Summary
Nieuw bloed vaartuig vorming en sympathieke innervatie arm spelen cruciale rol in het adipeus weefsel remodeling. Er blijven echter technische problemen in het visualiseren en kwantitatief meten van vetweefsel. Hier presenteren we een protocol om met succes een label en de dichtheden van bloedvaten en zenuwvezels in verschillende vetweefsel kwantitatief te vergelijken.
Abstract
Recente studies hebben gewezen op de kritische rol van angiogenese en sympathieke innervatie arm in adipeus weefsel remodeling tijdens de ontwikkeling van obesitas. Daarom is het noodzakelijk de ontwikkeling van een gemakkelijke en efficiënte methode om te documenteren van de dynamische veranderingen in adipeus weefsel. Hier beschrijven we een gemodificeerde immunefluorescentie benadering die efficiënt mede bloedvaten en zenuwvezels in vetweefsel vlekken. Vergeleken met traditionele en onlangs ontwikkelde methoden, is onze aanpak relatief makkelijk te volgen en efficiënter in de bloedvaten en zenuwvezels met hogere dichtheden en minder achtergrond benoemen. Bovendien, de hogere resolutie van de beelden verder laat ons toe om nauwkeurige meting van het gebied van de schepen, de hoeveelheid vertakking en de lengte van de vezels door de open source-software. Als een demonstratie met onze methode, laten we zien dat bruin vetweefsel (BAT) bevat hogere bedragen van bloedvaten en zenuwvezels in vergelijking met witte vetweefsel (WAT). We verder zoeken dat onder de WATs, subcutane WAT (sWAT) heeft meer bloedvaten en zenuwvezels in vergelijking met epididymaire WAT (eWAT). Onze methode biedt dus een nuttig instrument voor het onderzoeken van adipeus weefsel remodeling.
Introduction
Vetweefsel heeft sleutel metabole en endocriene functies1. Het dynamisch vergroot of verkleind in een reactie op verschillende voedingsstoffen benadrukt2. Het actieve weefsel remodeling proces bestaat uit meerdere fysiologische paden/stappen met inbegrip van angiogenese, fibrose en vormgeven van lokale inflammatoire microenvironments2,3,4. Bepaalde fysieke prikkels, zoals koude blootstelling en lichaamsbeweging, kunnen leiden tot sympathiek activering, die uiteindelijk tot de vorming van nieuw bloed vaartuig en sympathieke innervatie arm in vetweefsel5,6 leidt. Deze remodelleert processen zijn nauw verbonden met systemische metabole resultaten, met inbegrip van insulinegevoeligheid, het kenmerk van type 2 diabetes2. Visualisatie van deze pathologische veranderingen is dus zeer belangrijk voor het begrip van de gezonde status van hele vetweefsel.
Angiogenese is het proces van de vorming van nieuw bloed vaartuig. Aangezien bloedvaten zuurstof, voedingsstoffen en hormonen, groeifactoren aan weefsel, angiogenese is beschouwd als een belangrijke stap in het adipeus weefsel remodeling, die heeft aangetoond met verschillende technieken6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. er blijven echter vragen over de resolutie van de beelden, de doeltreffendheid van immunokleuring en methoden voor de kwantificering van de dichtheid van het vaartuig. Vergeleken met vorming van nieuw bloed vaartuig, is innervatie arm in adipeus weefsel onderschat voor een lange tijd. Onlangs, Zeng et al.. 14 gebruikt geavanceerde intravital twee-foton microscopie en aangetoond dat adipocytes worden omgeven door lagen van zenuwvezels14. Sindsdien zijn onderzoekers begonnen met het waarderen van de centrale rol van de sympathieke innervatie arm in verordening van vetweefsel fysiologie. Ontwikkelen van een eenvoudige en praktische benadering van document obesitas zenuw innervatie arm is dus belangrijk.
Wij rapporteren hier een geoptimaliseerde methode voor de co kleuring van bloedvaten en zenuwvezels, gebaseerd op onze eerdere protocollen. Met deze methode kunnen we duidelijke beelden van bloedvaten en zenuwvezels zonder lawaaierige achtergrond. Bovendien krijgen we een resolutie die hoog genoeg is voor het uitvoeren van kwantitatieve meting van dichtheden met open sourcesoftware. Met behulp van deze nieuwe aanpak, kunnen we met succes het vergelijken van de structuren en de dichtheid van bloedvaten en zenuwvezels in verschillende obesitas depots.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures die bevatten dierlijke onderwerpen zijn goedgekeurd door de Animal Welfare Comité van University of Texas Health Science Center in Houston (dierlijke protocolnummer: AWC-18-0057).
1. reagens voorbereiding
- 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7.4): om 1 L 1 x PBS, Los 8 g NaCl, KCl 0.2 g, 1,44 g nb2HPO4en 0,24 g van KH2PO4 in 800 mL gedestilleerd water. Breng de pH op 7.4 en vullen met gedestilleerd water tot een eindvolume van 1 L.
- 1% paraformaldehyde in 1 x PBS (1% PFA, wt/vol): om te bereiken een eindvolume van 50 mL, voeg 3.125 mL van 16% PFA (Zie Tabel van materialen) aan 46.875 mL 1 x PBS. Meng goed en bewaren bij 4 ° C voor later gebruik.
Let op: Paraformaldehyde is giftig. Alle procedures moeten worden uitgevoerd onder een zuurkast te voorkomen van inademing en huidcontact. - 0,1% Polysorbaat 20 (Zie tabel van materialen) in 1 x PBS (1 x PBST, pH 7.4, vol/vol): om te bereiken een eindvolume van 50 mL, Voeg 0,05 mL Polysorbaat 20 voor 49,95 mL 1 x PBS. Vortex en bewaren bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.
- 1% octoxynol-9 (Zie Tabel van materialen) in 1 x PBS (1 x PBS-TX, pH 7.4, vol/vol): om te bereiken een eindvolume van 10 mL, meng 0,1 mL van octoxynol-9 9.9 mL 1 x PBS. Vortex en bewaren bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.
- 2% natriumazide (wt/vol): 10 mL 2% natriumazide, voegt toe 0.2 g van natriumazide aan 10 mL 1 x PBS. Meng goed en bewaren bij 4 ° C voor later gebruik.
- 90% glycerol in 1 x PBS (vol/vol): om te bereiken een eindvolume van 10 mL, voeg 1 mL 1 x PBS tot 9 mL glycerol. Vortex en winkel bij kamertemperatuur (RT) voor later gebruik.
2. dierlijke Ddissection en vetweefsel collectie
- Gebruik 6-week-oude C57BL/6J mannelijke muizen. Anesthetize van de muizen met Isofluraan (4%-5% voor inductie vervolgens 1-2% voor onderhoud). Nadat verdoofd, uitvoeren een teen-snuifje reflex om te bepalen van de verdoving diepte, te oordelen naar het gebrek aan pedaal reflexen. Zodra de muizen zijn diep verdoofd, ontleden de muizen die volgens het protocol als eerder gepubliceerde15.
- Steriliseren de botte schaar en chirurgische gebied van de borst (geen behoefte te scheren van het haar). Open de borst door het snijden van het middenrif en de ribben langs de laterale oppervlak met een grootte van ~ 2 cm met behulp van botte schaar. De vlag van de borst met hemostat klem en weerspiegelen het door de invoering van de hemostat over het hoofd.
- Maken een kleine snede in het linkerventrikel (~0.5 cm) met iris schaar. Invoegen van een olijf-tipped perfusie naald via de site van de incisie en klem het uiteinde van de naald op de plaats met de hemostat. Bevestig de naald aan een 50 mL injectiespuit met paraformaldehyde fixatie oplossing (1% PFA, pH 7.4).
- Open de juiste atrium door sectie snijden met iris schaar als de perfusie-outlet. Starten van de perfusie door zachtjes en continu duwen de spuit in een tempo perfusie dicht bij 10 mL/min. stoppen duwen wanneer de vloeistof verlaten van de uitlaat duidelijk van alle bloed is. Het hele proces moet ~ 5 min.
Let op: Voer deze stappen uit onder een zuurkast om te voorkomen dat toxiciteit van PFA. - Ontleden wit en bruin vetweefsel van de muizen. Gebruik schaar te breken de weefselmonsters in kleine stukjes van brokken ongeveer 5 x 5 x 3 mm,3. Pipetteer de kleine stukjes met de gesteriliseerde pincet in het weefsel insluiten cassettes met juiste etikettering van de weefselmonsters op de cassettes.
- Dompel de insluiten cassettes met weefselmonsters in de fixatie-oplossing (1% PFA in 1 x PBS, pH 7.4) bij 4 ° C gedurende 24-48 uur.
Opmerking: De fixatie oplossing en fixatie tijd afhankelijk van de grootte van de weefsels16,17,18. - Wassen van de monsters met vers 1 x PBS buffer drie keer (0,5 mL/afwas).
Let op: Voer deze stap onder een zuurkast. De paraformaldehyde afvalstoffen moet goed worden behandeld volgens gevaarlijk afval verwijdering procedures.
Opmerking: De weefsels kunnen worden opgeslagen in 1 x PBS bij 4 ° C voor verdere verwerking.
3. antilichaam-incubatie
- Snijd de vaste weefselmonsters in ongeveer 2 mm3 blokjes met de gesteriliseerde schaar. Draag voor een permeabilization, de monsters in een 1,5 mL-buis met 1 mL 1 x PBS-TX (1% octoxynol-9 in 1 x PBS, Zie tabel voor materialen, pH 7.4) en zachtjes draaien de buizen op RT gedurende 1 uur bij 18 omwentelingen per minuut.
- Verwijder voorzichtig de 1 x PBS-TX door aspiratie. Wassen van de monsters 3 x door het toevoegen van de PBS 1 x rechtstreeks in de dezelfde buizen (geen behoefte om te veranderen van de buizen). Tijdens elke wassen, omkeren de buizen meerdere malen.
- Voor het blokkeren, 0,5 mL blokkeerbuffer (Tabel of Materials) toevoegen aan de monsters en Incubeer bij RT gedurende 2 uur met zachte rotatie.
- Ter voorbereiding van primair antilichaam 0.4 mL, Verdun 2 μL van anti - endomucin (de markering van de bloedvaten) 5 (1:200) en 2 μL van anti-tyrosine hydroxylase (TH, de markering van zenuwvezels) 5 (1:200, 1 µg/mL) antilichamen (tabel van materialen voor antilichaam informatie) in 396 μL van de buffer met blokkerend. Vortex en spin tot herstel het volume.
- Voor de eerste antilichaam-incubatie, verwijder zorgvuldig de buffer met blokkerend uit de stukjes weefsel. Voeg 100 μl van primair antilichaam oplossing bereid in stap 3.4 in buizen en na een nacht bebroeden bij 4 ° C.
Opmerking: Het antilichaam verdunnings- en incubatie tijd variëren tussen verschillende antilichamen. Het is aanbevolen om 0,02% natriumazide toevoegen aan de antilichaam-oplossing voor het voorkomen van microbiële groei. Ter voorbereiding van primair antilichaam met natriumazide 0.4 mL, 4 μL van antilichamen (1 μL van elk) en 4 μL van 2% natriumazide toevoegen in 392 μL van de buffer met blokkerend. - Zorgvuldig de primair antilichaam oplossing voor hergebruik te verzamelen indien gewenst. Wassen van de monsters met 1 x PBST (pH 7.4, 100 µL/afwas) driemaal (elke 30 min) met zachte rotatie van 18 toeren per minuut.
- Voor de bereiding van secundair antilichaam oplossing, verdunde 2 μL van fluorophore (Golf lengte 495 nm) geconjugeerd anti-geit IgG (1:200) en 2 μL van fluorophore (Golf lengte 650 nm) geconjugeerd anti-konijn IgG (1:200) (Zie Tabel van materialen) in 396 μL van buffer met blokkerend. Vortex en spin kort voor het verzamelen van alle van de vloeistof.
Opmerking: De monsters beschermen tegen licht tijdens de volgende procedures. - Voor de tweede antilichaam-incubatie, de laatste was buffer uit monsters te verwijderen. Voeg 100 μl van secundair antilichaam oplossing in buizen en Incubeer bij RT voor 2 h met zachte rotatie van 18 toeren per minuut.
- Verwijder voorzichtig de secundair antilichaam-oplossing. Wassen van de monsters 3 x met 1 x PBST (pH 7.4, elke 30 min) met zachte rotatie van 18 toeren per minuut.
Opmerking: Opnieuw niet gebruiken deze secundair antilichaam-oplossing, zoals het besmet kan zijn met de sporen van primaire antilichamen gebracht door de weefsels. - Voor optische van mijnen, het onderdompelen van de monsters in 1 mL 90% glycerol en houden van de monsters bij 4 ° C in het donker totdat ze transparant worden.
Opmerking: De onderdompeling duur hangt af van het weefseltype en grootte. Meestal moet een 2 mm3 kubus van witte vetweefsel overnachting incubatie, terwijl dezelfde grootte bruin vetweefsel monster behoeften langer. - Houden een siliconen isolator naar de dia als u wilt maken van een put voor volume imaging. Anderzijds hechten van meerdere lagen van transparante tape aan de dia's en een vierkant gesneden uit het midden te maken van een goed (figuur 2).
Opmerking: Pas de goed diepte aanpassen aan de grootte van de steekproef. In dit protocol, wordt een goed diepte van 1 mm gebruikt. - Zorgvuldig overbrengen van de monsters in de put en vul deze met de montage-medium (Zie Tabel van materialen). Leg een slip cover op het oppervlak en verzegel de hoeken van de cover slip met hoge viscositeit medium (Zie Tabel van materialen). Laat de montage middellange remedie voor 24u op RT in duisternis.
Opmerking: Ervoor zorgen dat geen ruimte tussen het monster en de cover slip niet. Vermijd bubbels onder de slip van de cover. Vermijd overmatige druk op de monsters te brengen.
4. de Beeldacquisitie
- Verwerven van Z-stapel afbeeldingen (Zie stappen 4.2 – 4.7) met als doel een confocal microscoop/software 20 x.
- Opstarten van het systeem. Klik op het tabblad <Configuration> en activeer het argon laser en HeNe 633 laser. Klik op het tabblad <ophaal>. In het deelvenster <Visible> laser lijnen omhoog de overeenkomstige intensiteit schuifregelaars om te kiezen van de laserlijnen van 488 nm en 633 nm. In eerste instantie kunnen de intensiteiten worden ingesteld tot 20%-30%. Selecteer de spiegel 488/561/633 triple dichoric. Activeer de PMTs door te klikken op <actieve> checkboxes, het kiezen van PMT1 voor de emissie opgewonden door de 488 nm laser- en PMT3 voor die van de 633 nm laser. Stel de golflengtebereik tot 500-550 nm voor PMT1 en 650-750nm voor PMT3. Selecteer de psudocolor moet worden gebruikt voor beeldweergave door dubbel te klikken op de gekleurde rechthoek naast elke bet en kiezen van een kleur in het pop-upmenu.
- Klik op <Live> om te controleren van het imago van monsters. Gebruik de z-positie-knop om te selecteren van een vlak van de focus binnen de XY-regio van belang. De helderheid van de beelden door de intensiteit van de laser, smart winst en offset tuning. Voor elk kanaal van de fluorescentie, presteren deze aanpassing onder de weergavemodus <QLUT> (Quick Look Up tabel). Klik op de knop <QLUT> om de QLUT te openen, waarin verzadigde pixels worden weergegeven in het blauw op de steun van de instelling van passende helderheidsniveau. Klik tweemaal op de knop <QLUT> terug te gaan naar de weergavemodus voor kleurcorrectie.
Opmerking: De numerieke waarden van de instelling kan variëren tussen elk experiment. - Tijdens het scannen, draai u de Z-positie-knop tegen de klok in het plan van de focus verplaatsen naar een einde van het volume van belang en klik vervolgens op op de pijlpunt van de <einde> om het scannen eindpositie. Vervolgens draai de knop van de Z-positie met de klok mee om het vlak van de focus door het model naar het andere uiteinde van het volume van belang en klik dan op de pijlpunt van de <Begin> om het scannen begin positie te stellen.
Opmerking: Voor de vergelijking tussen de verschillende monsters, definieert u hetzelfde Z-volume voor verschillende monsters. - De grootte van de z-stap 3 µm. wijziging van de kwaliteit van de afbeelding door het selecteren van een indeling van 1024 x 1024, snelheid van 100 Hz, en regel gemiddelde van 2 aanpassen.
- Selecteer <starten > te leiden de Beeldacquisitie z-stack.
- Voor maximale projectie van de verworven afbeeldingsstapel, klik op het tabblad <proces> en <hulpprogramma>, selecteer vervolgens <3D projectie> en <maximale> invoeren in de lijst van de methode zonder veranderingen aan X, Y en Z. Set <Drempel> op 0. Klik op <toepassing>. De maximale intensiteit van de Z-volume wordt gestapeld in een 2D-afbeelding die wordt getoond (figuur 4A).
5. analyse van het bloedvat en zenuw Fiber netwerken
-
Analyse van 2D beelden via open bronsoftware (zie tabel van materialen)19
- Open de gestapelde afbeeldingen in de software. Diameter van het vaartuig en de intensiteit aanpassen totdat alle het vaartuig structuren goed kunnen worden geselecteerd (figuur 4B).
- Selecteer analyse uitvoeren en exporteren van de gegevens op basis van richtsnoeren van de software.
-
Analyse van 3D beelden via de gelicentieerde software (zie tabel van materialen)
- Open de onbewerkte gegevens van beelden met de software. De drempel en andere parameters aanpassen totdat de structuren van het vaartuig in elke laag van het z-volume naar behoren zijn geselecteerd (Raadpleeg de gebruikershandleiding voor meer informatie in de software) (figuur 4C).
- Analyseren van de geselecteerde segmenten tekens en exporteren van de gegevens op basis van de richtsnoeren van de software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De distale regio van de epididymaire witte vetweefsel (eWAT), mediale regio van de torsolumbale subcutane witte vetweefsel (sWAT) en mediale regio van de interscapular bruin vetweefsel (BAT) werden verzameld. De locaties voor het verzamelen van deze weefsels zijn aangegeven in Figuur 1.
Figuur 1: Anatomie van subcutane witte vetweefsel (sWAT), epididymaire witte adipeus weefsel (eWAT), en bruin vetweefsel (BAT) geeft aan regio's die worden gebruikt voor het verzamelen van de monsters. (A) de regio's aangegeven door witte streepjeslijnen vertegenwoordigen sWAT, en de locatie van witte sterretje gemarkeerd is de site voor het verzamelen van sWAT. Regio's aangegeven door zwarte onderbroken lijnen zijn eWAT, en de locatie van de zwarte sterretje gemarkeerd is de site voor het verzamelen van eWAT. (B) de regio's aangegeven door zwarte onderbroken lijnen zijn BAT, en de regio van de collectie weefsel wordt gemarkeerd door het sterretje. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Na geheel-mount kleuring, waren de stukjes weefsel gemonteerd in een put van 1 mm diepte (Figuur 2)
en met de confocal microscoop verbeelde. We het effect van de clearing stap met 90% glycerol incubatie op de kwaliteit van de beelden voor het eerst getest. We vonden dat meer bloedvaten positief waren bevlekt met α-endomucin antilichaam in de glycerol-bebroede sWAT, wat suggereert dat de clearing stap essentieel is voor de volledige kleuring van de bloedvaten (Figuur 3, vergelijk panelen A en B).
Figuur 2: schema's van het wells voor de volume imaging. (A) Diagram van een dia met een siliconen isolator. (B) Diagram van een put met meerdere lagen tape gemaakt door ons lab. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: vergelijking van als beelden van de acquiredwith van de bloedvaten of zonder optische clearing stap met 90% glycerol. (A) geheel-mount immunofluorescentie (IF) kleuring met anti-endomucin antistof (groen) in sWAT. Het monster werd niet onderworpen aan de optische clearing stap (3.10). (B) geheel-mount als kleuring met anti-endomucin antistof in sWAT. Het monster werd onderworpen aan de optische clearing stap (3.10) vóór de montage stappen (stap 3.11 en 3.12). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Echter, de clearing-stap met glycerol beïnvloedde niet de integriteit of de vorm van de bloedvaten (Figuur 3). Gezien deze gunstige effecten, in de volgende experimenten, werd de clearing-stap uitgevoerd.
We verder ten opzichte van de resultaten van 2D- en 3D-analyses met behulp van verschillende software (Zie Tabel van materialen). We vonden dat, terwijl de 3D beelden blijkbaar meer gedetailleerde structurele informatie verstrekt, de twee analytische methoden uiteindelijk geen significante verschillen in termen van de lengte en tak aantal vaartuigen (Figuur 4 toonde).
Figuur 4: vergelijking van 2D- en 3D-analyses over de structuur van het schip. (A) het effect van maximale projectie op de beelden. (B) de analytische resultaten door de 2D software (Zie Tabel van materialen). In het bijzonder geven de rode lijnen geselecteerde skelet, terwijl de blauwe stippen branding punten geven. (C) de analytische resultaten door de 3D-software (Zie Tabel van materialen). Het grijze gebied is het geselecteerde gebied voor analyse. De groene lijn geeft de gemeten segmenten en groene stippen geven de gemeten knooppunten. (D) de vergelijking van de scheepslengte, segment getallen, vertakkende knooppuntnummers en terminal knooppunt nummers geanalyseerd door 2D- of 3D-methoden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Eerdere publicaties hebben aangetoond dat verschillende obesitas depots heterogene eigenschappen1,18 bezitten. Wij willen hier bepalen of bloedvaten en zenuwvezels vertonen verschillende patronen onder de depots met behulp van onze nieuw ontwikkelde methode. We uitgevoerd om dit te bereiken, mede als kleuring met α-endomucin (voor bloedvaten) en α-TH (voor zenuwvezels) antilichamen in adipeus weefsel. Interessant is dat toonden resultaten aan dat er aanzienlijk meer bloedvaten en zenuwvezels in BAT t.o.v. WATs (Figuur 5, vergelijk onder rijstroken aan de bovenste en middelste rijstroken)
Figuur 5: vergelijking van bloedvaten en zenuwvezels verworven van verschillende obesitas depots. Geheel-mount als kleuring met anti-endomucin (groen) en anti-tyrosine hydroxylase (TH) (rood) antistoffen in eWAT (A, B, samengevoegd in C), sWAT (D, E, samengevoegd in F) en BAT (G, H, samengevoegd ik). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Onder de WATs, de sWAT tentoongesteld hogere bloedvat dichtheid dan de eWAT (Figuur 5, vergelijk het midden naar boven lane). Van de nota, terwijl de zenuwvezels uitgebreid in parallel met de bloedvaten, toonde ze geen significante co lokalisatie (Figuur 5, samengevoegde rijstroken). We verder kwantitatief gemeten met het vaartuig gebied, aantal kruispunten en buislengte van de met de 2D methode en gevonden vergelijkbare resultaten als beschreven boven (Figuur 6).
Figuur 6: kwantitatieve analyse van vasculaire en zenuw fiber netwerken. (A) het percentage van bloedvat in de monsters van eWAT, sWAT en BAT. (B) het aantal kruispunten van de vasculaire netwerken in eWAT, sWAT en BAT. (C) het totale schip lengte van vasculaire netwerken in eWAT, sWAT en BAT. (D) het percentage van de neve fiber gebied in de monsters van eWAT, sWAT en VLEERMUIS. (E) het aantal kruispunten van de zenuwvezels in eWAT, sWAT en BAT. (F) de totale lengte van zenuwvezels in eWAT, sWAT en BAT. De analyses werden uitgevoerd met 2D software. De resultaten werden bereikt van de beelden gepresenteerd in Figuur 5. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Kortom bevlekte deze aanpak met succes mede bloedvaten en zenuwvezels in verschillende vetweefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Adipeus weefsel remodeling is direct gekoppeld aan metabole disregulatie tijdens obesitas ontwikkeling1,2. Angiogenese en sympathieke innervatie arm zijn beide essentieel voor de dynamische remodelleert proces2,12. Ontwikkelen van een toepassing aanpak om te visualiseren van de nieuwe bloedvaten, evenals de zenuwvezels zijn dus van groot belang. Vorige methoden zijn gemeld voor het documenteren van de angiogenese in adipeus weefsel. Sommige kwesties blijven echter met deze benaderingen, met inbegrip van lage efficiëntie, pietluttig resolutie en lawaaierige achtergrond. Ondertussen heeft sympathieke innervatie arm slechts onlangs is erkend als een cruciale stap in adipeus weefsel pathologie14. Hoewel de verwante bevindingen interessant zijn, toegepaste methoden vereisen geavanceerde microscopie tools en tijdrovend zijn. Wij rapporteren hier, een benadering van de gemakkelijk-aan-volg aangepast ten opzichte van onze vorige protocol voor co kleuring bloedvaten en sympathische zenuwvezels. Interessant, we gekleurd met succes de bloedvaten en zenuwvezels met hoge resolutie, en de kleuring heeft eigenschappen vergelijkbaar met de eerder gemelde afbeeldingen18.
We eerder de bloedvaten in het adipeus weefsel gekleurd door immunohistochemistry of immunofluorescentie met het antilichaam van α-CD31, een marker van endotheliale cellen, in paraffine-ingebedde dia's8,13,20. Terwijl de methode laat ons toe om bloedvat dichtheid tussen verschillende groepen onderscheiden, waren de microvasculaire schepen die waren positief gekleurd niet compleet. Hier, kozen we voor een geheel-mount methode en uitgevoerd als de kleuring met een α-endomucin antilichaam, een andere merker voor de bloedvaten. Met deze geoptimaliseerde aanpak konden we bereiken kleuring met meer bloedvaten, met name microblood schepen. Bovendien, in deze methode, aangezien we stappen zoals paraffine insluiten en formaline fixatie, die het potentieel hebben vermeden om de integriteit van de bloedvaten wordt aangetast, we verkregen beelden met een hogere resolutie en meer intact vaartuigen. De onberispelijke structuur van de vaartuigen verder konden we meten en vergelijken hun lengtes, vertakking en gebieden. Van de nota, wij toegevoegd een clearing stap met glycerol, zodat de stukjes weefsel kunnen transparanter en deze eenvoudige maar cruciale stap aanzienlijk verbeterd rendement van de kleuring18,-21.
Als gevolg van hoge niveaus van lipide inhoud in het adipeus weefsel, die zou kunnen de toegankelijkheid van antilichamen tegen de binnenste regio's van het weefsel beperken, snijden we de depots in kleine stukjes om voldoende antilichaam dat aan de target-eiwitten bindt. Daarom kleurt onze methode met succes meer bloedvaten en zenuwvezels dan kleuring op hele weefsels. Echter kan het verliezen van ruimtelijke informatie en dus invloed op de integriteit van de zenuwvezels. Om deze schijnbare probleem en zorgen dat de beelden zijn vergelijkbare onder individuele muizen, wordt voorgesteld om het verzamelen van de kleine stukjes van de dezelfde gebieden in de obesitas depots. Als meer ruimtelijke informatie verder nodig is, moeten de grotere brokken voor kleuring worden verkregen. Voor grotere monsters, langere fixatie tijden met hogere doseringen van de FPA, hogere concentraties van wasmiddelen voor permeabilization, en langere periodes van antilichaam-incubatie kunnen nodig zijn.
Vetweefsel innervatie arm heeft onlangs onderzocht. Meerdere geavanceerde technieken zijn toegepast om te visualiseren zenuwvezels14,17. Deze methoden zijn dure of tijdrovend. Hier, we gewoon een als vlek met α-TH (een marker van de sympathische zenuwen) en met succes uitgevoerd gekleurd de sympathische zenuwvezels op een hoge kwaliteit. Nog belangrijker, we uitgevoerd de mede kleuring met α-endomucin en α-TH om te onderzoeken hoe de bloedvaten wisselwerking met sympathische zenuwvezels tijdens adipeus weefsel remodeling.
Van de nota vergeleken we de resultaten van 2D- en 3D-analyses met behulp van verschillende software. Bleek dat, terwijl de 3D beelden meer gedetailleerde structurele informatie verstrekt, de twee analytische methoden toonde geen significant verschil in termen van de lengte en vertakking van de vaartuigen. Uiteindelijk, wanneer analyseren met de 3D-methode, kan de software zelf detecteren sommige valse signalen moeten handmatig worden aangepast. Gezien het feit dat de 2D software met opzet voor vaartuig analyse ontworpen is, is er dus voorgesteld om het gebruik van deze methode voor het kwantitatief meten van de structuur van schepen.
Met deze methode, bloedvaten en zenuwvezels in verschillende adipeus weefsel waren mede gekleurd, en hun dichtheid, vertakking en lengtes waren ten opzichte van19. Bleek dat zowel bloedvaten en zenuwvezels veel dikker in in vergelijking met WAT zijn, suggereert dat BAT een meer metabolisch actief obesitas depot is BAT. Bovendien, het bloedvat en zenuw dichtheden in sWAT waren hoger dan in de eWAT, die aangeeft dat verschillende WATs hebben verschillende remodelleert profielen.
Kortom, vlekken deze methode efficiënt mede bloedvaten en zenuwvezels in adipeus weefsel5. Bovendien fungeert het als een nuttig instrument voor de studie van de dynamische veranderingen in adipeus weefsel tijdens de ontwikkeling van obesitas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de National Institute of Health (NIH) subsidie R01DK109001 (K.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 805-545-180 | Lot: 116969 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Lot: 121944 |
| Amira 6.0 | Thermo Fisher Scientific | Licensed software | |
| Angio tool | National Institutes of Health | Open source software https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home |
|
| Anti-mouse endomucin antibody | R&D research system | AF4666 | Lot: CAAS0115101 |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | Pel Freez Biologicals | P40101-150 | Lot: aj01215y |
| Cover glasses high performance, D = 0.17 mm | Zeiss | 474030-9020-000 | |
| Cytoseal 280 | Thermo Fisher Scientific | 8311-4 | High-viscosity medium |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | |
| Paraformaldehyde,16% | TED PELLA | 170215 | |
| Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep | INVITROGEN | P24744 | Silicone isolator |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| SEA BLOCK Blocking Buffer | Thermo Fisher Scientific | 37527X3 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | |
| Tissue Path IV Tissue Cassettes | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Triton Χ-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Generic term: octoxynol-9 |
| Tube rotator and rotisseries | VWR | 10136-084 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Generic term: Polysorbate 20 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. Adipose tissue remodeling and obesity. Journal of Clinical Investigations. 121 (6), 2094-2101 (2011).
- Sun, K., et al. Endotrophin triggers adipose tissue fibrosis and metabolic dysfunction. Nature Communication. 5, 3485 (2014).
- Zhao, Y., et al. Divergent functions of endotrophin on different cell populations in adipose tissue. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 311 (6), E952-E963 (2016).
- Zhao, Y., et al. Transient Overexpression of VEGF-A in Adipose Tissue Promotes Energy Expenditure via Activation of the Sympathetic Nervous System. Molecular and Cellular Biology. , (2018).
- Xue, Y., et al. Hypoxia-independent angiogenesis in adipose tissues during cold acclimation. Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).
- Chen, S., et al. LncRNA TDRG1 enhances tumorigenicity in endometrial carcinoma by binding and targeting VEGF-A protein. BBA Molecular Basis of Disease. 1864 (9 Pt B), 3013-3021 (2018).
- Sun, K., et al. Dichotomous effects of VEGF-A on adipose tissue dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (15), 5874-5879 (2012).
- During, M. J., et al. Adipose VEGF Links the White-to-Brown Fat Switch With Environmental, Genetic, and Pharmacological Stimuli in Male Mice. Endocrinology. 156 (6), 2059-2073 (2015).
- Elias, I., et al. Adipose tissue overexpression of vascular endothelial growth factor protects against diet-induced obesity and insulin resistance. Diabetes. 61 (7), 1801-1813 (2012).
- Sung, H. K., et al. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17 (1), 61-72 (2013).
- Cao, Y. Angiogenesis and vascular functions in modulation of obesity, adipose metabolism, and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 18 (4), 478-489 (2013).
- Sun, K., et al. Brown adipose tissue derived VEGF-A modulates cold tolerance and energy expenditure. Molecular Metabolism. 3 (4), 474-483 (2014).
- Zeng, W., et al. Sympathetic neuro-adipose connections mediate leptin-driven lipolysis. Cell. 163 (1), 84-94 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Berry, R., et al.
- Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
- An, Y. A., et al. Angiopoietin-2 in white adipose tissue improves metabolic homeostasis through enhanced angiogenesis. eLife. 6, (2017).
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
