvert lag af z-volumen er korrekt valgt (der henvises til brugervejledningen for oplysninger i softwaren) (fig. 4 c).
- Analysere de udvalgte segmenter tegn og eksportere data efter vejledning af softwaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Distale region i epididymis hvidt fedtvæv (eWAT), mediale region i den dorsolumbar subkutane hvidt fedtvæv (sWAT) og mediale region i den interscapular brunt fedtvæv (BAT) blev indsamlet. Steder for at indsamle disse væv er angivet i figur 1.
Figur 1: anatomi af subkutane hvidt fedtvæv (sWAT), epididymis hvidt fedtvæv (eWAT) og brunt fedtvæv (BAT) angiver områder bruges til at indsamle prøver. (A) regionerne skitseret af hvide stiplede linjer repræsenterer sWAT, og lokationen Hvid stjerne fremhævet er site for indsamling af sWAT. Regioner skitseret af sort stiplede linjer er eWAT, og lokationen sort stjerne fremhævet er stedet for indsamling af eWAT. (B) de regioner, der er skitseret af sort stiplede linjer er BAT, og regionen væv samling understreges af stjernen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Efter hele-mount farvning, var væv klumper monteret i et godt af 1 mm dybde (figur 2)
og afbildet med Konfokal mikroskop. Vi først testet effekten af clearing skridt med 90% glycerol inkubation på kvaliteten af billederne. Vi fandt, at flere blodkar var positivt farves med α-endomucin antistof i glycerol-rugede sWAT, tyder på, at clearing skridt er kritisk for komplet farvning af blodkarrene (figur 3, sammenligne paneler A og B).
Figur 2: diagrammer af brønde for volumen imaging. (A) Diagram af et dias med en silikone isolator. (B) Diagram af en brønd med flere lag af bånd af vores lab. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: sammenligning af hvis billeder af blodkar acquiredwith eller uden optiske clearing skridt med 90% glycerol. (A) hele-mount immunofluorescens (IF) farvning med anti-endomucin antistof (grøn) i sWAT. Prøven blev ikke udsat for optisk clearing trin (trin 3.10). (B) hele-mount hvis farvning med anti-endomucin antistoffer i sWAT. Prøven blev udsat for optisk clearing trin (trin 3.10) før montering trin (trin 3.11 og 3.12). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Dog påvirkede clearing skridt med glycerol ikke integritet eller form af blodkar (figur 3). Givet disse gavnlige virkninger, i de følgende eksperimenter, blev clearing skridt udført.
Vi yderligere sammenlignet resultaterne af 2D og 3D analyser ved hjælp af forskellige software (Se Tabel af materialer). Vi fandt, at mens 3D-billeder gav tilsyneladende mere detaljerede strukturelle oplysninger, de to analytiske metoder til sidst ikke vise betydelige forskelle med hensyn til længde og gren antallet af fartøjer (figur 4).
Fig. 4: sammenligning af 2D og 3D analyser på fartøjets struktur. (A) effekten af maksimale projektion på billederne. (B) de analytiske resultater af de 2D software (Se Tabel af materialer). Især angiver de røde linjer valgte skelet, mens de blå prikker angiver branding point. (C) de analytiske resultater af 3D-software (Se Tabel af materialer). Det grå område er den valgte region for analyse. Den grønne linje angiver de målte segmenter og grønne prikker angiver de målte noder. (D) en sammenligning af fartøjets længde, segment numre, forgrenede nodenumre og terminal node numre analyseret af 2D eller 3D metoder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tidligere publikationer har vist, at forskellige fedt depoter besidder heterogene egenskaber1,18. Her søgte vi at finde ud af om blodkar og nerve fibre udstiller forskellige mønstre blandt de depoter, ved hjælp af vores nyudviklede metode. For at opnå dette har udført vi Co hvis farvning med α-endomucin (for blodkar) og α-TH (for nerve fibre) antistoffer i fedtvæv. Interessant, viste resultaterne, at der var betydeligt mere blodkar og nerve fibre i BAT sammenlignet for WATs (figur 5, Sammenlign bunden baner til øverste og midterste baner)
Figur 5: sammenligning af blodkar og nerve fibre erhvervet fra forskellige fedt depoter. Hele-mount hvis farvning med anti-endomucin (grøn) og anti-tyrosin hydroxylase (TH) (rød) antistoffer i eWAT (A, B, fusionerede i C), sWAT (D, E, fusionerede i F) og BAT (G, H, fusionerede i jeg). venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Blandt for WATs sWAT udstillet højere blodkar tæthed end eWAT (figur 5, sammenligne midten til øverste lane). Af note, mens nervefibre udvidet parallelt med blodkar, udviste de ikke betydelig Co lokalisering (figur 5, flettede baner). Vi målte yderligere kvantitativt området fartøj, antallet af vejkryds, og rørlængde med 2D metode og fundet lignende resultater som beskrevet ovenfor (figur 6).
Figur 6: kvantitativ analyse af kar og nerve fiber netværk. (A) procentdelen af blodkar i prøver af eWAT, sWAT og BAT. (B) antallet af knudepunkter for den vaskulære netværk i eWAT, sWAT, og BAT. (C) den samlede fartøjets længde af vaskulære netværk i eWAT, sWAT og BAT. (D) procentdelen af neve fiber område i prøverne med eWAT, sWAT og BAT. (E) antallet af knudepunkter af nervefibre i eWAT, sWAT, og BAT. (F) samlet længde af nervefibre i eWAT, sWAT og BAT. Analyser blev udført med 2D software. Resultaterne blev opnået fra billeder præsenteret i figur 5. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
I oversigt, denne tilgang med held Co farves blodkar og nerve fibre i forskellige fedtvæv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fedtvæv remodellering er direkte knyttet til metaboliske dysregulering under fedme udvikling1,2. Angiogenese og sympatiske innervation er både væsentlige for den dynamiske remodeling proces2,12. Derfor udvikle en relevant tilgang til at visualisere den nye blodkar samt nerve fibre er af stor betydning. Tidligere metoder er blevet rapporteret til at dokumentere angiogenese i fedtvæv. Nogle spørgsmål er dog stadig med disse tilgange, herunder lav effektivitet, kræsen opløsning og støjende baggrund. I mellemtiden er sympatiske innervation kun blevet anerkendt for nylig som et afgørende skridt i fedtvæv patologi14. Selvom de relaterede resultater er interessante, anvendte metoder kræver avancerede mikroskopi værktøjer og er tidskrævende. Her rapporterer vi en let at følge tilgang ændret fra vores tidligere protokol for Co farvning blodkar og sympatiske nervefibre. Interessant, vi med held farves blodkar og nerve fibre med høj opløsning, og farvning har egenskaber sammenlignes med tidligere rapporteret billeder18.
Vi har tidligere farves blodkar i fedtvæv af Immunhistokemi eller immunfluorescens med α-CD31 antistof, en markør i endothelial celler på paraffin-embedded dias8,13,20. Mens metoden gør det muligt for os at skelne blodkar tæthed mellem forskellige grupper, var de mikrovaskulære fartøjer, der var positivt farves ikke komplet. Her, vi valgte en helhed-mount metode og udføres hvis farvning med et antistof, α-endomucin, en anden markør for blodkar. Med denne optimerede tilgang har vi kunnet opnå farvning med mere blod fartøjer, især microblood. Desuden, i denne metode, da vi undgået skridt såsom paraffin indlejring og formalin fiksering, som har potentiale til at forringe integriteten af blodkar, vi opnåede billeder med højere opløsning og mere intakt fartøjer. Fejlfri strukturen af fartøjerne yderligere tilladt os at måle og sammenligne deres længde, forgrening, og områder. Bemærk tilføjet vi en clearing skridt med glycerol, så væv klumper kunne blive mere gennemsigtige, og denne enkle men vigtige skridt betydeligt forbedret effektivitet af farvning18,21.
På grund af høje niveauer af lipid indholdet i fedtvæv, som kan begrænse tilgængeligheden af antistoffer mod de indre regioner af væv, skære vi i depoter i små stykker til at sikre passende antistof binding til target proteiner. Derfor pletter vores metode med held mere blodkar og nerve fibre end farvning på hele væv. Det kan dog miste geografisk information og dermed påvirke integriteten af nervefibre. For at løse problemet tilsyneladende og sikre billederne er sammenlignelige blandt individuelle mus, er det foreslået for at indsamle små bidder fra de samme regioner i de fedt depoter. Hvis flere rumlige oplysninger kræves yderligere, bør større bidder opnås til farvning. For større prøver, længere optagelse gange med højere doser af FPA, højere koncentrationer af rengøringsmidler til permeabilization, og længere perioder af antistof inkubation kan være nødvendigt.
Fedtvæv innervation er blevet undersøgt for nylig. Flere avancerede teknikker har været anvendt til at visualisere nervefibre14,17. Disse metoder er enten dyr eller tidskrævende. Her, vi blot udført en hvis pletten med α-TH (sympatiske nerve markør) og med held farves sympatiske nervefibre på en høj kvalitet. Endnu vigtigere, udførte vi Co farvning med α-endomucin og α-TH at undersøge hvordan blodkarrene samspil med sympatiske nervefibre under fedtvæv remodellering.
Bemærk sammenlignede vi resultaterne fra 2D og 3D analyser ved hjælp af forskellige software. Det konstateredes, at, mens 3D-billederne givet mere detaljerede strukturelle oplysninger, de to analytiske metoder ikke viser signifikant forskel i forhold til længden og forgrening af fartøjer. Til sidst, når du analyserer med metoden 3D, kan selve softwaren opdage nogle falske signaler, der skal justeres manuelt. I betragtning af at de 2D software er bevidst designet til fartøj analyse, foreslås det således for at bruge denne metode til kvantitativ måling af strukturen af fartøjer.
Med denne metode, blodkar og nerve fibre i forskellige fedtvæv var Co farves og deres tætheder, forgrening, og længder blev sammenlignet med19. Det blev konstateret, at både blodkar og nerve fibre er meget tykkere i BAT sammenlignet med WAT, tyder på, at BAT er en mere metabolisk aktive adipøst depot. Desuden, blodkar og nerve tætheder i sWAT var højere end i eWAT, der angiver, at forskellige WATs har forskellige remodeling profiler.
Til sidst, pletter denne metode effektivt Co blodkar og nerve fibre i fedtvæv5. Desuden, det tjener som et nyttigt redskab til at studere de dynamiske ændringer i fedtvæv under udvikling af fedme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af National Institute of Health (NIH) grant R01DK109001 (til K.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 805-545-180 | Lot: 116969 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Lot: 121944 |
| Amira 6.0 | Thermo Fisher Scientific | Licensed software | |
| Angio tool | National Institutes of Health | Open source software https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home |
|
| Anti-mouse endomucin antibody | R&D research system | AF4666 | Lot: CAAS0115101 |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | Pel Freez Biologicals | P40101-150 | Lot: aj01215y |
| Cover glasses high performance, D = 0.17 mm | Zeiss | 474030-9020-000 | |
| Cytoseal 280 | Thermo Fisher Scientific | 8311-4 | High-viscosity medium |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | |
| Paraformaldehyde,16% | TED PELLA | 170215 | |
| Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep | INVITROGEN | P24744 | Silicone isolator |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| SEA BLOCK Blocking Buffer | Thermo Fisher Scientific | 37527X3 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | |
| Tissue Path IV Tissue Cassettes | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Triton Χ-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Generic term: octoxynol-9 |
| Tube rotator and rotisseries | VWR | 10136-084 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Generic term: Polysorbate 20 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. Adipose tissue remodeling and obesity. Journal of Clinical Investigations. 121 (6), 2094-2101 (2011).
- Sun, K., et al. Endotrophin triggers adipose tissue fibrosis and metabolic dysfunction. Nature Communication. 5, 3485 (2014).
- Zhao, Y., et al. Divergent functions of endotrophin on different cell populations in adipose tissue. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 311 (6), E952-E963 (2016).
- Zhao, Y., et al. Transient Overexpression of VEGF-A in Adipose Tissue Promotes Energy Expenditure via Activation of the Sympathetic Nervous System. Molecular and Cellular Biology. , (2018).
- Xue, Y., et al. Hypoxia-independent angiogenesis in adipose tissues during cold acclimation. Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).
- Chen, S., et al. LncRNA TDRG1 enhances tumorigenicity in endometrial carcinoma by binding and targeting VEGF-A protein. BBA Molecular Basis of Disease. 1864 (9 Pt B), 3013-3021 (2018).
- Sun, K., et al. Dichotomous effects of VEGF-A on adipose tissue dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (15), 5874-5879 (2012).
- During, M. J., et al. Adipose VEGF Links the White-to-Brown Fat Switch With Environmental, Genetic, and Pharmacological Stimuli in Male Mice. Endocrinology. 156 (6), 2059-2073 (2015).
- Elias, I., et al. Adipose tissue overexpression of vascular endothelial growth factor protects against diet-induced obesity and insulin resistance. Diabetes. 61 (7), 1801-1813 (2012).
- Sung, H. K., et al. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17 (1), 61-72 (2013).
- Cao, Y. Angiogenesis and vascular functions in modulation of obesity, adipose metabolism, and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 18 (4), 478-489 (2013).
- Sun, K., et al. Brown adipose tissue derived VEGF-A modulates cold tolerance and energy expenditure. Molecular Metabolism. 3 (4), 474-483 (2014).
- Zeng, W., et al. Sympathetic neuro-adipose connections mediate leptin-driven lipolysis. Cell. 163 (1), 84-94 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Berry, R., et al.
- Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
- An, Y. A., et al. Angiopoietin-2 in white adipose tissue improves metabolic homeostasis through enhanced angiogenesis. eLife. 6, (2017).
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
