Summary
New Schiff Blutbildung und sympathische Innervation spielen entscheidende Rolle im Fettgewebe, das umgestaltet. Es bleiben jedoch technische Probleme zu visualisieren und Fettgewebe quantitativ zu messen. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um erfolgreich zu kennzeichnen und quantitativ vergleichen die dichten der Blutgefäße und Nervenfasern in verschiedenen Fettgewebe.
Abstract
Neuere Studien haben deutlich gemacht, dass die kritische Rolle der Angiogenese und sympathische Innervation im Fettgewebe Umbau bei der Entwicklung von Fettleibigkeit. Daher ist es notwendig, eine einfache und effiziente Methode, um die dynamischen Veränderungen im Fettgewebe dokumentieren zu entwickeln. Hier beschreiben wir einen modifizierten immunofluorescent Ansatz, der effizient Blutgefäße und Nervenfasern in Fettgewebe Co Flecken. Im Vergleich zu traditionellen und neu entwickelte Methoden, ist unser Ansatz relativ einfach zu folgen und effizienter bei der Kennzeichnung der Blutgefäße und Nervenfasern mit höherer Dichte und weniger Hintergrund. Darüber hinaus ermöglicht die höhere Auflösung der Bilder weiter Bereich der Schiffe, die Höhe der Verzweigung und die Länge der Fasern durch open-Source-Software genau zu messen. Als eine Demonstration, die mit unserer Methode zeigen wir, dass diese braune Fettgewebe (BAT) höhere Mengen an Blutgefäßen und Nervenfasern im Vergleich zu weißen Fettgewebe (WAT) enthält. Wir ferner feststellen, dass unter die WATs, subkutane WAT (sWAT) mehr Blutgefäße und Nervenfasern im Vergleich zu epididymal WAT (eWAT) hat. Unsere Methode bietet somit ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung von Fettgewebe umgestaltet.
Introduction
Fettgewebe hat Schlüssel metabolische und endokrine Funktionen1. Es dynamisch erweitert oder verkleinert als Reaktion auf verschiedene Nährstoff betont2. Das aktive Gewebe Umbau Prozess besteht aus mehreren physiologischen Wege/Schritte einschließlich der Angiogenese, Fibrose und Gestaltung der lokalen entzündlichen Mikroumgebungen2,3,4. Einige körperliche Reize, wie kalte Belichtung und Übung können sympathische Aktivierung auslösen, führt letztlich zu neuen Schiff Blutbildung und sympathische Innervation im Fettgewebe5,6. Diese Umgestaltung Prozesse sind systemische metabolische Ergebnisse einschließlich Insulin-Empfindlichkeit, das Markenzeichen des Typ 2 Diabetes2eng verbunden. Visualisierung dieser pathologischen Veränderungen sind deshalb sehr wichtig für das Verständnis des gesunden Status des gesamten Fettgewebe.
Angiogenese ist der Prozess des neuen Schiffes Blutbildung. Da Blutgefäße Sauerstoff, Nährstoffe, Hormone und Wachstumsfaktoren Gewebe liefern, Angiogenese einen wichtigen Schritt im Fettgewebe, das umgestaltet, galt die mit verschiedenen Techniken6,7, dokumentiert ist 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. jedoch bleiben Fragen über die Auflösung der Bilder, die Effizienz der Immunostaining und Methoden zur Quantifizierung des Schiffes Dichte. Im Vergleich zu New Schiff Blutbildung, ist Innervation im Fettgewebe für eine lange Zeit unterschätzt worden. Vor kurzem, Zeng Et Al. 14 verwendet erweiterte intravitalen zwei-Photonen-Mikroskopie und gezeigt, dass Schichten von Nervenfasern14Adipozyten umgeben sind. Seither haben Forscher begonnen, die zentrale Rolle der sympathischen Innervation bei Regulierung der Fettgewebe Physiologie zu schätzen wissen. Daher ist es wichtig, einen einfachen und praktische Ansatz für Dokument adipösen Nerv Innervation zu entwickeln.
Hier berichten wir über eine optimierte Methode für die Co-Färbung von Blutgefäßen und Nervenfasern auf unsere früheren Protokollen basierende. Mit dieser Methode erreichen wir klare Bilder von Blutgefäßen und Nervenfasern ohne lauten Hintergrund. Darüber hinaus erhalten wir eine Resolution, die hoch genug ist für die Durchführung von quantitativen Messung der Dichte mit open-Source-Software. Mithilfe dieses neuen Ansatzes können wir erfolgreich die Strukturen und dichten der Blutgefäße und Nervenfasern in den verschiedenen adipose Depots vergleichen.
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Protocol
Alle Verfahren, die enthalten tierischer Themen von der Animal Welfare Committee der University of Texas Health Science Center in Houston genehmigt worden (tierische Protokollnummer: AWC-18-0057).
(1) Reagenz Vorbereitung
- 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4): um 1 L 1 X PBS zu machen, auflösen, 8 g NaCl, 0,2 g KCl und 1,44 g Na2HPO40,24 g KH2PO4 in 800 mL destilliertem Wasser. Anpassen des pH-Werts 7,4 und füllt mit destilliertem Wasser zu einem Endvolumen von 1 L.
- 1 % Paraformaldehyd in 1 X PBS (1 % PFA, wt/Vol): um ein finales Volumen von 50 mL zu erreichen, fügen Sie 3,125 mL 16 % PFA (siehe Tabelle der Materialien), 46,875 mL 1 X PBS. Gut mischen und bei 4 ° C für die spätere Verwendung speichern.
Vorsicht: Paraformaldehyd ist giftig. Alle Verfahren sollten unter einer Abzugshaube nicht einatmen und Hautkontakt durchgeführt werden. - 0,1 % Polysorbat 20 (siehe Tabelle der Materialien) mit 1 X PBS-Puffer (1 x PBST, pH 7,4, Vol/Vol): um ein finales Volumen von 50 mL zu erreichen, fügen Sie 0,05 mL Polysorbat 20, 49,95 mL 1 X PBS. Wirbel und Speicher bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.
- 1 % Octoxynol-9 (siehe Tabelle der Materialien) mit 1 X PBS-Puffer (1 x PBS-TX, pH 7,4, Vol/Vol): zu einem Endvolumen von 10 mL 0,1 mL Octoxynol-9 zu 9,9 mL 1 X PBS hinzufügen. Wirbel und Speicher bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.
- 2 % Natriumazid (wt/Vol): 0,2 g Natriumazid hinzufügen um 10 mL 2 % Natriumazid produzieren, 10 mL 1 X PBS. Gut mischen und bei 4 ° C für die spätere Verwendung speichern.
- 90 % Glycerin in 1 X PBS (Vol/Vol): um einem Endvolumen von 10 mL zu erreichen, fügen Sie 1 mL 1 X PBS bis 9 mL Glycerin. Wirbel und bei Raumtemperatur (RT) für die spätere Verwendung lagern.
(2) Tier Ddissection und Fettgewebe Sammlung
- Verwenden Sie 6 Wochen altes Baby C57BL/6J männliche Mäuse. Die Mäuse mit Isofluran (4 – 5 % für die Induktion dann 1 – 2 % für Wartung) zu betäuben. Sobald betäubt, führen Sie einen Zehe-Prise Reflex um die Narkose Tiefe, gemessen an den Mangel an Pedal Reflexe zu bestimmen. Sobald die Mäuse tief betäubt sind, sezieren Sie die Mäuse nach dem Protokoll als zuvor veröffentlichten15.
- Sterilisieren Sie die stumpfe Scheren und OP-Bereich der Brust (keine Notwendigkeit, die Haare rasieren). Öffne die Truhe durch das Zwerchfell und Rippen entlang der seitlichen Oberfläche mit einer Größe von ~ 2 cm mit einer stumpfen Schere schneiden. Die Brust-Flagge mit Gefäßklemme Klemme und reflektieren es indem man die Gefäßklemme über den Kopf.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt in den linken Ventrikel (~0.5 cm), mit der Iris-Schere. Eine Olive-bestückte Perfusion Nadel durch die Schnitt-Website und die Spitze der Nadel mit der Gefäßklemme Klemme. Legen Sie die Nadel auf eine 50 mL Spritze mit Paraformaldehyd Fixierung Lösung (1 % PFA, pH 7.4).
- Öffnen Sie den rechten Vorhof durch Abschnitt schneiden mit Iris-Schere als Perfusion-Outlet. Die Perfusion durch sanft beginnen und kontinuierlich schieben die Spritze mit einer Perfusion Rate nah an 10 mL/min stoppen drücken, wenn die Flüssigkeit verlassen die Steckdose frei von Blut ist. Der gesamte Prozess sollte ~ 5 min benötigen.
Vorsicht: Führen Sie diese Schritte unter einem Abzug, Toxizität von PFA zu verhindern. - Weißen und braunen Fettgewebe von den Mäusen zu sezieren. Mit einer Schere um die Gewebeproben in kleine Stücke von Brocken ca. 5 x 5 x 3 mm3zu brechen. Übertragen Sie kleine Stücke mit der sterilen Pinzette in das Gewebe einbetten Kassetten mit ordnungsgemäßen Kennzeichnung von Gewebeproben auf den Kassetten.
- Tauchen die einbettenden Kassetten mit Gewebeproben in die Fixierung-Lösung (1 % PFA mit 1 X PBS-Puffer, pH 7,4) bei 4 ° C für 24 – 48 h.
Hinweis: Die Fixierung Lösung und Fixierzeit variieren je nach Größe der Gewebe16,17,18. - Waschen Sie die Proben mit frischen 1 x PBS-Puffer drei Zeiten (0,5 mL/Waschgang).
Vorsicht: Führen Sie diesen Schritt unter einem Abzug. Die Paraformaldehyd Abfall sollte richtig entsprechend Entsorgungsverfahren Sondermüll entsorgt werden.
Hinweis: Das Gewebe können mit 1 X PBS-Puffer bei 4 ° C zur weiteren Verarbeitung gespeichert werden.
3. Antikörper Inkubationszeit
- Die festen Gewebeproben in ca. 2 mm3 Würfel mit der sterilisierten Schere ausschneiden. Für Permeabilisierung, übertragen die Proben in einem 1,5 mL Röhrchen mit 1 mL 1 x PBS-TX (1 %-Octoxynol-9 in 1 X PBS, siehe Tabelle für Materialien, pH 7,4) und sanft die Rohre bei RT für 1 h bei 18 u/min drehen.
- Entfernen Sie vorsichtig die 1 x PBS-TX durch Absaugen. Waschen Sie die Proben 3 X durch Zugabe von 1 X PBS direkt in die gleichen Röhren (keine Notwendigkeit, die Rohre zu ändern). Invertieren Sie bei jedem Waschgang die Röhren mehrmals.
- Für die Sperrung, die Proben 0,5 mL blockierende Puffer (Table of Materials) hinzu und 2 h mit sanften Drehung bei RT inkubieren.
- Um 0,4 mL Primärantikörper Lösung vorzubereiten, zu verdünnen, 2 μL des anti - Endomucin (die Markierung der Blutgefäße) 5 (1: 200) und 2 μL des anti-Tyrosin Hydroxylase (TH, die Markierung von Nervenfasern) 5 (1: 200, 1 µg/mL) Antikörper (Tabelle der Materialien Antikörper Informationen) in 396 μl blocking-Puffer. Wirbel und Spin auf wiederherstellen die Lautstärke.
- Entfernen Sie für die ersten Antikörper Inkubation vorsichtig den blockierenden Puffer aus Gewebe Brocken. Fügen Sie 100 μl Primärantikörper Lösung in Schritt 3.4 in Röhren vorbereitet und über Nacht bei 4 ° C inkubieren.
Hinweis: Die Antikörper Verdünnung und Inkubation Zeit variieren zwischen verschiedenen Antikörpern. Es wird empfohlen, die Antikörperlösung für mikrobielles Wachstum zu verhindern 0,02 % Natriumazid hinzu. Um 0,4 mL Primärantikörper Lösung mit Natriumazid vorzubereiten, fügen Sie 4 μL von Antikörpern (1 μl der einzelnen) und 4 μL von 2 % Natriumazid in 392 μl blocking-Puffer. - Sammeln Sie sorgfältig die primären Antikörper-Lösung für die Wiederverwendung, falls gewünscht. Waschen Sie die Proben mit 1 X PBST (pH 7.4, 100 µL/Waschgang) dreimal mit sanften Drehung bei 18 u/min (30 min).
- Für die Vorbereitung der Sekundärantikörper Lösung, verdünnte 2 μL der Fluorophor (Welle Länge 495 nm) Anti-Ziege IgG (1: 200 konjugierte) und 2 μL der Fluorophor (Welle Länge 650 nm) Anti-Kaninchen-IgG (1: 200 konjugierte) (siehe Tabelle der Materialien) in 396 μL der blockierende Puffer. Wirbel und Spin kurz, um die Flüssigkeit aufzufangen.
Hinweis: Im Verlauf der folgenden Verfahren schützen Sie die Proben vor Licht. - Entfernen Sie für den zweiten Antikörper-Inkubation der letzten Waschpuffer aus Proben. Fügen Sie 100 μL der Sekundärantikörper Lösung in Röhren und 2 h mit sanften Drehung bei 18 u/min bei RT inkubieren.
- Entfernen Sie vorsichtig die sekundäre Antikörper-Lösung. Waschen Sie die Proben 3 X mit 1 X PBST (pH 7.4, 30 min) mit sanften Drehung bei 18 Umdrehungen pro Minute.
Hinweis: Wiederverwenden Sie diese sekundäre Antikörper-Lösung nicht, wenn es mit Spuren von Primärantikörpern gebracht durch das Gewebe kontaminiert sein kann. - Tauchen Sie für optische Freiraum die Proben in 1 mL 90 % Glycerin und halten Sie die Proben bei 4 ° C im Dunkeln zu, bis sie durchsichtig geworden.
Hinweis: Die Immersion Dauer hängt von der Gewebetyp und Größe. In der Regel braucht ein 2 mm3 Würfel aus weißen Fettgewebe über Nacht Inkubation, während der gleichen Größe braunen Fettgewebe Probe Bedürfnisse länger. - Halten Sie eine Silikon-Isolator zur Folie um einen Brunnen für die Volumen-Bildgebung zu erstellen. Alternativ legen Sie mehrere Schichten von Tesafilm auf Folien und schneiden Sie ein Quadrat aus der Mitte einen Brunnen erstellen (Abbildung 2).
Hinweis: Stellen Sie die gut Tiefe um die Stichprobengröße zu passen. In diesem Protokoll wird gut 1 mm Tiefe verwendet. - Sorgfältig die Proben in den Brunnen zu übertragen und füllen Sie ihn mit dem Montage-Medium (siehe Tabelle der Materialien). Legen Sie ein Deckglas auf der Oberfläche und die Ecken des Deckglases mit hoher Viskosität Medium zu versiegeln (siehe Tabelle der Materialien). Lassen Sie die Montage mittlerer Heilung für 24 h bei RT in der Dunkelheit.
Hinweis: Stellen Sie sicher, dass kein Leerzeichen zwischen der Probe und Deckglas übrig bleibt. Vermeiden Sie Luftblasen unter dem Deckglas. Vermeiden Sie es, übermäßigen Druck auf die Proben.
4. die Bildaufnahme
- Z-Stapel Bilder (siehe Schritte 4,2-4,7) mit dem Ziel, 20 X einer konfokalen Mikroskop/Software zu erwerben.
- Starten Sie das System. Klicken Sie auf die Registerkarte "<Konfiguration>" und aktivieren Sie die Argonlaser und HeNe 633 Laser. Klicken Sie auf die Registerkarte "<Acquire>". Im Bereich <sichtbar> Laser Linien bewegen Sie die entsprechende Intensität-Regler zu wählen, die Laser-Linien von 488 nm und 633 nm. Zunächst können die Intensitäten auf 20 – 30 % eingestellt werden. Wählen Sie den dreifachen Dichoric 488/561/633-Spiegel. Die PMTs durch Anklicken den <aktiv> Checkboxen, die Wahl von PMT1 für die Emission von 488 nm Laser und PMT3 begeistert, 633 nm Laser aktiviert. Setzen Sie den Wellenlängenbereich 500 – 550 nm für PMT1 und 650-750nm für PMT3. Wählen Sie die Psudocolor für Bildanzeige verwendet werden, durch Doppelklick auf das farbige Rechteck neben jedem PMT und wählen Sie eine Farbe aus dem Einblendmenü aus.
- Klicken Sie auf <Live>, um das Bild der Proben zu überprüfen. Verwenden Sie die Z-Position Regler, um eine Fokusebene in der XY-Region von Interesse wählen Sie. Stellen Sie die Helligkeit der Bilder durch die Laserintensität, intelligent Gain und Offset-tuning. Führen Sie für jeden Kanal Fluoreszenz diese Einstellung unter den Anzeigemodus <QLUT> (Quick Look Up Table). Klicken Sie auf die <QLUT>-Taste, um den QLUT Modus in der gesättigten Pixel blau zugunsten die Einstellung der entsprechenden Helligkeitsstufe angezeigt werden. Klicken Sie zweimal auf die Schaltfläche <QLUT> Pseudofarben Anzeigemodus zurück.
Hinweis: Die numerischen Werte der Einstellung kann unter jedem Experiment variieren. - Während des Scannens, Drehknopf die Z-Position gegen den Uhrzeigersinn zu bewegen den Plan des Fokus auf ein Ende des Bandes von Interesse und klicken Sie auf die Pfeilspitze <Ende> Scan Endposition festgelegt. Dann drehen Sie den Z-Position Regler im Uhrzeigersinn, um die Fokusebene durch die Probe an das andere Ende des Bandes von Interesse zu bewegen und klicken Sie dann auf die Pfeilspitze <Begin> Scan Begin Position einstellen.
Hinweis: Definieren Sie für den Vergleich zwischen verschiedenen Proben die gleichen Z-Lautstärke für verschiedene Proben. - Passen Sie die Z-Schritt Größe 3 µm. Ändern der Bildqualität durch Auswählen eines Formats von 1024 x 1024, Geschwindigkeit von 100 Hz und Linie Durchschnitt von 2.
- Wählen Sie <starten > , die Z-Stapel-Bildaufnahme zu initiieren.
- Für maximale Projektion des Stapels erfasste Bild, klicken Sie auf der Registerkarte <Prozess> und <Werkzeug> Wählen Sie <3D-Projektion> und geben Sie <maximale> in der Methodenliste unverändert auf X, Y und Z. Set <Schwelle> 0. Klicken Sie auf <Anwendung>. Die maximale Intensität des Z-Volumes werden in ein 2D-Bild gestapelt (Abb. 4A) wird angezeigt.
5. Analyse der Blutgefäße und Nerven Glasfasernetze
-
Analyse der 2D Bilder über open-Source-Software (siehe Tabelle der Materialien)19
- Öffnen Sie die gestapelten Bilder in die Software. Passen Sie Schiffs Durchmesser und Intensität , bis alles, was die Schiff Strukturen richtig sein können (Abbildung 4 b) ausgewählt.
- Wählen Sie Analyse ausführen und exportieren Sie die Daten nach Anleitung der Software.
-
Analyse der 3D Bilder über die lizenzierte Software (siehe Tabelle der Materialien)
- Öffnen Sie die raw-Daten der Bilder mit der Software. Die Schwelle und andere Parameter einstellen, bis die Schiff Strukturen in jeder Schicht des Z-Volumens richtig ausgewählt sind (siehe Benutzerhandbuch für Details in der Software) (Abbildung 4).
- Analysieren Sie die ausgewählten Segmenten Charaktere und exportieren Sie die Daten nach der Anleitung der Software.
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Representative Results
Die distalen Region epididymal weißen Fettgewebe (eWAT), mediale Region des Dorsolumbar subkutane weißen Fettgewebes (sWAT) und medialen Region Interskapuläre braunen Fettgewebe (BAT) wurden gesammelt. Die Standorte für die Erhebung dieser Gewebe sind in Abbildung 1angegeben.
Abbildung 1: Anatomie des subkutanen weißen Fettgewebe (sWAT), epididymal weißen Fettgewebe (eWAT) und braunen Fettgewebe (BAT) zeigt Regionen zum Sammeln von Proben verwendet. (A) die Regionen von weiße gestrichelte Linien repräsentieren sWAT skizziert, und die weißen Sternchen markiert Lage ist die Website für das Sammeln von sWAT. Regionen von schwarzen gestrichelten Linien umrissen sind eWAT, und die schwarze Sternchen markiert Lage ist die Website für das Sammeln von eWAT. (B) die Regionen von schwarzen gestrichelten Linien umrissen sind BAT, und die Gewebe-Sammlung-Region wird durch das Sternchen markiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Nach ganzen-Mount Färbung, wurden die Gewebe-Stücke in einem gut 1 mm Tiefe (Abbildung 2) montiert.
und mit der konfokalen Mikroskop abgebildeten. Wir testeten zuerst die Wirkung der Clearing-Schritt mit 90 % Glycerin Inkubation auf Qualität der Bilder. Wir fanden, dass mehr Blutgefäße positiv gefärbt waren, mit α-Endomucin Antikörper in Glycerin inkubiert sWAT, darauf hindeutet, dass die Clearing-Schritt entscheidend für komplette Färbung der Blutgefäße (Abbildung 3Platten A und B zu vergleichen).
Abbildung 2: Diagramme der Brunnen für das Volume Imaging. (A) Diagramm eines Dias mit einem Silikon-Isolator. (B) Diagramm eines Brunnens mit mehreren Schichten der Band von unserem Labor gemacht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Vergleich der IF Bilder der Blutgefäße Acquiredwith oder ohne optische Clearing Schritt mit 90 % Glycerin. (A) ganze-Mount Immunfluoreszenz (IF) Färbung mit Anti-Endomucin Antikörper (grün) im Swat-Tal. Die Probe wurde nicht zum optischen Ausgleich Schritt (Schritt 3.10) unterzogen. (B) vollständig-hängen wenn mit Anti-Endomucin Antikörper im Swat-Tal Färbungen. Die Probe wurde der optische Clearing Schritt (Schritt 3.10) vor Montageschritte (3.11 und 3.12) unterzogen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Allerdings hatte der Clearing-Schritt mit Glycerin keinen Einfluss auf die Integrität oder die Form der Blutgefäße (Abbildung 3). Diese wohltuende Wirkung in den folgenden Experimenten gegeben, wurde der Clearing-Schritt durchgeführt.
Wir weiter die Ergebnisse von 2D und 3D Analysen mit unterschiedlicher Software verglichen (siehe Tabelle der Materialien). Wir fanden, dass während der 3D-Bilder offenbar genauere strukturelle Informationen bereitgestellt, die beiden analytischen Methoden schließlich nicht signifikante Unterschiede in Bezug auf die Länge und Niederlassung Zahl der Schiffe (Abbildung 4) zeigen.
Abbildung 4: Vergleich der 2D und 3D Analysen auf Schiff Struktur. (A) die Wirkung der maximale Projektion auf die Bilder. (B) die Analyseergebnisse von der 2D Software (siehe Tabelle der Materialien). Insbesondere zeigen die roten Linien ausgewählten Skelett, während die blauen Punkte branding Punkte zeigen. (C) die analytische Ergebnisse durch die 3D-Software (siehe Tabelle der Materialien). Der graue Bereich ist für die Analyse der ausgewählten Region. Die grüne Linie zeigt die gemessenen Segmente und grüne Punkte zeigen die gemessenen Knoten. (D) der Vergleich der Schiff Länge, Segmentnummer, verzweigte Node-Nummern und terminal Node-Nummern von 2D oder 3D Methoden analysiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Bisherige Veröffentlichungen haben gezeigt, dass verschiedene adipose Depots heterogenen Eigenschaften1,18besitzen. Hier haben wir versucht, festzustellen, ob Blutgefäße und Nervenfasern verschiedener Muster unter den Depots mit unserer neu entwickelten Methode aufweisen. Um dies zu erreichen, führten wir Ko IF Färbung mit α-Endomucin (für Blutgefäße) und α-TH (für Nervenfasern) Antikörper im Fettgewebe. Interessanterweise zeigten die Ergebnisse, dass gab es deutlich mehr Blutgefäße und Nervenfasern in BAT im Vergleich zu WATs (Abbildung 5, Vergleiche unten Bahnen zur oberen und mittleren Fahrstreifen)
Abbildung 5: Vergleich der Blutgefäße und Nervenfasern, die aus verschiedenen adipose Depots erworben. Vollständig-hängen wenn Färbung mit Anti-Endomucin (grün) und Anti-Tyrosin Hydroxylase (TH) (rot) Antikörper in eWAT (A, B, Cfusionierte), sWAT (D, E, Ffusionierte) und BAT (G, H, zusammengeführt ich). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Unter die WATs ausgestellt die sWAT höheren Blutgefäß Dichte als der eWAT (Abbildung 5, vergleichen der mittleren bis oberen Lane). Note, während die Nervenfasern, die parallel zu den Blutgefäßen, erweitert zeigen sie nicht erhebliche Co Lokalisierung (Abbildung 5, fusionierten Bahnen). Wir haben weitere quantitativ gemessen Bereich Schiff, Anzahl der Kreuzungen und Rohrlänge mit 2D Methode und fand ähnliche Ergebnisse wie oben (Abbildung 6) beschrieben.
Abbildung 6: Quantitative Analyse der Gefäß- und Nerven Glasfasernetze. (A) der Anteil der Blutgefäß-Bereich in den Proben der eWAT, sWAT und Fledermaus. (B) die Anzahl der Knotenpunkte der vaskulären Netzwerken in eWAT, sWAT und BAT. (C) das gesamte Schiff Länge von vaskulären Netzwerken in eWAT, sWAT und BAT. (D) der Anteil der Neve-Faser-Bereich in den Proben der eWAT, sWAT und BAT. (E) die Anzahl der Kreuzungen der Nervenfasern in eWAT, sWAT und Fledermaus. (F) die gesamte Länge der Nervenfasern in eWAT, sWAT und Fledermaus. Die Analysen wurden mit 2D Software durchgeführt. Die Ergebnisse wurden von den Bildern, die in Abbildung 5dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Zusammenfassend lässt sich sagen, Co gebeizt dieser Ansatz erfolgreich Blutgefäße und Nervenfasern in verschiedenen Fettgewebe.
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Discussion
Fettgewebe Umbau knüpft direkt an metabolischen Dysregulation bei Adipositas Entwicklung1,2. Angiogenese und sympathische Innervation sind unerlässlich für die dynamische umgestaltet Prozess2,12. Daher eines anwendbaren Ansatzes um die Bildung neuer Blutgefäße sowie Nervenfasern zu visualisieren sind von großer Bedeutung. Bisherige Methoden zur Dokumentation von Angiogenese im Fettgewebe berichtet. Allerdings müssen noch einige Probleme mit diesen Ansätzen, wie geringe Effizienz, pingelig Auflösung und lauten Hintergrund. Unterdessen hat sympathische Innervation erst vor kurzem als ein entscheidender Schritt im Fettgewebe Pathologie14anerkannt worden. Obwohl die damit verbundenen Ergebnisse interessant sind, angewandten Methoden erfordern erweiterte Mikroskopie Werkzeuge und sind zeitaufwendig. Hier berichten wir über einen easy-to-Follow Ansatz von unseren vorherigen Protokoll für Co Färbung Blutgefäße und sympathischen Nervenfasern geändert. Interessant ist, wir erfolgreich gefärbt, die Blutgefäße und Nervenfasern mit hoher Auflösung, und die Färbung besitzt Eigenschaften vergleichbar mit zuvor aufgezeichneten Bilder18.
Wir zuvor befleckt die Blutgefäße im Fettgewebe von Immunohistochemistry oder Immunfluoreszenz mit dem α-CD31 Antikörper, eine Markierung von Endothelzellen auf Paraffin-eingebetteten Folien8,13,20. Während die Methode uns ermöglicht, Blutgefäß Dichte zwischen verschiedenen Gruppen zu unterscheiden, waren die mikrovaskuläre Schiffe, die positiv gefärbt waren nicht vollständig. Hier, wir entschieden uns für eine ganze-Mount-Methode und dann durchgeführt, wenn mit einem α-Endomucin Antikörper, ein weiteres Zeichen für Blutgefäße Färbung. Mit dieser optimierten Ansatz konnten wir färben mit mehr Blutgefäße, vor allem Microblood Schiffe zu erreichen. Darüber hinaus in dieser Methode, da wir Schritte wie Paraffin einbetten und Formalin Fixierung, die haben das Potenzial vermieden, die Integrität der Blutgefäße beeinträchtigen, erhielten wir Bilder mit höherer Auflösung und mehr intakte Gefäße. Die ungestörte Struktur der Schiffe weiter uns messen und vergleichen ihre Längen, Verzweigung und Flächen erlaubt. Beachten ist haben wir einen Clearing-Schritt mit Glycerin, so die Gewebe-Brocken könnte transparenter geworden, und diese einfache, aber wichtige Schritt deutlich Effizienz der Färbung18,21 verbesserte.
Angesichts hoher Lipid Inhalt in das Fettgewebe, das die Zugänglichkeit von Antikörpern gegen den inneren Regionen des Gewebes einschränken könnte, kleinschneiden wir die Depots um ausreichend Antikörper binden an die Zielproteine zu gewährleisten. Daher Flecken unserer Methode erfolgreich mehr Blutgefäße und Nervenfasern als Flecken auf ganze Gewebe. Allerdings kann es räumliche Informationen verloren gehen und somit Auswirkungen auf die Integrität der Nervenfasern. Um dieses offensichtliche Problem beheben und sicherzustellen, dass die Bilder zwischen einzelnen Mäusen vergleichbar sind, wird vorgeschlagen, um die kleinen Stücke aus den gleichen Regionen in den adipösen Depots zu sammeln. Ggf. weitere räumliche Informationen weiter, erhalten Sie größere Brocken für das Beflecken. Für größere Proben länger Fixierung Zeiten mit höheren Dosen der FPA, höhere Konzentrationen von Reinigungsmitteln für Permeabilisierung, und längere Antikörper Inkubationszeit erforderlich sein.
Fettgewebe Innervation hat vor kurzem untersucht worden. Mehrere fortgeschrittene Techniken wurden angewandt, um Nervenfasern14,17zu visualisieren. Diese Methoden sind entweder teuer oder zeitaufwendig. Hier führten wir einfach eine IF-Fleck mit α-TH (ein Marker der sympathischen Nerven) und erfolgreich gefärbt die sympathischen Nervenfasern auf einem hohen Qualitätsniveau. Noch wichtiger ist, führten wir die Co Färbung mit α-Endomucin und α-TH zu untersuchen, wie die Blutgefäße mit sympathischen Nervenfasern im Fettgewebe Umbau Zusammenspiel.
Der Hinweis verglichen wir die Ergebnisse aus 2D und 3D Analysen mit unterschiedlicher Software. Es wurde festgestellt, dass während der 3D-Bilder genauere strukturelle Informationen bereitgestellt, die beiden analytischen Methoden nicht signifikanten Unterschied in Bezug auf die Länge und die Verzweigung der Gefäße zeigen. Schließlich kann bei der Analyse der mit der 3D Methode die Software selbst einige falsche Signale erkennen, die manuell angepasst werden müssen. Angesichts der Tatsache, dass die 2D Software absichtlich Schiff Analyse richtet, ist es daher vorgeschlagen, zur Verwendung dieser Methode zur Messung der quantitativ der Struktur der Schiffe.
Mit dieser Methode Blutgefäße und Nervenfasern in verschiedenen Fettgewebe waren Co gebeizt und ihrer dichten Verzweigung und Längen waren im Vergleich19. Es wurde festgestellt, dass Blutgefäße und Nervenfasern viel dicker im BAT im Vergleich zum WAT sind, darauf hindeutet, dass die Fledermaus ein mehr metabolisch aktiven adipösen Depot ist. Außerdem die Blutgefäße und Nerven dichten im Swat-Tal waren höher als in der eWAT darauf hinweist, dass die verschiedenen WATs haben unterschiedliche Profile umgestaltet.
Zusammenfassend, Flecken Co dieser Methode effizient Blutgefäße und Nervenfasern im Fettgewebe5. Darüber hinaus dient es als ein nützliches Instrument zur Untersuchung der dynamischen Veränderungen im Fettgewebe bei Adipositas Entwicklung.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Studie wurde unterstützt durch das National Institute of Health (NIH) Grant R01DK109001 (k.s.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 805-545-180 | Lot: 116969 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Lot: 121944 |
| Amira 6.0 | Thermo Fisher Scientific | Licensed software | |
| Angio tool | National Institutes of Health | Open source software https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home |
|
| Anti-mouse endomucin antibody | R&D research system | AF4666 | Lot: CAAS0115101 |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | Pel Freez Biologicals | P40101-150 | Lot: aj01215y |
| Cover glasses high performance, D = 0.17 mm | Zeiss | 474030-9020-000 | |
| Cytoseal 280 | Thermo Fisher Scientific | 8311-4 | High-viscosity medium |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | |
| Paraformaldehyde,16% | TED PELLA | 170215 | |
| Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep | INVITROGEN | P24744 | Silicone isolator |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| SEA BLOCK Blocking Buffer | Thermo Fisher Scientific | 37527X3 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | |
| Tissue Path IV Tissue Cassettes | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Triton Χ-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Generic term: octoxynol-9 |
| Tube rotator and rotisseries | VWR | 10136-084 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Generic term: Polysorbate 20 |
References
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