Summary
التنفس المتقدرية أمر حاسم لبقاء العضوي؛ ولذلك، معدل استهلاك الأوكسجين مؤشرا ممتازا للصحة المتقدرية. في هذا البروتوكول، يمكننا وصف استخدام ريسبيروميتير المتاحة تجارياً لقياس القاعدية ومعدلات استهلاك الأوكسجين القصوى في العيش، سليمة، وبحرية متحركة ايليجانس كاينورهابديتيس.
Abstract
الوظيفة المتقدرية الأمثل حاسم بالنسبة للنشاط الخلوي صحية، خاصة في الخلايا التي تحتوي على متطلبات الطاقة العالية مثل تلك الموجودة في الجهاز العصبي والعضلات. يتفق مع هذا، ارتبط خلل mitochondrial بعدد وافر من أمراض الأعصاب والشيخوخة بشكل عام. وقد ايليجانس كاينورهابديتيس نظام نموذجي قوية لتوضيح تعقيدات كثيرة للوظيفة المتقدرية. التنفس المتقدرية يعد مؤشرا قويا للوظيفة المتقدرية ووضعت مؤخرا ريسبيروميتيرس منهاجا الدولة للفنون لقياس التنفس في الخلايا. في هذا البروتوكول، ونحن نقدم تقنية لتحليل سليمة، والعيش C. ايليجانس. هذا البروتوكول يمتد لفترة ~ 7 أيام ويتضمن خطوات لتنمو وتزامن C. ايليجانس، (2) إعداد المركبات بالحقن وترطيب المسابير، (3) المخدرات خرطوشة وتحميل الموازنة، (4) إعداد المقايسة دودة (1) لوحة والمقايسة تشغيل، وتحليل البيانات بعد التجربة (5).
Introduction
وتنتج الإنزيمات في سلسلة نقل الإلكترون (إلخ) الموجود في غشاء الميتوكوندريا الداخلية الادينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)، المصدر الرئيسي للطاقة الخلوية، في الميتوكوندريا. بيروفات، المستقلب رئيسية المستخدمة لإنتاج ATP المتقدرية، يتم استيراده في المصفوفة الميتوكوندريا حيث أنها ديكاربوكسيلاتيد لإنتاج أسيتيل مرافق إنزيم أ (CoA). وبعد ذلك، يدخل أسيتيل CoA دورة حمض الستريك أدى إلى توليد نيكوتيناميد الأدنين dinucleotide (NADH)، جزيء إلكترون رئيسية الناقل. كما يتم تمرير الإلكترونات من NADH إلى الأوكسجين عبر إلخ، والبروتونات بناء في الفضاء intermembrane الميتوكوندريا، مما يؤدي إلى توليد التدرج الكهروكيميائية عبر الغشاء. ثم ستتدفق هذه البروتونات من الفضاء intermembrane عبر هذا التدرج الكهروكيميائية العودة إلى المصفوفة المتقدرية عن طريق المسام بروتون من synthase ATP، القيادة التناوب وتركيب ATP1 (الشكل 1).
الوظيفة المتقدرية لا يقتصر على إنتاج الطاقة ولكن أيضا أمر حاسم لاستتباب الكالسيوم والأكسجين التفاعلية الأنواع (روس) المسح والمبرمج، حاسمة لتحديد المواقع وظيفتها في الصحة العضوي2. ويمكن تقييم الوظيفة المتقدرية باستخدام مجموعة متنوعة من الاختبارات، بما في ذلك، على سبيل المثال لا الحصر، التحليلات التي تقيس غشاء الميتوكوندريا المحتملة ومستويات ATP وروس، وتركيزات الكالسيوم المتقدرية. بيد أن هذه الاختبارات توفر لقطة واحدة من الوظيفة المتقدرية ولذلك قد لا يوفر نظرة شاملة لصحة المتقدرية. نظراً لاستهلاك الأوكسجين أثناء توليد ATP يعتمد على عدد وافر تفاعلات متسلسلة، هو بمثابة مؤشر متفوقة من الوظيفة المتقدرية. من المثير للاهتمام، وقد لوحظت اختلافات في معدلات استهلاك الأوكسجين نتيجة خلل mitochondrial3،،من45.
ويمكن قياس معدلات استهلاك الأوكسجين (OCR) للعينات الحية باستخدام التقنيات التي يمكن تقسيم إلى مجموعتين: أمبيروميتريك الأكسجين وأجهزة الاستشعار وفوسفورات المستندة إلى البورفيرين التي يمكن أن تطفئ بالأكسجين6. وقد استخدمت على نطاق واسع أمبيروميتريك الأكسجين وأجهزة الاستشعار لتدبير التعرف الضوئي على الحروف في استزراع الخلايا، الأنسجة، وفي نظم نموذجية، مثل C. ايليجانس. ومع ذلك، تمتلك فوسفورات المستندة إلى البورفيرين التي تحتوي على ريسبيروميتيرس بالمزايا التالية: (1) أنها تسمح بإجراء مقارنة جنبا إلى جنب من عينتين في ثلاث نسخ، (2) أنها تتطلب حجم عينة أصغر (مثل الديدان 20 كل بئر مقابل ~ 2، 000−5، 000 الديدان الدائرة)7، و (3) ريسبيروميتير يمكن برمجتها للقيام بأربع حقن مركبة مختلفة في المطلوب مرات في جميع أنحاء تشغيل تجريبي، مما يلغي الحاجة للتطبيق اليدوي.
في هذا البروتوكول، وهي الخطوات المتضمنة في استخدام ريسبيروميتير الاستشعار الأوكسجين البورفيرين المستندة إلى تدبير التعرف الضوئي على الحروف في العيش، سليمة C. ايليجانس وصف. بينما هناك بروتوكول مكتوب لاستخدام بشكل كبير، الإنتاجية العالية ريسبيروميتير8، تم تكييفها للاستخدام مع أداة ودية وسهلة المنال، وأصغر من حجم ميزانية أكثر هذا البروتوكول. هذا البروتوكول مفيدة بشكل خاص لتقييم الفرق بين السلالات اثنين، حيث الفرز الفائق غير مطلوب وسيكون استعماله المفرط في التعرف الضوئي على الحروف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: الرقم 2 لمحة تخطيطي للبروتوكول بالكامل.
1-النمو والمزامنة من السكان السلكية9،10
- نقل اليرقات L4 من الخلفيات الوراثية المطلوبة (مثلاً، N2 [نوع البرية] والحيوانات sel-12) على لوحات وسائل الإعلام (NGM) نمو السلكية (انظر الجدول 1 للوصفة) المصنفة حديثا مع حشيش الإشريكيّة القولونية (OP50)11. استخدام اثنين على الأقل 100 ملم أو ثلاث لوحات 60 ملم لكل سلالة. احتضان الديدان في درجة حرارة النمو المناسب (بين 15-25 درجة مئوية) لمدة 3-4 أيام أو حتى لوحات تتركز مع عدد كبير من البيض والديدان جرابيد.
- أغسل البيض والديدان قبالة لوحات باستخدام حوالي 6 مل من المخزن المؤقت M9 (انظر الجدول 1 للوصفة) كل لوحة 100 مم من الديدان الخيطية ونقل لهم مع الزجاج الماصات باستور في أنابيب الطرد المركزي 15 مل الفردية لكل سلالة. وتدور هذه الأنابيب إلى أسفل لمدة 3 دقائق في 6,180 س ز و aspirate خارج المخزن المؤقت M9، والإبقاء فقط الحيوانات والبيض بيليه.
- إضافة 3-4 مل من محلول التبييض (انظر الجدول 1 للوصفة) لكل أنبوبة ودوامه للحد الأدنى 6 M9 إضافة المخزن المؤقت لملء كل أنبوبة وتدور في س 6,180 ز لمدة 1 دقيقة ونضح المادة طافية بشكل متقطع. كرر هذا يغسل مع M9 ثلاث مرات ونقل بيليه البيض إلى أنبوب 15 مل طازجة التي تحتوي على حوالي 9 مل M9 المخزن المؤقت.
- مزامنة الديدان الطازجة مظلل نوتاتينج في 20 درجة مئوية حاء 16-48 تدور هذه الأنابيب أسفل في 6,180 ز x 1.5 دقيقة واخماد الحيوانات L1 متزامنة على لوحات NGM الفردية المصنفة حديثا مع حشيش OP50 (حوالي 6,000-10,000 الحيوانات كل لوحة 100 ملم) وتبقى عند 20 درجة مئوية.
- هذه الحيوانات وسوف تصل إلى مرحلة اليرقات L4 بعد ح ~ 42. وفي هذا الوقت، نقل اليرقات L4 اختيار البلاتين إلى OP50 باستخدام المصنف NGM لوحات تحتوي على 0.5 ملغ/مل 5-مخفضات-2 '--ديوكسيوريديني (فودر) لمنعها من إنتاج ذرية.
ملاحظة: تأكد من أن جميع سلالات متزامنة داخل تجربة لفترة مماثلة من الزمن. العلاج فودر يعقم الحيوانات ويمنع إنتاج البيض زرع وذرية، التي يمكن أن تؤثر على التعرف الضوئي على الحروف. سيتم تحليل هذه الحيوانات معقمة في اليوم التالي (يوم 1 الحيوانات الكبار في ح ~ 66) للمقايسة. وقد أبلغ فودر تؤثر فسيولوجيا وعمر بعض الديدان متحولة. ولذلك، وهذا ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار عند استخدام المخدرات للتعقيم12،،من1314. كما يمكن تعقيم الديدان بالوسائل بتأنيث الطفرات مثل fem-1(hc17) أو fem-3(e2006). ومع ذلك، قد تؤثر هذه الطفرات الوظيفة المتقدرية.
2-إعداد المركبات بالحقن والماء من المسابر
ملاحظة: أثناء فحص تشغيل، يتم قياس معدلات التنفس القاعدية والقصوى على حد سواء للخيطيات. يتم تشغيل التنفس القصوى في الحيوانات عند إضافة الكربونيل السيانيد-4 (تريفلورميثوكسي) فينيلهيدرازوني (فككب)، يفصل ionophore التي تزعج غشاء الميتوكوندريا المحتملة ومن ثم توليف ATP بنقل البروتونات عبر غشاء الميتوكوندريا، بينما يسمح لضخ البروتون، نقل الإلكترون، واستهلاك الأوكسجين المضي قدما4،15 فصل من التوليف ATP (الشكل 1). الخطوة النهائية في الإنزيم ينطوي على إضافة أزيد الصوديوم (نان3)، دواء الذي يحول دون المجمعات الرابع والخامس في إلخ، مما يسمح أحد لتحديد التنفس غير المتقدرية16 (الشكل 1). الخطوات التالية التي يمكن أن يؤديها في اليوم قبل تشغيل الفحص الفعلي.
- إعداد 1 مل الحلول المخزون من فككب (10 ملم في ثنائي ميثيل سلفوكسيد [[دمس]]: 1000 × تركيز التحليل النهائي) ومن نان3 (400 ملم في dH2o: 10 × تركيز التحليل النهائي) ومخزن في-20 درجة مئوية.
ملاحظة: تشغيل منحنى تركيز لتحسين تركيز فككب المطلوبة للحصول على أقصى استجابة التعرف الضوئي على الحروف لكل صك وإعداد مختبر. - هيدرات خرطوشة الاستشعار بإضافة 200 ميليلتر من dH2س لكل بئر (والخزان المحيطة بها) في اللوحة، التأكد من أن أجهزة الاستشعار المسابير مغمورة في dH2س ومخزن بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: خرطوشة يمكن أن تترك المسابير المغمورة ليصل إلى 72 ساعة لكن في حالة ترطيب فترة طويلة، ينبغي أن تكون ملفوفة في الفيلم البارافين اللوحات والمخزنة في 4 درجات مئوية. إذا لم يكن ممكناً ترطيب بين عشية وضحاها، ينبغي رطب خرطوشة استشعار لمالا يقل عن 4 ح قبل الفحص. - إيقاف عنصر التدفئة داخل واجهة ريسبيروميتير وتخزين الصك داخل حاضنة 15 درجة مئوية بين عشية وضحاها إلى انخفاض درجة الحرارة الأساسية داخل أداة لمنع الحيوانات من الانهاك أثناء الفحص تشغيل.
ملاحظة: ريسبيروميتير مجهزة بعنصر تسخين لكن لا يبرد. ضمن حاضنة 15 درجة مئوية، سيكون ريسبيروميتير درجة حرارة مستقرة بين 18 – 22 درجة مئوية، ودرجة حرارة صحية لصيانة C. ايليجانس .
3-المخدرات خرطوشة وتحميل الموازنة
- "الماصة؛" بها وتجاهل dH2س المستخدمة لهيدرات الاستشعار تحقيقات واستبدالها ب 200 ميليلتر من الحل كاليبرانت (الرقم الهيدروجيني 7.4) في كل بئر. تمييع الحل فككب الأسهم إلى 100 ميكرومتر فككب في dH2س وإضافة 20 ميليلتر من الحل المخفف لحقن المنفذ A في خرطوشة الاستشعار. إضافة 22 ميليلتر من أزيد الصوديوم 400 مم إلى منفذ ب خرطوشة سينور.
- تشغيل في ريسبيروميتير وفي الشاشة الرئيسية حدد البدء؛ سوف تظهر صفحة قوالب. على صفحة قوالب، حدد قالب مصمم مسبقاً؛ أو فارغ سوف تظهر صفحة المجموعات. على صفحة "مجموعات"، حدد الآبار A و H الآبار الخلفية وتعيين الآبار 6 المتبقية في المجموعات المناسبة وفقا لخطة تجريبية.
- دفع السهم الموجود في الزاوية اليمنى السفلي للذهاب إلى صفحة البروتوكول. في الصفحة "بروتوكول"، تأكد من تحديد الأزرار اكويليبراتيو القاعدية و حقن 1 و 2 . في هذه الصفحة، ضبط عدد القراءات القاعدية التعرف الضوئي على الحروف، فضلا عن التعرف الضوئي على الحروف القصوى (بعد حقن 1 مع فككب) وغير المتقدرية التعرف الضوئي على الحروف (بعد حقن 2 مع أزيد الصوديوم).
ملاحظة: كل قياس مسبوقاً بواسطة مزيج والخطوة الانتظار والأطر الزمنية لهذه المعلمات مبينة في الجدول 2. - حدد السهم الموجود في الزاوية السفلية اليمنى وسوف تظهر موجه لتحميل لوحة خرطوشة أجهزة الاستشعار. التأكد من تحميل لوحة خرطوشة أجهزة الاستشعار في الاتجاه الصحيح، اتباع الإرشادات التي تظهر على الشاشة تذكير الفوري. الآن سوف ريسبيروميتير أن حجته الخرطوشة.
ملاحظة: هذه الموازنة توفر متسع من الوقت لوضع الحيوانات ليكون جزيئي في آبار مناسبة للوحة الخلية.
4-إعداد لوحة دودة والمقايسة تشغيل
- إضافة 200 ميليلتر من المخزن المؤقت M9 في كل من 8 آبار لوحة الخلية وفي خزانات المياه المحيطة بالآبار.
- اختيار الديدان ~ 100 من كل سلالة على لوحات NGM المصنف والسماح للراحة لدقيقة 2-3 الرطب نهاية اختيار البلاتين مع المخزن المؤقت M9 وانتقاء الحيوانات متزامنة من سن 20 إلى الآبار ب-ز، ترك الآبار الخلفية A و H فارغة.
ملاحظة: بعد تحميل كل حسنا، الانتظار حوالي 2 دقيقة للسماح للحيوانات للاستقرار في الجزء السفلي من الآبار. من المستصوب أيضا أن يتم تشغيل منحنى رقم دودة لتحسين عدد الدودة الواحدة وكذلك لكل صك وإعداد مختبر. - الآن، ينبغي أن تكون محسوبة ريسبيروميتير وعن طريق النقر فوق موافق على الشاشة، يتم إخراج اللوح الذي يحتوي على المخزن المؤقت للمعايرة ويمكن إزالتها من ريسبيروميتير، في حين يبقى الخرطوشة استشعار داخل الصك. استبدال لوحة كاليبرانت مع اللوحة التي تحتوي على الحيوانات. تحميل لوحة وإغلاق الباب بضرب متابعة والسماح مقايسة لتشغيل.
5-تحليل البيانات تجربة ما بعد
- بمجرد اكتمال تشغيل الفحص، اتبع المطالبات التي تظهر على الشاشة وإزالة لوحة الخلية واستشعار خرطوشة وإدراج محرك أقراص محمول بمنفذ USB لحفظ بيانات التشغيل بتنسيق.war. إزالة خرطوشة الاستشعار والسماح للحيوانات إلى تسوية إلى الجزء السفلي من الآبار لحوالي 2 دقيقة بوضع لوحات الخلية تحت ستيريو تشريح مجهر وإحصاء عدد الحيوانات كل بئر.
- فتح برنامج التحليل على جهاز الكمبيوتر وفتح علامة التبويب التطبيع تطبيع التعرف الضوئي على الحروف لعدد الحيوانات. تطبيق تسميات مناسبة لمختلف الفئات تحت علامة التبويب تعديل وتصدير الملف كملف المنشور لمزيد من التحليل.
ملاحظة: متوسط القياسات الخمس الأولى، قبل إضافة فككب هو التعرف الضوئي على الحروف القاعدية، بينما متوسط القياسات الخمس بعد إضافة فككب OCR القصوى ومتوسط القياسات الخمس الأخيرة (وينبغي أن يتم الحد الأدنى من اثنين من القياسات) بعد إضافة أزيد الصوديوم هو معدل التنفس غير الميتوكوندريا. يجب تكرار الفحص ثلاث مرات التأكد من إمكانية تكرار نتائج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استخدام البروتوكول الموضحة هنا، التعرف الضوئي على الحروف من الحيوانات البرية نوع وثلاثة مختلفة sel-12 المسخ تم تحديد سلالات. بترميز sel-12 أورثولوج C. ايليجانس presenilin17. الطفرات في بريسينيلين البشرية هي انحراف الوراثية الأكثر شيوعاً المقترنة بتطوير مرض الزهايمر العائلي18. أظهرت دراساتنا مستويات مرتفعة من الكالسيوم المتقدرية في sel-12 الحيوانات المسخ مقارنة ب الحيوانات البرية نوع3. حيث يمكن أن يؤدي إلى التقلبات الكالسيوم في الوظيفة المتقدرية غيرت3،،من1920، التعرف الضوئي على الحروف في المسخ sel-12 والحيوانات البرية نوع تم قياس لدراسة تأثير الطفرات sel-12 في الوظيفة المتقدرية والصحة. الحيوانات البرية نوع الدوام أظهرت معدلات التعرف الضوئي على الحروف القاعدية أدناه 5 pmol/min/الدودة، في حين أظهرت كل ثلاث سلالات من طفرات sel-12 مرتفعة إلى حد كبير التعرف الضوئي على الحروف ~ 7 pmol/min/الدودة (رقم 3 و رقم 4). عند إضافة فككب، كما هو متوقع، هناك زيادة في التعرف الضوئي على الحروف من نوع البرية فضلا عن طفرات sel-12 (الشكل 3 و الشكل 5). وأظهرت الحيوانات البرية نوع الحد الأقصى التعرف الضوئي على الحروف ~ 7 pmol/min/الدودة، بينما كان طفرات sel-12 التعرف الضوئي على الحروف ~ 10 pmol/min/الدودة (الشكل 5).
رقم 1: التخطيطي من اللاعبين الرئيسيين المتورطين في التنفس الخلوي وتأثير أزيد الصوديوم وفككب- نقل الإلكترونات من NADH إلى إلخ معقدة النتائج في توليد التدرج الكهروكيميائية عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلية كما تحصل على ضخ البروتونات عبرها. البروتونات التي تتدفق عائدة إلى المصفوفة المتقدرية من الفضاء intermembrane عبر نتائج الخامس المعقدة في توليف ATP. يؤدي إضافة فككب الهدف من هذه العملية بتعطيل إمكانات غشاء الميتوكوندريا وبالتالي توليف ATP، بينما لا يزال استهلاك الأوكسجين، مما يسمح لقياس القصوى التعرف الضوئي على الحروف. أزيد الصوديوم (نان3) مثبط مجمعات الرابع والخامس، مما يسمح لقياس التنفس غير المتقدرية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: التخطيطي للخطوات المتبعة في قياس التعرف الضوئي على الحروف في C. ايليجانس. الخطوات الخمس المشاركة في إعداد المقايسة وتشغيل (يسار) وجدولاً زمنياً لكل خطوة (علىاليمين). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الشخصية المميزة التعرف الضوئي على الحروف في ريسبيروميتري C. ايليجانس . القراءات الأولية خمسة إظهار التنفس القاعدية، تليها قراءات خمسة من الأعلى والقراءات الخمس للتنفس غير المتقدرية بعد حقن أزيد الصوديوم وفككب، على التوالي. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للقياس (SEM). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: تنفس القاعدية في نوع البرية ومختلف sel-12 طفرات. متوسط التنفس القاعدية في يوم 1 الكبار السن مطابقة نوع البرية و sel-12 متحولة الحيوانات. تكرار البيانات المجمعة من التحليل الثلاثة. أشرطة الخطأ تمثل وزارة شؤون المرأة و * * * يشير إلى ف < 0.0001. القيم ف حسبت باستخدام ثنائي الطرف تي-اختبار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5: التنفس القصوى في نوع البرية ومختلف sel-12 طفرات. متوسط التنفس القصوى في يوم 1 الكبار السن مطابقة نوع البرية sel-12 متحولة الحيوانات وبعد الحقن فككب. تكرار البيانات المجمعة من التحليل الثلاثة. أشرطة الخطأ تمثل وزارة شؤون المرأة و * * * يشير إلى ف < 0.0001. القيم ف حسبت باستخدام ثنائي الطرف تي-اختبار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| M9 المخزن المؤقت (1 لتر) | |||
| dH2س | مل 1,000 | ||
| كلوريد الصوديوم | ز 5 | ||
| خ2ص4 | الجيل الثالث 3g | ||
| غ2هبو4 | ز 6 | ||
| 1 م MgSO4 | 1 مل * إضافة بعد التعقيم | ||
| انقسام بين زجاجات 2: 500 مل. اﻷوتوكﻻف على دورة السائل (التعرض لمدة 15 دقيقة) | |||
| الحل التبييض (50 مل) | |||
| dH2س | مل 36 | ||
| بليتش | 14 مل | ||
| هيدروكسيد الصوديوم N 10 | ميكروليتر 800 | ||
| لوحات وسائط النمو ديدان أسطوانية (NGM) القياسية | |||
| 1 L | 0.5 لتر | 0.25 لتر | |
| كلوريد الصوديوم | الجيل الثالث 3g | ز 1.5 | ز 0.75 |
| بكتو-أجار | ز 17 | ز 8.5 | 4.25 g |
| ببتون بكتو | 2.5 g | ز 1.25 | ز 0.625 |
| أ تسمح اﻷوتوكﻻف في دورة السائل (45 دقيقة التعرض)، كول إلى ~ 60 درجة مئوية ثم استخدام تقنية تعقيم وإضافة ما يلي: | |||
| 1 L | 0.5 لتر | 0.25 لتر | |
| كاكل م 12 | 1 مل | 0.5 مل | 0.25 مل |
| 1 م MgSO4 | 1 مل | 0.5 مل | 0.25 مل |
| مشرف م 14 | 25 مل | مل 12.5 | مل 6.25 |
| نسبة الكولسترول في الدم 5 ملغ/مل | 1 مل | 0.5 مل | 0.25 مل |
| ب دوامة المزيج جيدا بعد كل إضافة. بعد إجراء جميع الإضافات، من أجل لوحات | |||
الجدول 1: وصفات للوحات NGM، M9 المخزن المؤقت، والحل التبييض.
| معايرة | بصل | فككب | أزيد الصوديوم |
| المنفذ: A | المنفذ: ب | ||
| الموازنة: نعم | ميكس: 00:02:00 | ميكس: 00:02:00 | ميكس: 00:02:00 |
| الانتظار: 00:00:30 | الانتظار: 00:00:30 | الانتظار: 00:00:30 | |
| قياس: 00:02:00 | قياس: 00:02:00 | قياس: 00:02:00 | |
| دورات: 5 | دورات: 5 على الأقل | دورات: 2−5 | |
| المدة: 00:22:30 | المدة: 00:22:30 | المدة: 00:09:00 |
الجدول 2: معلمات المقايسة مميزة في C. ايليجانس ريسبيروميتري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التنفس المتقدرية مؤشرا الثاقبة من الوظيفة المتقدرية؛ ولذلك، أن تكون قادرة على قياس معدلات استهلاك الأكسجين في نظام البيولوجي، سواء في المختبر أو في الحية قيمة للغاية. بمعنى ريسبيروميتيرس مستويات الأوكسجين باستخدام فوسفورات المستندة إلى البورفيرين التي تحصل على مروي بالأكسجين أو عن طريق أجهزة الاستشعار الأوكسجين أمبيروميتريك التي تعتمد على توليد النسبي الحالي الكهربائية لضغط الأكسجين. القطب كلارك يندرج في هذه الفئة الأخيرة، وقد استخدم على نطاق واسع في الأدب، ولا سيما أثناء تحليل التنفس في C. ايليجانس. ومع ذلك، الحاجة إلى حجم عينة كبيرة وعدم القدرة على تقييم نموذج واحد أو أكثر في وقت واحد يجعل أمبيروميتريك الأكسجين وأجهزة الاستشعار غير فعالة.
يوفر هذا البروتوكول دليل بسيط لتدبير التعرف الضوئي على الحروف في العيش، سليمة C. ايليجانس دون عزل الميتوكوندريا، عملية التي يمكن أن يحتمل أن تؤثر غشاء الميتوكوندريا المحتملة، وبالتالي فالتعرف الضوئي على الحروف. الحيوانات المستخدمة في هذا البروتوكول نظراً لأن معرض الحيوانات المختلفة التعرف الضوئي على الحروف من خلال مختلف مراحل الحياة، ينبغي أن يكون العمر متزامنة. الحيوانات الأصغر التعرف الضوئي على الحروف أقل مقارنة بالكبار الحيوانات ومستويات التعرف الضوئي على الحروف يمكن إسقاط مرة أخرى كالحيوانات العمر زيادة3. كما يتم تعقيم C. ايليجانس باستخدام فودر لضمان أن لا يتم مرتبك التعرف الضوئي على الحروف بوجود ذرية. ومع ذلك، إذا كانت الحيوانات ذات أحجام مختلفة لفحصها، استراتيجيات للتطبيع يلزم معالجتها.
هذا البروتوكول يستخدم اختيار البلاتين لنقل الحيوانات إلى لوحة المقايسة. خلافا لنقل السوائل من الحيوانات، يمكن التلاعب بهذا الباحث يدرس بعناية وتحديد صحة الحيوانات قبل وأثناء عملية النقل. أيضا، أنها تسمح بتحكم أفضل في عدد دودة، ويمنع إدخال البيض وجثث. منذ الحيوانات حية ونشطة أثناء تشغيل الفحص، تقلب من المرجح أن تنشأ من التحقيق لتحديد المواقع. فحوصات وينبغي أن يتم ذلك في ثلاث نسخ، وينبغي تكرارها على الأقل ثلاث مرات. أيضا، أن عدد الحيوانات فحص مزدوجة الوظيفة تحليل مهم لتطبيع لعدد الحيوانات. عيب رئيسي لهذا البروتوكول هو عدم القدرة على مقارنة العينات اثنين أو أكثر في وقت واحد، دون المساس بعدد replicates داخل مقايسة واحدة. على الرغم من هذا التحديد، يمكن أن يكون هذا البروتوكول أداة بحث قوية جداً في تحليل التعرف الضوئي على الحروف عند مقارنة الأنماط الجينية أو شروط. وعلاوة على ذلك، وهذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لدراسة التعرف الضوئي على الحروف للحيوانات التي نمت على مصادر الغذاء المختلفة، والمكملات الغذائية، أو العلاج بالعقاقير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
الكتاب يود أن ينوه الدكتور كيفين Bittman لقيادته في إنشاء XFp فرس البحر في المختبر. المعاهد الوطنية "للصحة" منح GM088213 تؤيد هذا العمل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm, 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900, 2901 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Globe Scientific | 6285 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
| 22 × 22 mm coverslip | Globe Scientific | 1404-10 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD, Bacto | 211705 | |
| Bacto yeast extract | BD, Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Abcam | ab120081 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Deionized water (dH2O) | |||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thomas Scientific | C987Y85 | |
| Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 | |
| Seahorse XFp Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent | 103022-100 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 |
References
- Nelson, D. L., Cox, M. M. Ch. 19. Lehninger Principles of Biochemistry. Ahr, K. , W. H. Freeman and Company. 707-772 (2008).
- Marchi, S., et al. Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death. Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).
- Sarasija, S., et al. Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. eLife. 7, (2018).
- Luz, A. L., et al. Mitochondrial Morphology and Fundamental Parameters of the Mitochondrial Respiratory Chain Are Altered in Caenorhabditis elegans Strains Deficient in Mitochondrial Dynamics and Homeostasis Processes. PLoS One. 10, e0130940 (2015).
- Ryu, D., et al. Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C. elegans and increases muscle function in rodents. Nature Medicine. 22, 879-888 (2016).
- Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, 1041-1053 (2013).
- Schulz, T. J., et al. Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress. Cell Metabolism. 6, 280-293 (2007).
- Koopman, M., et al. A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 11, 1798-1816 (2016).
- Sarasija, S., Norman, K. R. Analysis of Mitochondrial Structure in the Body Wall Muscle of Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 8, (2018).
- Sarasija, S., Norman, K. R. Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein. Bio-protocol. 8, (2018).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. 47 (47), (2011).
- Aitlhadj, L., Sturzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131, 364-365 (2010).
- Rooney, J. P., et al. Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans. Experimental Gerontology. 56, 69-76 (2014).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing and Development. 132, 519-521 (2011).
- Heytler, P. G., Prichard, W. W. A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones. Biochemical and Biophysical Research Communications. 7, 272-275 (1962).
- Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).
- Levitan, D., Greenwald, I. Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer's disease gene. Nature. 377, 351-354 (1995).
- Sherrington, R., et al. Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease. Nature. 375, 754-760 (1995).
- Glancy, B., Balaban, R. S. Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics. Biochemistry. 51, 2959-2973 (2012).
- Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201, 1453-1466 (2015).
