Summary
Nytt blod fartøy dannelse og sympatisk gir spille viktige roller i fettvev remodeling. Det gjenstår imidlertid tekniske problemer i visualisere og kvantitativt måle fettvev. Her presenterer vi en protokoll for å kunne merke og kvantitativt sammenligne tettheter av blod fartøy og nerve fiber i forskjellige liggende under adipose vev.
Abstract
Nyere studier har fremhevet kritisk rolle angiogenese og sympatisk gir i fettvev remodeling under utviklingen av fedme. Det er derfor nødvendig å utvikle en enkel og effektiv metode for å dokumentere de dynamiske endringene i fettvev. Her beskriver vi en modifisert immunofluorescent tilnærming som effektivt co flekker blod fartøy og nerve fiber i liggende under adipose vev. Sammenlignet med tradisjonelle og nylig utviklet metoder, er vår tilnærming relativt enkle å følge og mer effektive i merking blodkar og nervefibrene med høyere tetthet og mindre bakgrunn. Videre tillater høyere oppløsning av bildene ytterligere oss å måle nøyaktig området av fartøy, mengde forgrening, og lengden på fiber av open source programvare. Som en demonstrasjon ved hjelp av vår metode, viser vi den brune fettvev (BAT) inneholder større mengder blod fartøy og nerve fibre sammenlignet med hvit fettvev (WAT). Vi videre finner at blant WATs, subkutan WAT (sWAT) har mer blod fartøy og nerve fiber i forhold til epididymal WAT (eWAT). Vår metode gir dermed et nyttig verktøy for å undersøke fettvev remodeling.
Introduction
Fettvev har metabolske og endokrine fungerer1. Det dynamisk utvides eller forminskes svar på ulike næringsstoffer understreker2. Aktive vev remodeling prosessen består av flere fysiologiske baner/trinn inkludert angiogenese fibrose og utformingen av lokale inflammatorisk microenvironments2,3,4. Noen fysiske stimuli, som kaldt eksponering og mosjon, kan utløse sympatisk aktivisering, som til slutt fører til dannelse av nytt blod fartøy og sympatisk gir i liggende under adipose vev5,6. Prosessene remodeling er knyttet tett til systemisk metabolsk resultater inkludert insulinfølsomhet, kjennetegnet av type 2 diabetes2. Dermed er visualisering av disse patologiske forandringer svært viktig å forstå sunne status for hele liggende under adipose vev.
Angiogenese er prosessen av nytt blod fartøy formasjon. Siden blodkar skaffe oksygen, næringsstoffer, hormoner og vekstfaktorer til vev, angiogenese har vært ansett som et viktig skritt i fettvev remodeling, som har blitt dokumentert med ulike teknikker6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. det beholdes imidlertid spørsmål om oppløsningen på bildene, effektiviteten av immunostai- og metoder for kvantifisering av fartøyet. Sammenlignet med nytt blod fartøy formasjon, har gir i fettvev vært undervurdert i lang tid. Nylig Zeng et al. 14 brukes Avansert intravital to-fotonet mikroskopi og vist at adipocytter er omgitt av lag av nerve fibre14. Siden da begynte forskere å verdsette den avgjørende rollen sympatisk gir i regulering av fettvev fysiologi. Derfor er det viktig å utvikle en enkel og praktisk tilnærming til dokumentet adipose nerve gir.
Her rapporterer vi en optimalisert metode for den co flekker av blod fartøy og nerve fiber basert på våre tidligere protokoller. Med denne metoden kan vi oppnå klare bilder av blod fartøy og nerve fiber uten støyende bakgrunn. Dessuten får vi en oppløsning som er høy nok til å utføre kvantitativ måling av tettheter med åpen kildekode. Ved hjelp av denne nye tilnærmingen, kan vi kunne sammenligne strukturer og tettheter av blod fartøy og nerve fiber i forskjellige adipose depoter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som inneholder dyr fag er godkjent av dyr velferd komiteen av University of Texas Health Science Center i Houston (dyr Protokollnummer: AWC-18-0057).
1. forberedelse av reagenser
- 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS, pH 7.4): for å gjøre 1 L 1 x PBS, oppløse 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4og 0,24 g KH2PO4 800 mL destillert vann. Justere pH 7.4 og fyll med destillert vann å oppnå et endelig antall 1 L.
- 1% paraformaldehyde i 1 x PBS (1% PFA, wt/vol): for å oppnå et endelig antall 50 mL, legge 3,125 mL av 16% PFA (se Tabell of Materials) til 46.875 mL 1 x PBS. Bland godt og lagre på 4 ° C for senere bruk.
Forsiktig: Paraformaldehyde er giftig. Alle prosedyrer gjennomføres under avtrekksvifte å unngå innånding og hudkontakt. - 0,1% polysorbat 20 (se tabell av materialer) i 1 x PBS (1 x PBST, pH 7.4, vol/vol): for å oppnå et endelig antall 50 mL, legger du til 0,05 mL polysorbat 20 til 49,95 mL 1 x PBS. Vortex og butikk på 4 ° C i opptil 1 måned.
- 1% octoxynol-9 (se Tabell for materiale) i 1 x PBS (1 x PBS-TX, pH 7.4, vol/vol): for å oppnå et endelig antall 10 mL, legge til 0,1 mL av octoxynol-9 9.9 mL 1 x PBS. Vortex og butikk på 4 ° C i opptil 1 måned.
- 2% Natriumazid (wt/vol): for å produsere 10 mL av 2% Natriumazid, legge 0.2 g Natriumazid til 10 mL 1 x PBS. Bland godt og lagre på 4 ° C for senere bruk.
- 90% glyserol i 1 x PBS (vol/vol): for å oppnå et endelig antall 10 mL, Legg 1 mL 1 x PBS til 9 mL glyserol. Vortex og butikken ved romtemperatur (RT) for senere bruk.
2. dyr Ddissection og fettvev samling
- Bruk 6-uke-gamle C57BL/6J mannlige mus. Bedøve mus med isoflurane (4-5% for induksjon deretter 1-2% for vedlikehold). Når anesthetized, utføre en tå-klype refleks for å fastsette anesthetic, dommer av mangel på pedalen reflekser. Når mus er dypt anesthetized, dissekere mus følger protokollen som er publisert tidligere15.
- Sterilisere sløv saksen og kirurgiske området av brystet (trenger ikke å barbere håret). Åpne brystet ved å kutte mellomgulvet og ribbeina langs lateral overflaten med en størrelse på ~ 2 cm med sløv saks. Klemme brystet flagget med hemostat og reflektere det ved å sette hemostat over hodet.
- Lag et lite innsnitt i venstre ventrikkel (~0.5 cm) med iris saks. Sette inn en oliven-tipped perfusjon p via webområdet snitt og klemme pinne-spissen på plass med hemostat. Fest nålen 50 mL sprøyte som inneholder paraformaldehyde fiksering løsning (1% PFA, pH 7.4).
- Åpne høyre atriet ved delen kutte med iris saks som perfusjon uttaket. Start perfusjon av forsiktig og kontinuerlig skyve sprøyten frekvensen perfusjon nær 10 mL/min. stoppe skyve når væske ut stikkontakten er klart noen blod. Hele prosessen bør kreve ~ 5 min.
Forsiktig: Fremgangsmåten under avtrekksvifte å hindre toxicity fra PFA. - Dissekere hvit og brun liggende under adipose vev fra mus. Bruk saks for å bryte vevsprøver i små biter av biter ca 5 x 5 x 3 mm3. Overføre små biter med sterilisert pinsett inn i vevet embedding kassetter med riktig merking av vevsprøver på kassettene.
- Fordype innebygging kassettene som inneholder vevsprøver i fiksering løsningen (1% PFA i 1 x PBS, pH 7.4) på 4 ° C for 24 48 h.
Merk: Fiksering løsningen og fiksering tid varierer basert på størrelsen på vev16,17,18. - Vask prøvene med fersk 1 x PBS buffer tre ganger (0,5 mL/vask).
Forsiktig: Utføre dette trinnet under avtrekksvifte. Paraformaldehyde avfall skal håndteres riktig ifølge farlig avfall avhending prosedyrer.
Merk: Vev kan lagres i 1 x PBS på 4 ° C for videre behandling.
3. antistoff inkubasjon
- Skjær de faste vevsprøver i ca 2 mm3 kuber med sterilisert saksen. For permeabilization, overføre prøvene til en 1,5 mL tube som inneholder 1 mL 1 x PBS-TX (1% octoxynol-9 i 1 x PBS, se tabellen for materialer, pH 7.4) og forsiktig rotere rørene på RT 1t 18 RPM.
- Fjern forsiktig 1 x PBS-TX av aspirasjon. Vask prøvene 3 x ved å legge til 1 x PBS direkte inn i samme rørene (ikke nødvendig å endre rør). Under hver vask, invertere rør flere ganger.
- For blokkering, Legg til 0,5 mL blokkerer bufferen (Tabell for materiale) i prøvene og ruge på RT for 2t med mild rotasjon.
- For å forberede 0,4 mL primære antistoff løsning, fortynne 2 μL anti - endomucin (markør av blodkar) 5 (1:200) og 2 μL anti-tyrosin hydroksylase (TH, markør for nerve fiber) 5 (1:200, 1 µg/mL) antistoffer (tabell for materiale antistoffer informasjon) i 396 μL blokkerer buffer. Vortex og spinn ned gjenopprette volumet.
- Den første antistoff inkubering, nøye fjerne blokkering bufferen fra vev biter. Tilsett 100 μL av primære antistoff løsning utarbeidet i trinn 3.4 i rør og ruge på 4 ° C over natten.
Merk: Antistoff fortynning og inkubasjon tiden kan variere mellom forskjellige antistoffer. Det anbefales å legge til 0.02% Natriumazid antistoff-løsning for å hindre mikrobiell vekst. For å forberede 0,4 mL primære antistoff løsning med Natriumazid, legger du til 4 μL antistoffer (1 μL av hver) og 4 μL 2% Natriumazid i 392 μL blokkerer buffer. - Nøye samle den primære antistoff løsningen for gjenbruk hvis ønskelig. Vask prøvene med 1 x PBST (pH 7.4, 100 µL/vask) tre ganger (30 min hver) med mild rotasjon på 18 rpm.
- For utarbeidelse av sekundær antistoff løsning, fortynnet 2 μL fluorophore (bølge lengde 495 nm) konjugert anti-geit IgG (1:200) og 2 μL fluorophore (bølge lengde 650 nm) konjugert anti-kanin IgG (1:200) (se Tabell for materiale) i 396 μL blokkerer buffer. Vortex og spinn kort for å samle all væsken.
Merk: Beskytte prøvene fra lys under følgende prosedyrer. - For den andre antistoff inkubering, kan du fjerne den siste vaskebuffer fra prøver. Tilsett 100 μL av sekundær antistoff løsning i rør og ruge på RT for 2t med mild rotasjon på 18 rpm.
- Fjern forsiktig sekundære antistoff løsningen. Vask prøvene 3 x 1 x PBST (pH 7.4, 30 min hver) med mild rotasjon på 18 rpm.
Merk: Du må ikke bruke dette sekundære antistoff løsning, som det kan være forurenset med de spor av primære antistoffer brakt av vev. - For optisk klarering, fordype eksemplene i 1 mL av 90% glyserol og holde prøvene på 4 ° C i mørket før de blir gjennomsiktig.
Merk: Nedsenking varigheten avhenger av vev type og størrelse. Vanligvis trenger en 2 mm3 terningen av hvite fettvev overnatting inkubering, mens de samme størrelse brun fettvev eksempel behovene lenger. - Følge en silikon isolator i lysbildet for å opprette en godt for volum bildebehandling. Alternativt legge flere lag av gjennomsiktig tape til lysbildene og kuttet en firkant av midten for å opprette en (figur 2).
Merk: Justere dybden til utvalgsstørrelsen. I denne protokollen brukes en 1 mm dybde. - Nøye overføre prøvene i brønnen og fyll den med montering medium (se Tabell for materiale). Lå en cover slip på overflaten og forsegle hjørnene av cover slip med høy viskositet medium (se Tabell for materiale). La montering middels kur for 24 h på RT i mørket.
Merk: Kontroller at ingen plass er igjen populasjonsutvalg og cover slip. Unngå bobler under cover slip. Unngå å plassere overdrevent press på prøvene.
4. bildeopptak
- Erverve Z-stakk bilder (se trinn 4.2-4.7) med 20 x målet med en AC confocal mikroskop/programvare.
- Starte systemet. Klikk kategorien <Configuration> og aktivere argon laser og HeNe 633 laser. Klikk på kategorien <anskaffe>. I <synlig> laser linjer panelet flytte skyvekontrollene for tilsvarende intensitet til velge laser linjene av 488 nm og 633 nm. I utgangspunktet kan intensiteten settes til 20%-30%. Velg 488/561/633 trippel dichoric speilet. Aktivere PMTs ved å klikke på den <aktive> avmerkingsbokser, velge PMT1 for utslipp opphisset av 488 nm laser og PMT3 for at av 633 nm laser. Angi bølgelengdeområde til 500-550 nm for PMT1 og 650-750nm for PMT3. Velg psudocolor som skal brukes for bildevisning av dobbel klikker fargede firkanten ved siden av hvert avdrag og velger en farge fra lokalmenyen.
- Klikk <Live> å se bildet av eksempler. Bruk z-posisjon knotten for å velge flyet av fokus i XY regionen rundt. Juster lysstyrken på bildene ved å justere laseren intensiteten, smart gevinst og forskyvning. For hver fluorescens kanal, kan du utføre denne justeringen under visningsmodus <QLUT> (rask se opp tabell). Klikk på knappen <QLUT> Angi QLUT modus, som mettet piksler vises i blått å hjelpe innstillingen av aktuelle lysstyrken. Klikk to ganger på knappen <QLUT> gå tilbake til pseudofarger, det vil visningsmodus.
Merk: De numeriske verdiene for kan variere mellom hvert eksperiment. - Skanner vri Z-posisjon-knotten mot klokken for å flytte fokus plan til den ene enden av volumet av interesse og klikk på <slutten> pilspissen angi skanning slutten posisjonen. Deretter urviserne Z-posisjon knotten flytte flyet av fokus gjennom prøven til den andre enden av volumet av interesse, og klikk deretter på pilspissen <Start> Angi skanning begynner posisjonen.
Merk: Definere samme Z-volum for forskjellige prøver sammenligningen mellom ulike eksempler. - Justere z-trinn størrelsen 3 µm. endre bildekvaliteten ved å velge av 1024 x 1024, hastighet på 100 Hz og linje gjennomsnitt på 2.
- Velg <starte > å starte bildeopptak z stabel.
- For maksimal projeksjon av den ervervet bildestakk, klikker du kategorien <prosessen> og deretter <verktøy>, velger <3D projeksjon> og angir <maksimal> i listen metoden uten endringer til X, Y og Z. Sett <Terskelen> 0. Klikk <bruker>. Den maksimale intensiteten av Z-volumet vil bli stablet i et 2D-bilde som vises (figur 4A).
5. analyse av blod fartøy og Nerve Fiber nettverk
-
Analyse av 2D-bilder via åpen kildekode (se tabell for materiale)19
- Åpne stablet i programvaren. Justere fartøyet diameter og intensitet til fartøyet strukturer kan være riktig merket (figur 4B).
- Velg Kjør analyse og eksportere dataene etter veiledning av programvaren.
-
Analyse av 3D bilder via den lisensierte programvaren (se tabell for materiale)
- Åpne rådata om bildene med programvaren. Justere terskelen og andre parametere til fartøyet strukturer i hvert lag av z-volumet er riktig merket (se brukerhåndboken for detaljer i programvaren) (figur 4C).
- Analyserer valgte segmenter tegnene og eksportere data følger veiledning av programvaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den distale regionen epididymal hvite fettvev (eWAT), mediale regionen dorsolumbar subkutan hvit fettvev (sWAT) og mediale regionen interscapular brun fettvev (BAT) ble samlet. Stedene for å samle disse vev angis i figur 1.
Figur 1: anatomi av subkutan hvit fettvev (sWAT), epididymal hvit fettvev (eWAT) og brun fettvev (BAT) angir områder brukes for innsamling prøvene. (A) regioner skissert av hvite stiplede linjer representerer sWAT og hvit stjerne fremhevet plasseringen er stedet for å samle sWAT. Regioner skissert av svart stiplede linjer er eWAT, og svart stjerne fremhevet plasseringen er stedet for å samle eWAT. (B) regioner skissert av svart stiplede linjer er BAT, og regionen vev samling er markert med stjerne. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Etter hele-mount var vev biter montert i en brønn 1 mm dybde (figur 2)
og fotografert med AC confocal mikroskop. Vi først testet effekten av clearing trinnet med 90% glyserol inkubasjon på kvaliteten på bildene. Vi fant at mer blod fartøy var positivt beiset med α-endomucin antistoff glyserol-ruges sWAT, tyder på at clearing trinnet er kritisk for komplett farging av blodkar (Figur 3, sammenligne paneler A og B).
Figur 2: diagrammer av for volum bildebehandling. (A) av et lysbilde med en silikon isolator. (B) Diagram av en godt med flere lag av tape gjort av våre lab. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: sammenligning av hvis bilder av blod fartøy acquiredwith eller uten optisk clearing trinnet med 90% glyserol. (A) hele-mount immunofluorescence (hvis) flekker med anti-endomucin antistoff (grønn) i sWAT. Prøven utsettes ikke til optiske clearing trinn (trinn 3.10). (B) hele-mount hvis farging med anti-endomucin antistoffer i sWAT. Prøven ble utsatt til optiske clearing trinn (trinn 3.10) før montering trinnene (trinn 3.11 og 3.12). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Men påvirke det clearing trinnet med glyserol ikke integriteten eller form av blodkar (Figur 3). Gitt disse gunstige effekter, i følgende eksperimenter, ble clearing trinnet utført.
Vi ytterligere sammenlignet resultatene av 2D- og 3D-Analyser bruker forskjellig programvare (se Tabell for materiale). Vi fant at mens de 3D-bildene gitt tilsynelatende mer detaljert strukturinformasjon, to analytiske metoder til slutt ikke vise betydelige forskjeller i lengde og gren antall fartøyene (Figur 4).
Figur 4: sammenligning av 2D og 3D Analyser på fartøyet struktur. (A) effekten av maksimal projeksjon på bildene. (B) analytisk resultatene av 2D (se Tabell for materiale). Spesielt indikerer de røde linjene valgte skjelett, mens de blå prikkene indikerer branding poeng. (C) den analytiske resultater av 3D-programvare (se Tabell for materiale). Det grå området er den valgte regionen for analyse. Den grønne linjen angir målt segmentene og grønne prikker indikerer målt nodene. (D) sammenligningen av fartøyet lengde, segmentet tall, forgrening nodenumre og terminal node tallene analyseres av 2D eller 3D. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tidligere publikasjoner har vist at ulike adipose depoter har heterogene egenskaper1,18. Her forsøkte vi å fastslå om blod fartøy og nerve fiber utstillingen ulike bruksmønstrene blant depoter med vår nylig utviklede metode. For å oppnå dette, utført vi co hvis flekker med α-endomucin (for blodårene) og α-te (for nerve fiber) antistoffer som fettvev. Interessant, viste resultatene at det var betydelig mer blod fartøy og nerve fiber i BAT sammenlignet WATs (figur 5, sammenligne bunnen baner til toppen og midtre kjørefelt)
Figur 5: sammenligning av blod fartøy og nerve fiber fra forskjellige adipose depoter. Hele-mount hvis flekker med anti-endomucin (grønn) og anti-tyrosin hydroksylase (TH) (rød) antistoffer i eWAT (A, B, fusjonerte i C), sWAT (D, E, fusjonerte i F) og BAT (G, H, fusjonerte i jeg). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Blant WATs, utstilt i sWAT høyere blod fartøy tetthet enn eWAT (figur 5, sammenligne midten toppen lane). Av notatet, mens nervefibrene utvidet parallelt med blodkar, viser de ikke betydelig co lokalisering (figur 5, flettede baner). Vi ytterligere målt kvantitativt fartøyet området, veikryss og røret lengde med 2D metoden og lignende treff som beskrevet ovenfor (figur 6).
Figur 6: kvantitativ analyse av vaskulær og nerve fiber nettverk. (A) prosentandelen av blod fartøy området i utvalgene av eWAT, sWAT og BAT. (B) antall knutepunkter i det vaskulære nettverk i eWAT, sWAT og BAT. (C) totalt fartøyet lengden av vaskulære nettverk i eWAT, sWAT og BAT. (D) prosentandelen av neve fiber området i utvalgene av eWAT, sWAT og BAT. (E) antall knutepunkter i nervefibrene i eWAT, sWAT og BAT. (F) totalen lengden av nerve fibre i eWAT, sWAT og BAT. Analysene ble utført med 2D-programvare. Resultatene ble oppnådd fra bildene presentert i figur 5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
I sammendraget, denne tilnærmingen vellykket co farget blod fartøy og nerve fiber i forskjellige liggende under adipose vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fettvev remodeling er direkte knyttet til metabolske feilregulering under fedme utvikling1,2. Angiogenese og sympatisk gir er både viktig for dynamisk remodeling prosessen2,12. Derfor utvikler en gjeldende tilnærming for å se den nye blodkar, samt nerve fiber er av stor betydning. Metodene er rapportert for å dokumentere angiogenese i fettvev. Imidlertid fortsatt noen problemer med disse tilnærminger, inkludert lav effektivitet, masete oppløsning og støyende bakgrunn. I mellomtiden blitt sympatisk gir bare anerkjent nylig som et viktig skritt i fettvev patologi14. Selv om relaterte funnene er interessant, anvendt metoder krever avansert mikroskopi verktøy og er tidkrevende. Her rapporterer vi en lett-å-følge tilnærming endret fra vår forrige protokoll for co flekker blodkar og sympatiske nerve fibre. Interessant, vi farget er av blod fartøy og nerve fiber med høy oppløsning, og den flekker har egenskaper sammenlignes med tidligere rapportert bilder18.
Vi har tidligere farget blodkar i liggende under adipose vev av immunohistochemistry eller immunofluorescence med α-CD31 antistoffer, en markør av endotelceller, parafin-embedded lysbilder8,13,20. Mens metoden tillater oss å skille blod fartøy tetthet mellom ulike grupper, ble mikrovaskulær fartøyene ble positivt farget ikke fullført. Her, vi valgte en hele-mount metode og utført hvis flekker med et α-endomucin antistoff, en annen markør for blodårene. Med denne optimalisert tilnærming kunne vi oppnå farging med mer blodkar, spesielt microblood fartøy. Videre i denne metoden fikk siden vi unngått trinn som parafin innebygging og formalin fiksering, som har potensial til å svekke integriteten til blodårene, vi bilder med høyere oppløsning og mer intakt fartøy. Usvekket strukturen av fartøyene ytterligere tillot oss å måle og sammenligne deres lengder, forgrening og områder. Av notatet lagt vi et clearing skritt med glyserol, så vev biter kan bli mer gjennomsiktig, og denne enkle, men avgjørende trinn vesentlig forbedret effektiviteten av flekker18,21.
På grunn av høye lipid innholdet i fettvev, som kan begrense tilgjengeligheten av antistoffer mot de indre områdene av vev, kuttet vi til depoter i små biter å sikre tilstrekkelig antistoff binding til målet proteiner. Derfor flekker våre metoden lykkes mer blod fartøy og nerve fiber enn flekker på hele vev. Det kan imidlertid miste romlig informasjon og dermed påvirke integriteten til nervefibrene. Å løse tilsynelatende problemet og sikre bildene er sammenlignbare blant enkelte mus, er det foreslått for å samle små biter fra samme regionene i de adipose depoter. Hvis flere romlig informasjon er videre nødvendig, bør større biter oppnås for flekker. For større prøver, lengre fiksering ganger med høyere doser av FPA, høyere konsentrasjoner av vaskemidler for permeabilization, og lengre perioder med antistoff inkubering kan være nødvendig.
Fettvev innervering har blitt undersøkt nylig. Flere avanserte teknikker er brukt for å visualisere nervefibre14,17. Disse metodene er enten dyre eller tidkrevende. Her, vi bare utført en hvis flekken med α-te (merketråd sympatiske nerve) og vellykket farget sympatiske nerve fiber med høy kvalitet. Enda viktigere, utført vi den co flekker med α-endomucin og α-te å undersøke hvordan blodkar samspill med sympatiske nerve fiber under fettvev remodeling.
Av notatet sammenlignet vi resultatene fra 2D- og 3D-Analyser bruker forskjellig programvare. Det ble funnet at mens 3D bilder forutsatt mer detaljert strukturinformasjon, to analytiske metoder ikke viser betydelig forskjell i forhold til lengden og forgrening av fartøyene. Til slutt, når analysere med metoden 3D, kan selve programvaren oppdage noen falske signaler som må justeres manuelt. Gitt at 2D programvaren er med hensikt utviklet for fartøyet analyse, anbefales det derfor for å bruke denne metoden for å måle kvantitativt strukturen av fartøy.
Med denne metoden blod fartøy og nerve fiber i forskjellige fettvev var co farget, og deres tettheter, forgrening og lengder var forhold19. Det ble funnet at både blod fartøy og nerve fiber er mye tykkere i BAT sammenlignet WAT, foreslå BAT som en mer metabolically aktiv adipose depot. Videre den blod fartøy og nerve tettheter i sWAT var høyere enn i eWAT, som indikerer at ulike WATs har forskjellige remodeling profiler.
I konklusjonen, flekker denne metoden effektivt co blod fartøy og nerve fiber i fettvev5. Videre, det fungerer som et nyttig verktøy for å studere de dynamiske endringene i fettvev under utviklingen av fedme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av National Institute of Health (NIH) grant R01DK109001 (til K.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 805-545-180 | Lot: 116969 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Lot: 121944 |
| Amira 6.0 | Thermo Fisher Scientific | Licensed software | |
| Angio tool | National Institutes of Health | Open source software https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home |
|
| Anti-mouse endomucin antibody | R&D research system | AF4666 | Lot: CAAS0115101 |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | Pel Freez Biologicals | P40101-150 | Lot: aj01215y |
| Cover glasses high performance, D = 0.17 mm | Zeiss | 474030-9020-000 | |
| Cytoseal 280 | Thermo Fisher Scientific | 8311-4 | High-viscosity medium |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | |
| Paraformaldehyde,16% | TED PELLA | 170215 | |
| Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep | INVITROGEN | P24744 | Silicone isolator |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| SEA BLOCK Blocking Buffer | Thermo Fisher Scientific | 37527X3 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | |
| Tissue Path IV Tissue Cassettes | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Triton Χ-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Generic term: octoxynol-9 |
| Tube rotator and rotisseries | VWR | 10136-084 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Generic term: Polysorbate 20 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. Adipose tissue remodeling and obesity. Journal of Clinical Investigations. 121 (6), 2094-2101 (2011).
- Sun, K., et al. Endotrophin triggers adipose tissue fibrosis and metabolic dysfunction. Nature Communication. 5, 3485 (2014).
- Zhao, Y., et al. Divergent functions of endotrophin on different cell populations in adipose tissue. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 311 (6), E952-E963 (2016).
- Zhao, Y., et al. Transient Overexpression of VEGF-A in Adipose Tissue Promotes Energy Expenditure via Activation of the Sympathetic Nervous System. Molecular and Cellular Biology. , (2018).
- Xue, Y., et al. Hypoxia-independent angiogenesis in adipose tissues during cold acclimation. Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).
- Chen, S., et al. LncRNA TDRG1 enhances tumorigenicity in endometrial carcinoma by binding and targeting VEGF-A protein. BBA Molecular Basis of Disease. 1864 (9 Pt B), 3013-3021 (2018).
- Sun, K., et al. Dichotomous effects of VEGF-A on adipose tissue dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (15), 5874-5879 (2012).
- During, M. J., et al. Adipose VEGF Links the White-to-Brown Fat Switch With Environmental, Genetic, and Pharmacological Stimuli in Male Mice. Endocrinology. 156 (6), 2059-2073 (2015).
- Elias, I., et al. Adipose tissue overexpression of vascular endothelial growth factor protects against diet-induced obesity and insulin resistance. Diabetes. 61 (7), 1801-1813 (2012).
- Sung, H. K., et al. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17 (1), 61-72 (2013).
- Cao, Y. Angiogenesis and vascular functions in modulation of obesity, adipose metabolism, and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 18 (4), 478-489 (2013).
- Sun, K., et al. Brown adipose tissue derived VEGF-A modulates cold tolerance and energy expenditure. Molecular Metabolism. 3 (4), 474-483 (2014).
- Zeng, W., et al. Sympathetic neuro-adipose connections mediate leptin-driven lipolysis. Cell. 163 (1), 84-94 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Berry, R., et al. Imaging of adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).
- Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
- An, Y. A., et al. Angiopoietin-2 in white adipose tissue improves metabolic homeostasis through enhanced angiogenesis. eLife. 6, (2017).
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
