Summary
Yeni kan damarı oluşumu ve sempatik innervasyon yağ dokusu remodeling içinde önemli rol oynarlar. Ancak, görselleştirme ve kantitatif yağ dokusu ölçme teknik sorunlar kalır. Burada başarılı bir şekilde etiketleyin ve kantitatif kan damarları ve sinir lifleri farklı yağ dokularında yoğunlukları karşılaştırmak için bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Son yıllarda yapılan çalışmalarda kritik rolü anjiogenez ve yağ dokusu obezite gelişimi sırasında remodeling içinde sempatik innervasyon sermiştir. Bu nedenle, yağ dokusu dinamik değişiklikleri belgelemek için kolay ve etkin bir yöntem geliştirilmesi gereklidir. Burada, verimli bir şekilde kan damarları ve sinir lifleri yağ dokularında Co lekeleri değiştirilmiş bir immünfloresan yaklaşım tarif. Geleneksel ve son zamanlarda geliştirilen yöntemlerine göre bizim nispeten kolay takip etmek ve kan damarları ve sinir lifleri daha yüksek yoğunlukları ile ve daha az arka plan etiketleme daha etkili bir yaklaşımdır. Ayrıca, daha yüksek çözünürlük görüntülerin daha fazla doğru açık kaynak yazılım tarafından alan kaplar, dallanma miktarı ve elyaf uzunluğu ölçmek için bize izin verir. Bizim yöntemini kullanarak bir gösteri gösterdiğimiz o kahverengi yağ dokusundan (BAT) kan damarları ve sinir lifleri beyaz Yağ dokusundan (WAT) göre daha yüksek miktarda içerir. WATs arasında daha fazla kan damarları ve sinir lifleri epididimal WAT (eWAT) göre subkutan WAT (sWAT) olduğunu bulmak daha ayrıntılı. Bizim yöntem böylece yağ dokusu remodeling soruşturma için yararlı bir araç sağlar.
Introduction
Yağ dokusu tuşu metabolik ve endokrin1çalışır. Dinamik olarak genişletir veya daraltır yanıt olarak farklı besin2vurguluyor. Süreç modelleme etkin doku birden çok fizyolojik yolları/adımlardan oluşur anjiogenezi, fibrozis ve yerel inflamatuar microenvironments2,3,4şekillendirme dahil. Soğuk pozlama ve egzersiz, gibi bazı fiziksel uyaranlara sonuçta yeni kan damarı oluşumu ve yağ dokuları5,6sempatik innervasyon neden sempatik aktivasyon tetikleyebilir. Bu tadilat işlemleri sistemik metabolik sonuçları insülin duyarlılık, tip 2 diyabet2damgasını dahil olmak için sıkıca bağlıdır. Böylece, görsel olarak bu patolojik değişiklikler tüm yağ dokuları sağlıklı durumunu anlamak için çok önemlidir.
Angiogenez yeni kan damarı oluşumu sürecidir. Oksijen, besin, hormonlar ve büyüme faktörleri dokulara kan damarları sağlar beri angiogenez belgelenen farklı teknikler6,7ile, yağ dokusu remodeling içinde önemli bir adım olarak kabul edilmiştir 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. ancak, görüntülerin çözünürlüğünü, immunostaining ve damar yoğunluğu miktar için yöntemleri hakkında sorular kalır. Yeni kan damarı oluşumu için karşılaştırıldığında, innervasyon yağ dokusu içinde uzun bir süre için hafife. Son zamanlarda, Tang ve ark. kullanılan 14 intravital iki fotonlu mikroskobu gelişmiş ve adipositler tarafından sinir lifleri14katmanları çevrilidir gösterdi. O zamandan beri araştırmacılar sempatik innervasyon yağ dokusu Fizyoloji Yönetmelikte önemli rolü takdir başlamıştır. Bu nedenle, belge adipose sinir innervasyon için kolay ve pratik bir yaklaşım geliştirilmesi önemlidir.
Burada, kan damarları ve sinir lifleri bizim önceki protokollerine dayalı işbirliği boyama için en iyi duruma getirilmiş bir yöntem raporu. Bu yöntemle, kan damarları ve sinir lifleri gürültülü arka plan olmadan net görüntüler elde edebilirsiniz. Ayrıca, açık kaynak yazılım ile yoğunlukları nicel ölçüm gerçekleştirmek için yeterince yüksek bir çözünürlük elde edilir. Bu yeni yaklaşım kullanarak, biz başarıyla yapıları ve kan damarları ve sinir lifleri farklı yağ depoları içinde yoğunlukları karşılaştırabilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yordamları hayvan konular içeren hayvan refahı Komitesi, Texas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Houston tarafından onaylanmıştır (hayvan iletişim kuralı numarası: AWC-18-0057).
1. reaktif hazırlık
- 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS, pH 7,4) x: 1 x PBS 1 litre yapmak, NaCl, 8 g, KCl 0.2 g, Na2HPO41,44 g ve KH2PO4 800 mL distile su içinde 0,24 g geçiyoruz. PH 7,4 ve 1 L. son hacmi elde etmek için distile su ile doldurun ayarlayın
- 1 x PBS (%1 PFA, wt/vol) % 1'paraformaldehyde: 50 mL son hacmi elde etmek için % 16 3.125 mL ekleyin PFA ( Tablo malzemelerigörmek) 46.875 mL 1 x PBS için. İyice karıştırın ve daha sonra kullanmak için 4 ° C'de depolayın.
Uyarı: Paraformaldehyde zehirlidir. Tüm yordamları ve inhalasyon önlemek için kişinin cilt duman başlık altında yapılmalıdır. - 1 x PBS (x PBST, pH 7.4, vol/vol 1) % 0,1 polysorbate ( malzemelerin tabloyabakınız) 20: 50 mL son hacmi elde etmek için polysorbate 20-49,95 mL 1 x PBS 0.05 mL ekleyin. Girdap ve mağaza 4 ° c ilâ 1 ay için.
- %1 octoxynol-9 ( Tablo malzemelerigörmek) 1 x PBS (x PBS-TX, pH 7.4, vol/vol 1) içinde: 10 mL son hacmi elde etmek için 1 x PBS için 9.9 mL 0.1 mL octoxynol-9 ekleyin. Girdap ve mağaza 4 ° c ilâ 1 ay için.
- %2 Sodyum azid (wt/vol): 10 mL % 2 Sodyum azid üretmek için 1 x PBS için 10 mL sodyum azid 0.2 g ekleyin. İyice karıştırın ve daha sonra kullanmak için 4 ° C'de depolayın.
- 1 x PBS (vol/vol) % 90 gliserol: 10 mL son hacmi elde etmek için 1 mL 1 x PBS 9 mL gliserol ekleyin. Girdap ve mağaza oda sıcaklığında (RT) daha sonra kullanmak için.
2. hayvan Ddissection ve yağ dokusu koleksiyonu
- 6-hafta-yaşlı C57BL/6J erkek fare kullanın. Fareler isoflurane (% 4-%5 indüksiyon için sonra % 1-%2 için bakım) ile anestezi. Bir kez anestezi, pedal refleksleri eksikliğinden yargılamak anestezik derinlik belirlemek için bir ayak parmağı-çimdik refleks gerçekleştirin. Fareler derin anestezi sonra daha önce yayımlanmış15protokol sonrası fareler incelemek.
- Künt makas ve göğüs (saç tıraş gerek yok) cerrahi alan sterilize. Göğüs diyafram ve kaburga ~ 2 cm künt makas kullanarak büyüklüğü ile lateral yüzeyi boyunca keserek açın. Göğüs bayrağı hemostat ile kelepçe ve hemostat kafasına koyarak yansıtmaktadır.
- Küçük bir insizyon attım sol ventrikül (~0.5 cm) Iris makasla olun. Kesi sitesi aracılığıyla bir perfüzyon zeytin uçlu iğne yerleştirin ve iğne ucu hemostat ile yerde kelepçe. İğne paraformaldehyde fiksasyon solüsyon (%1 PFA, pH 7,4) içeren bir 50 mL şırınga iliştirin.
- Sağ atrium bölümü kesim tarafından Iris makasla perfüzyon çıkış gibi açın. Perfüzyon tarafından hafifçe başlatın ve sürekli şırınga yakın bir perfüzyon oranda iterek 10 mL/dak çıkış çıkmadan sıvı herhangi bir kan açık olduğunda İtmeyi bırak. Tüm süreç ~ 5 dk istemeniz gerekir.
Uyarı: Toksisite PFA gelen önlemek için bir duman başlık altında aşağıdaki adımları gerçekleştirin. - Fareler beyaz ve kahverengi yağ dokulardan incelemek. Doku örnekleri parçalar yaklaşık 5 x 5 x 3 mm3küçük parçalar halinde zarar için makas kullanın. Küçük parçalar sterilize cımbızla kaset kaset üzerinde doku örnekleri uygun etiketleme ile gömme doku içine aktarın.
- Doku örnekleri fiksasyon solüsyon içeren gömme kaset bırakın (%1 1 x PBS, pH 7.4 PFA) için 24-48 h 4 ° C'de.
Not: Fiksasyon çözüm ve fiksasyon saat boyutları doku16,17,18bağlı olarak değişir. - Taze 1 PBS arabellek üç x örnekleriyle (0.5 mL/yıkama) yıkayın.
Uyarı: Bir duman başlık altında bu adımı gerçekleştirin. Paraformaldehyde atık düzgün tehlikeli atık bertaraf yordamlar göre ele alınmalıdır.
Not: Dokular 1 x PBS 4 ° C'de için daha fazla alay depolanabilir.
3. antikor kuluçka
- Sabit doku örnekleri steril makasla yaklaşık 2 mm3 küpler halinde kesilmiş. Permeabilization için örnekleri 1 mL 1 içeren bir 1,5 mL tüp içine aktarmak PBS-TX x (%1 octoxynol-9 1 x PBS,'tabloya tablo için malzemeler, pH 7.4 bakınız) ve RT, tüpler 18 rpm'de 1 h için yavaşça döndürün.
- Dikkatli bir şekilde çıkarın 1 x PBS-TX aspirasyon tarafından. Yıkama örnekleri 3 x 1 x PBS doğrudan aynı tüpler içine (tüpler değiştirmek gerek yok) ekleyerek. Her yıkama sırasında birkaç kez tüpler tersine çevirin.
- Engelleme, engelleme arabellek (Tablo reçetesi) 0.5 mL örnekleri için ekleyin ve 2 h nazik döndürme için RT kuluçkaya.
- Anti - endomucin (kan damarlarının marker) 5 (1: 200), 2 μL ve anti, 2 μL 0.4 mL birincil antikor çözeltisi hazırlamak için seyreltik — tirozin hidroksilaz (TH, sinir lifleri marker) 5 (1: 200, 1 µg/mL) antikorları (malzemeler tablo antikor bilgi için) 396 μL engelleme arabelleği içine. Girdap ve spin recover birimin aşağı.
- İlk antikor kuluçka için doku parçaları engelleme arabellek dikkatli bir şekilde çıkarın. Birincil antikor çözüm adım 3.4 tüpler içine hazırlanan 100 μL ekleyin ve bir gecede 4 ° C'de kuluçkaya.
Not: Antikor seyreltme ve kuluçka süresi farklı antikorlar arasında değişebilir. Bu %0.02 sodyum azid mikrobiyal büyüme önlemek için antikor çözüme eklemek için tavsiye edilir. 0.4 mL sodyum azid ile birincil antikor çözeltisi hazırlamak için 4 μL antikor (her 1 μL) ve % 2 Sodyum azid 4 μL engelleme arabellek 392 μL ekleyin. - Dikkatle birincil antikor çözüm kullanılmak istenirse toplamak. 1 örnekleriyle yıkama x PBST (pH 7.4, 100 µL/yıkama) üç kez (30 dk her) 18 devirde nazik döndürme.
- İkincil antikor çözüm, fluorophore (dalga uzunluğu 495 nm) seyreltik 2 μL hazırlanması Birleşik Anti-keçi IgG (1: 200) ve fluorophore (dalga uzunluğu 650 nm) 2 μL Birleşik Anti-tavşan IgG (1: 200) ( Tablo malzemelerigörmek) 396 μL içine engelleme arabellek. Girdap ve kısaca tüm sıvı toplamak için döndür.
Not: Örnekler aşağıdaki işlemler sırasında ışıktan korumak. - İkinci antikor kuluçka için son yıkama arabellek örnekleri kaldırın. İkincil antikor çözeltinin 100 μL tüpler içine ekleyin ve 18 devirde nazik döndürme için 2 h RT kuluçkaya.
- İkincil antikor çözüm dikkatli bir şekilde çıkarın. Yıkama örnekleri 3 x 1 x PBST (pH 7.4, 30 dk) 18 devirde nazik döndürme.
Not: Birincil antikorlar tarafından dokulara getirdi eser miktarda kontamine gibi bu ikincil antikor çözüm yeniden değil. - Optik geçiş izni için 1 mL % 90 gliserol örneklerinde bırakın ve saydam olana örnekleri 4 ° C'de karanlıkta tut.
Not: Daldırma süresi doku türü ve boyutu bağlıdır. Genellikle, bir 2 mm3 küp beyaz yağ dokusunun daha uzun aynı boyutu kahverengi yağ dokusu örnek ihtiyaçları ise gecede kuluçka ihtiyacı var. - Birim görüntüleme için iyi oluşturmak için silikon İzolatör slayt için uygun. Alternatif olarak, şeffaf bant birkaç kat slaytlara eklemek ve bir kare şeklinde bir kesik orta dışında bir şey oluşturmak için (Şekil 2).
Not: Kuyu derinliği örnek boyutuna sığacak şekilde ayarlayın. Bu protokol için 1 mm kuyu derinliği kullanılır. - Dikkatle örnekleri kuyunun içine aktarmak ve montaj orta ile doldurun ( Tablo malzemelerigörmek). Bir kapak kayma yüzeyi üzerinde yatıyordu ve köşeleri ile yüksek viskozite orta kapak fişinin mühür ( Tablo malzemelerigörmek). RT 24 h montaj orta tedavisini karanlıkta izin.
Not: Boşluk örnek ve kapak notu arasında kaldı emin olun. Kabarcıklar kapak notu altında kaçının. Aşırı baskı örnekleri üzerinde yerleştirmekten kaçının.
4. resim alma
- Z-yığın görüntülerle (adımlar 4.2-4.7 bakın) bir confocal mikroskop/yazılım 20 x amacı elde etmek.
- Sistemi başlatmak. <Yapılandırma> sekmesini ve argon lazer ve Helene 633 lazer etkinleştirin. <Edinme> sekmesini tıklatın. <Visible> lazer çizgileri panelinde karşılık gelen yoğunluk kaydırıcıları 488 lazer satırları seçmek için yukarı taşımak nm ve 633 nm. Başlangıçta, yoğunluklarda %20-%30 için ayarlanabilir. 488/561/633 Üçlü dichoric mirror seçeneini seçin. PMTs PMT1, 633 nm lazer için heyecanlı 488 nm lazer ve PMT3 tarafından emisyon için seçtiğiniz <etkin> onay kutularını tıklatarak etkinleştirin. Dalga boyu aralığı 500-550 nm için PMT1 ve 650-750nm için PMT3 için ayarlayın. Çift renkli dikdörtgen her Devresel_ödeme yanında tıklatın ve açılır menüden bir renk seçme imge göstermek için kullanılacak psudocolor seçin.
- < Örnekleri görüntüsünü denetlemek içinLiveüzerinde >'yı tıklatın. Z-pozisyon topuzu uçağa odak ilgi XY bölgedeki seçmek için kullanın. Lazer yoğunluğu, akıllı kazanç ve mahsup hesabı ayarlama tarafından görüntü parlaklığını ayarlayın. Her floresans kanal için bu ayarlama <QLUT> (hızlı bakmak kadar tablo) görüntü modu altında gerçekleştirin. Doymuş piksel mavi uygun parlaklık seviyesi ayarı yardım için görüntülendiği QLUT moduna girmek için <QLUT> düğmesini tıklayın. Yalancı görüntü moduna geri dönmek için iki kez <QLUT> düğmesini tıklayın.
Not: Sayısal değerleri ayarının her deney arasında değişiklik gösterebilir. - Tarama sırasında Z-pozisyon topuzu faiz hacmi tek bir amaç için odak planı taşıyın ve sonra tıklatın tarama bitiş konumunu ayarlamak için <son> ok ucu üzerinde için saat yönünün tersine çevirmek. Sonra Z-pozisyon topuzu numune odağı uçak birimin ilgi diğer sonuna gitmek için saat yönü doğrultusunda çevirin ve ardından <Başlangıç> ok ucu üzerinde tarama başlangıç konumunu ayarlamak için tıklatın.
Not: Farklı örnekleri arasında karşılaştırma için farklı örnekleri için aynı Z hacimli tanımlayın. - 3 µm değişiklik 1024 x 1024 bir biçim seçerek görüntü kalitesi, hızı 100 Hz ve satır ortalama 2 z-adım boyuta ayarlayın.
- Seçin <başlamak > z-yığın resim alma başlatmak için.
- Maksimum projeksiyon elde edilen görüntü yığını için <işlem> sekmesini ve sonra <Aracı>, <3D projeksiyon> seçin ve <Maksimum> değişiklik yapılmadan Yöntemi listesinde X, girin. Y ve Z. Set <Eşik> 0. <Uygulamaüzerinde >'ı tıklatın. Z biriminin maksimum yoğunluk (Şekil 4A) gösterilecek bir 2B görüntü yığılmış.
5. damar ve sinir lifi Analizi iletişim
-
Analiz 2B görüntüleri açık kaynak yazılımı üzerinden (bakınız tablo reçetesi)19
- Yığın görüntü yazılımı açın. Seçilen tüm damar yapıları düzgün olabilir (Şekil 4B) kadar damar çapı ve yoğunluğunu ayarlayın.
- Analizi Çalıştır ' ı seçin ve rehberlik yazılım aşağıdaki veri verin.
-
Analiz 3D görüntüleri lisanslı yazılımı üzerinden (tablo malzemeleri görmek)
- Görüntülerin ham veri ile yazılımını açın. Her katman z biriminin gemi yapılarda düzgün seçilene dek eşik ve diğer parametreleri ayarlayın (Ayrıntılar için yazılım için Kullanıcı kılavuzuna bakın) (Şekil 4 c).
- Seçili parçaları karakter analiz ve yazılım rehberlik takip veri verme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Distal bölge epididimal beyaz yağ doku (eWAT), medial dorsolumbar subkutan beyaz Yağ dokusundan (sWAT) bölgesinin ve medial interscapular kahverengi yağ dokusundan (BAT) bölgenin toplanmıştır. Bu doku toplamak için konumları Şekil 1' de belirtilmiştir.
Şekil 1: anatomi subkutan beyaz Yağ dokusundan (sWAT), epididimal beyaz Yağ dokusundan (eWAT) ve kahverengi yağ dokusundan (BAT) örnekleri toplamak için kullanılan bölgeleri gösterir. (A)bölgeler beyaz kesik çizgiler temsil sWAT tarafından özetlenen ve beyaz yıldız vurgulanan konumu sWAT toplamak için sitedir. EWAT siyah kesikli çizgilerle özetlenen bölgeleridir ve siyah yıldız vurgulanan konumu eWAT toplamak için site. (B) bölgeleridir siyah kesikli çizgilerle özetlenen BAT ve doku toplama bölge yıldız işareti vurgulanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Bütün Dağı boyama sonra doku parçaları 1 mm Derinlik (Şekil 2) bir kuyuda monte edildi
ve confocal mikroskop ile görüntülü. İlk % 90 gliserol kuluçka takas adımla görüntülerin kalitesi üzerinde etkisini test ettik. Daha fazla kan damarları olumlu ile α-endomucin antikor gliserol inkübe SWAT lekeli takas adım tam kan damarlarının boyama için kritik olduğunu düşündüren bulduk (Şekil 3, paneller A ve B karşılaştırın).
Şekil 2: Wells birim görüntüleme için diyagramları. (A) bir slayt ile silikon İzolatör diyagramı. (B) bir kuyu diyagramı çoklu katmanlar bizim lab tarafından hazırlanmış bant ile. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Eğer karşılaştırma görüntüleri kan damarları acquiredwith veya % 90 gliserol ile optik takas adım olmadan. (A) anti-endomucin antikor (yeşil) SWAT ile boyama bütün Dağı ayirt (Eğer). Örnek (adım 3.10) optik takas adıma tabi değil. (B) bütün-mount anti-endomucin antikor SWAT ile boyama eğer. Örnek montaj adımları (adım 3.11 ve 3.12) önce optik takas adım (adım 3.10) tabi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Ancak, gliserol ile takas adım bütünlüğü veya şekil (Şekil 3)kan damarlarının etkilemedi. Bu yararlı etkileri aşağıdaki deneylerde göz önüne alındığında, takas adım gerçekleştirildi.
Biz daha farklı yazılım kullanarak 2D ve 3D analiz sonuçları karşılaştırılır ( Tablo malzemelerigörmek). 3D görüntü, Görünüşe göre daha fazla yapısal bilgi sağlanan iken, iki analitik yöntem sonunda önemli farklılıklar gemiler (Şekil 4) uzunluğu ve şube sayısı bakımından belli etmedi, bulduk.
Şekil 4: damar yapısı 2D ve 3D analizlere karşılaştırılması. (A) maksimum projeksiyon resmin üzerine etkisi. (B) 2D yazılım tarafından analitik sonuçları ( Tablo malzemelerigörmek). Özellikle, mavi noktalar marka puan gösterir iken kırmızı çizgiler seçili iskelet, gösteriyor. (C) analitik sonuçları 3D yazılım tarafından (bkz. Tablo malzeme). Seçili bölge için analiz gri alandır. Yeşil hat ölçülen kesimleri gösterir ve yeşil noktalar ölçülen düğümleri gösterir. (D) damar uzunluğu, parça numaraları, dallanma düğüm numaralarını ve terminal düğüm karşılaştırma numaraları 2D veya 3D yöntemlerle analiz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Önceki yayınları farklı yağ depoları türdeş olmayan özellikleri1,18sahip göstermiştir. Burada kan damarları ve sinir lifleri bizim yeni geliştirilen yöntemle depoları arasında farklı desen Sergisi olup olmadığını belirlemek için çalıştı. Bunu başarmak için işbirliği IF α-endomucin (için kan damarları) ve yağ dokusu α-TH (için sinir lifleri) antikor boyama yapılır. İlginçtir, bulunduğunu önemli ölçüde daha fazla kan damarları ve sinir lifleri yarasa WATs (Şekil 5, karşılaştır alt yolları üst ve orta kulvar için) karşılaştırıldığında sonuçlar gösterdi
Şekil 5: karşılaştırma kan damarları ve sinir lifleri farklı yağ depoları satın aldı. Bütün Monte Eğer anti-endomucin (yeşil) ve anti-Tirozin ile boyama eWAT (A, B Cbirleştirilmiş,), Hidroksilaz (TH) (kırmızı) antikor sWAT ( Fiçinde birleştirilmişD, E,) ve (G, Hbirleştirilen, BAT Ben). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
WATs arasında SWAT ekibi eWAT daha yüksek kan damarı yoğunluğu sergilenen (Şekil 5, orta üst Lane karşılaştırın). Dikkat, kan damarları ile paralel olarak genişletilmiş sinir lifleri ise, onlar önemli ortak yerelleştirme (Şekil 5, birleştirilmiş şerit) belli etmedi. Daha fazla gemi alan, kavşaklar ve boru uzunluğu ile 2D yöntemi ve bulunan benzer sonuçlar (Şekil 6) yukarıda açıklandığı gibi dizi kantitatif ölçülür.
Şekil 6: kantitatif analiz, damar ve sinir lifi ağlar. (A) eWAT, sWAT ve yarasa örnekleri damar alanının yüzdesi. EWAT, (B) kavşaklar, damar sayısı ağlarda sWAT ve yarasa. EWAT, Özel Tim ve yarasa damar ağları (C) Toplam gemi uzunluğu. (D) neve yüzdesi fiber alanında eWAT, örnekleri sWAT ve yarasa. (E) eWAT, sWAT ve yarasa sinir liflerinin kavşak sayısı. (F) toplam uzunluğu sinir lifleri eWAT, sWAT ve yarasa. Analizleri ile 2D yazılım gerçekleştirilmiştir. Sonuçlar Şekil 5' te sunulan görüntüleri elde edildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Özet olarak, bu yaklaşım başarılı bir şekilde kan damarları ve sinir lifleri farklı yağ dokularında Co lekeli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yağ dokusu remodeling için metabolik bozukluk doğrudan obezite geliştirme1,2sırasında bağlıdır. Angiogenez ve sempatik innervasyon dinamik remodeling işlemi2,12için temel etkilenebilir. Bu nedenle, yeni kan damarları gibi sinir lifleri görselleştirmek için uygun bir yaklaşım geliştirilmesi büyük önemi vardır. Önceki yöntemler angiogenez yağ dokusu içinde belgelenmesi için rapor edilmiştir. Ancak, bazı sorunlar bu yaklaşımlar ile düşük verimlilik, telaşlı çözünürlük ve gürültülü arka plan gibi kalır. Bu arada, sempatik innervasyon yalnızca son zamanlarda yağ dokusu patoloji14önemli bir adım olarak kabul edilmiştir. İlgili bulgular ilginç olsa bile, uygulanan yöntemleri gelişmiş mikroskobu araçları gerektirir ve zaman alıcı. Burada, kan damarları ve sempatik sinir lifleri Co boyama için bizim önceki protokolden değiştiren bir takip etmek kolay yaklaşım raporu. İlginçtir ki, biz başarılı bir şekilde kan damarları ve sinir lifleri yüksek çözünürlüklü lekeli ve boyama özellikleri daha önce raporlanmış görüntüleri18için karşılaştırılabilir vardır.
Daha önce immünhistokimya veya α-CD31 antikor, parafin Katıştırılmış slaytlar8,13,20endotel hücrelerinin bir marker ile ayirt kan damarları yağ dokularında lekeli. Yöntem damar yoğunluğu farklı gruplar arasında ayırt etmek bize izin verirken, olumlu lekeli mikrovasküler damarları tam değildi. Burada, biz bir bütün-mount yöntemi seçti ve bir α-endomucin antikor, kan damarları için başka bir marker ile boyama yapılır. En iyi duruma getirilmiş bu yaklaşımı ile daha fazla kan damarları, özellikle microblood gemiler ile boyama elde edebildik. Ayrıca, biz kan damarları bütünlüğünü zarar potansiyeline sahip, adım parafin fiksasyon, gömme ve formalin gibi kaçınılması beri bu yöntemde, biz resimleri yüksek çözünürlük ve başka sağlam gemileri ile elde. Damarlara zarar görmemiş yapısını daha da ölçmek ve onların uzunlukları, dallanma ve alanları karşılaştırmak izin verdi. Not, doku parçaları daha şeffaf haline gelebilir ve bu basit ama kritik adım önemli ölçüde boyama18,21verimliliğini arttırmak gliserol, bir takas adımla eklendi.
Antikorlar dokusunun iç bölgelere erişilebilirliğini sınırlayabilir, Yağ dokusundan lipid içeriği yüksek düzeyde depoları yeterli antikor bağlama hedef proteinler için emin olmak için küçük parçalar halinde keselim. Bu nedenle, bizim Yöntem başarıyla daha fazla kan damarları ve sinir lifleri Bütün dokular üzerinde boyama daha lekeleri. Ancak, mekansal bilgi kaybetmek ve dolayısıyla sinir lifleri bütünlüğünü etkileyen olabilir. Bu belirgin sorunu gidermek ve görüntüleri bireysel fareler arasında karşılaştırılabilir sağlamak için yağ depoları aynı bölgelerde küçük parçaları toplamak için önerilmektedir. Daha fazla mekansal bilgi daha fazla gerekli değilse, daha büyük boyutta boyama için alınmalıdır. Daha büyük örnekleri, odak, deterjanlar, permeabilization için daha yüksek konsantrasyonları yüksek dozlarda uzun fiksasyon kez ve antikor kuluçka uzun süre gerekebilir.
Yağ dokusu innervasyon son zamanlarda araştırmış. Bir çok gelişmiş teknik sinir lifleri14,17görselleştirmek için uygulandı. Bu yöntemler pahalı veya zaman alıcı olabilir. Burada, sadece bir Eğer leke α-TH (sempatik sinir marker) ve başarılı bir şekilde gerçekleştirilen yüksek kalitede sempatik sinir lifleri lekeli. Daha da önemlisi, α-endomucin ve nasıl kan damarları sempatik sinir lifleri ile etkileşimi yağ dokusu tadilat sırasında araştırmak için α-TH ile birlikte boyama yapılır.
Not, biz farklı yazılım kullanarak 2D ve 3D analiz sonuçlarından göre. Bu 3 boyutlu görüntüleri daha ayrıntılı yapısal bilgiler iken, iki analitik Yöntem uzunluğu ve gemilerin dallanma açısından anlamlı bir fark yoktu, bulundu. Sonunda, 3D yöntemiyle analiz ederken, yazılımın kendisinden el ile ayarlanması gereken bazı yanlış sinyalleri algılayabilir. Verilen bu 2D yazılım bilerek gemi analiz için tasarlanmıştır, böylece kantitatif damarlarının yapısını ölçmek için bu yöntemi kullanmak için önerilir.
Bu yöntemle, kan damarları ve sinir lifleri farklı yağ dokusu içinde Co lekeli ve onların yoğunlukları, dallanma ve uzunlukları karşılaştırıldığında19yaşındaydın. Bu kan damarları ve sinir lifleri yarasa yarasa daha metabolik olarak aktif bir yağ deposu olduğunu düşündüren WAT için karşılaştırıldığında çok kalın bulundu. Ayrıca, damar ve sinir yoğunlukları SWAT eWAT daha yüksek o kadar farklı gösteren WATs var farklı remodeling profilleri.
Sonuç olarak, bu yöntem etkili bir şekilde kan damarları ve sinir lifleri yağ dokusu5ortak lekeleri. Ayrıca, bu yağ dokusu dinamik değişiklikleri obezite geliştirme sırasında çalışmak için yararlı bir araç olarak hizmet vermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Bu çalışmada sağlık (NIH) hibe R01DK109001 (K.S.) Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 805-545-180 | Lot: 116969 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Lot: 121944 |
| Amira 6.0 | Thermo Fisher Scientific | Licensed software | |
| Angio tool | National Institutes of Health | Open source software https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home |
|
| Anti-mouse endomucin antibody | R&D research system | AF4666 | Lot: CAAS0115101 |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | Pel Freez Biologicals | P40101-150 | Lot: aj01215y |
| Cover glasses high performance, D = 0.17 mm | Zeiss | 474030-9020-000 | |
| Cytoseal 280 | Thermo Fisher Scientific | 8311-4 | High-viscosity medium |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | |
| Paraformaldehyde,16% | TED PELLA | 170215 | |
| Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep | INVITROGEN | P24744 | Silicone isolator |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| SEA BLOCK Blocking Buffer | Thermo Fisher Scientific | 37527X3 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | |
| Tissue Path IV Tissue Cassettes | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Triton Χ-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Generic term: octoxynol-9 |
| Tube rotator and rotisseries | VWR | 10136-084 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Generic term: Polysorbate 20 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. Adipose tissue remodeling and obesity. Journal of Clinical Investigations. 121 (6), 2094-2101 (2011).
- Sun, K., et al. Endotrophin triggers adipose tissue fibrosis and metabolic dysfunction. Nature Communication. 5, 3485 (2014).
- Zhao, Y., et al. Divergent functions of endotrophin on different cell populations in adipose tissue. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 311 (6), E952-E963 (2016).
- Zhao, Y., et al. Transient Overexpression of VEGF-A in Adipose Tissue Promotes Energy Expenditure via Activation of the Sympathetic Nervous System. Molecular and Cellular Biology. , (2018).
- Xue, Y., et al. Hypoxia-independent angiogenesis in adipose tissues during cold acclimation. Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).
- Chen, S., et al. LncRNA TDRG1 enhances tumorigenicity in endometrial carcinoma by binding and targeting VEGF-A protein. BBA Molecular Basis of Disease. 1864 (9 Pt B), 3013-3021 (2018).
- Sun, K., et al. Dichotomous effects of VEGF-A on adipose tissue dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (15), 5874-5879 (2012).
- During, M. J., et al. Adipose VEGF Links the White-to-Brown Fat Switch With Environmental, Genetic, and Pharmacological Stimuli in Male Mice. Endocrinology. 156 (6), 2059-2073 (2015).
- Elias, I., et al. Adipose tissue overexpression of vascular endothelial growth factor protects against diet-induced obesity and insulin resistance. Diabetes. 61 (7), 1801-1813 (2012).
- Sung, H. K., et al. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17 (1), 61-72 (2013).
- Cao, Y. Angiogenesis and vascular functions in modulation of obesity, adipose metabolism, and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 18 (4), 478-489 (2013).
- Sun, K., et al. Brown adipose tissue derived VEGF-A modulates cold tolerance and energy expenditure. Molecular Metabolism. 3 (4), 474-483 (2014).
- Zeng, W., et al. Sympathetic neuro-adipose connections mediate leptin-driven lipolysis. Cell. 163 (1), 84-94 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Berry, R., et al.
- Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
- An, Y. A., et al. Angiopoietin-2 in white adipose tissue improves metabolic homeostasis through enhanced angiogenesis. eLife. 6, (2017).
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
