Summary
线粒体呼吸对组织的生存至关重要;因此, 耗氧率是线粒体健康的一个很好的指标。在这个协议中, 我们描述了使用一个商业上可用的呼吸计来测量基本和最大耗氧率的活, 完整, 和自由运动的。
Abstract
最佳线粒体功能对健康的细胞活动至关重要, 特别是在神经系统和肌肉等能量需求较高的细胞中。与此相一致的是, 线粒体功能障碍与无数的神经退行性疾病和一般的衰老有关。线虫是阐明线粒体功能的许多复杂问题的有力模型系统。线粒体呼吸是线粒体功能的强大指标, 最近开发的呼吸计为测量细胞呼吸提供了一个最先进的平台。在这个协议中, 我们提供了一种分析活的、完整的线虫的技术。该协议跨越约7天的时间, 包括 (1) 线虫生长和同步的步骤, (2) 制备注入的化合物和探针的水合作用, (3) 药物装载和弹药筒平衡, (4) 制备蠕虫试验板和分析运行, 以及 (5) 实验后数据分析。
Introduction
三磷酸腺苷 (atp) 是细胞能量的主要来源, 是由位于线粒体内膜内的电子传输链 (etc) 中的酶在线粒体中产生的。丙酮酸是用于线粒体 atp 生产的一种关键代谢物, 被导入线粒体基质中, 在那里它被脱羧化, 以产生乙酰辅酶 a (coenzyme)。随后, 乙酰 coa 进入柠檬酸循环, 导致烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (nadh) 的产生, 这是一个关键的电子载体分子。当来自 nadh 的电子通过 etc 传递到氧气时, 质子就会在线粒体膜间空间中积累, 从而导致整个膜产生一个电化学梯度。然后, 这些质子将通过这个电化学梯度从膜间空间流回线粒体基质, 通过 atp 合成酶的质子孔, 推动其旋转和 atp1的合成 (图 1)。
线粒体功能不仅限于能量的产生, 而且对钙的稳态、活性氧的清除和凋亡也至关重要, 关键的是将其功能定位在组织健康中 2.线粒体功能可以使用多种检测方法进行评估, 包括但不限于测量线粒体膜电位、atp 和 ros 水平以及线粒体钙浓度的分析。然而, 这些检测提供了线粒体功能的单一快照, 因此可能无法提供线粒体健康的全面视图。由于 atp 生成过程中的耗氧量依赖于无数的连续反应, 因此它是线粒体功能的一个优越指标。有趣的是, 由于线粒体功能障碍3,4,5, 已经观察到氧气消耗率的变化。
活样品的耗氧率 (ocr) 可以通过可大致分为两类的技术来测量: 安培氧传感器和基于斑岩的荧光粉, 它们可以通过氧6淬火.安培氧传感器已被广泛用于测量 ocr 在培养的细胞, 组织, 和模型系统, 如线虫。然而, 含有呼吸计的基于斑林的荧光粉具有以下优点: (1) 它们允许对两个样品进行三式三份的并排比较, (2) 它们需要较小的样本尺寸 (例如, 每口井20头蠕虫, 而在 2000-500只室)7, 和 (3) 呼吸计可以编程做四个不同的复合注射在整个实验运行的理想时间, 无需手动应用。
在该协议中, 描述了使用基于斑林的氧传感呼吸计测量 ocr 在活的, 完整的线虫所涉及的步骤.虽然有一个书面协议的使用大格式, 高吞吐量呼吸计 8, 该协议已被调整为使用更经济友好, 易于访问, 和较小的规模的仪器。该协议对于评估两个菌株之间的 ocr 差异特别有用, 因为在这两个菌株中不需要高通量筛选, 并且其使用过多。
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Protocol
注:图 2提供了完整协议的示意图概述。
1. 线虫种群的生长和同步9,10
- 将所需遗传背景的 l4 幼虫 (如 n2 [野生类型] 和 sel-12 动物) 转移到线虫生长培养基 (ngm) 板 (菜谱见表 1 ), 新播种的大肠杆菌草坪 (op50)11. 每个应变至少使用两个100毫米或三个60毫米板。在适当的生长温度 (15-25°c) 孵育蠕虫 3-4天, 或直到盘子与大量的鸡蛋和妊娠蠕虫集中。
- 使用每100毫米线虫板大约6毫升的 mL 缓冲液 (配方见表 1 ) 将鸡蛋和蠕虫从盘子里洗掉, 并将其与玻璃巴斯德移液器一起转移到每个菌株的单独15毫升离心管中。将这些管子向下旋转 3分钟, 在 6, 180 x 克, 并吸入 m9 缓冲液, 只保留动物和蛋丸。
- 在每个管中加入3-4 毫升漂白剂 (配方见表 1 ), 间歇性涡旋 6分钟, 加入 mL 缓冲液, 填充每个管, 以 6, 180 x 克旋转 1分钟, 吸气上清液。重复此清洗与 mL 三次, 并将鸡蛋颗粒移动到一个新鲜的15毫升管, 其中包含约9毫升的 mL 缓冲液。
- 在20°c 下将新鲜孵化的蠕虫与雾化16–48小时同步. 将这些管向下旋转, 6, 180 x 克, 1.5 分钟, 并将同步的 l1 动物放在新鲜播种的单独 ngm 板上, 用 op50 的草坪 (每100毫米板约 6000-10000只动物)并保持在20°c。
- 这些动物将在 ~ 42小时后进入 l4 幼虫阶段。此时, 使用铂素采摘将 l4 幼虫移动到含有 0.5 mgl 5-fluoro-2 '-脱氧苯胺 (fudr) 的 op50 种子 ngm 板, 以防止它们产生后代。
注: 请确保在实验中, 所有菌株在类似的时间内同步。fudr 处理对动物进行消毒, 防止产蛋和后代生产, 这可能会影响 ocr。这些灭菌的动物将在第二天 (第1天成年动物在 ~ 66小时) 进行分析进行检测。据报道, fudr 会影响某些突变蠕虫的生理和寿命。因此, 在使用药物进行灭菌时, 应考虑到这一点, 12、13、14.蠕虫也可以通过女性 1(hc17) 或女性 3(e2006) 等突变的女性化的方式进行消毒。然而, 这些突变可能会影响线粒体功能。
2. 注射化合物的制备和探针的水合作用
注: 在检测过程中, 测量线虫的基础和最大呼吸速率。当添加碳基氰化物-4 (三氟甲氧基) 苯基氨 (fccp) 时, 动物会产生最大的呼吸, 这是一种解偶联的离子体, 它干扰线粒体膜电位, 从而通过运输质子合成 atp通过线粒体膜, 同时允许质子泵送, 电子传输, 和氧气消耗进行4,15从 atp 合成解除 (图 1)。该检测的最后一步是添加氮化钠 (nn3),这是一种抑制 etc 中复合物 iv 和 v 的药物, 允许人们确定非线粒体呼吸 16 (图 1).以下步骤可以在实际检测运行前一天执行。
- 制备 fccp (二甲基亚硫酸盐中的 10 mm [dmso]: 1000x 最终测定浓度) 和 nn3 (dh 2 o:10 x 最终测定浓度为 400 mm) 的1毫升库存溶液, 并存储在-20°c.
注: 运行一个浓度曲线, 以优化所需的 fccp 浓度, 以获得每个仪器和实验室设置的最大 ocr 响应。 - 通过在板中的每口井 (和周围的储层) 上添加200μl 的 dh2o来保湿传感器墨盒, 确保传感器探头淹没在 dh2o中, 并在室温下过夜。
注: 墨盒探头可以被淹没长达 72小时, 但在长期水化的情况下, 板材应用石蜡膜包裹, 并存放在4°c。如果无法在夜间水合作用, 传感器墨盒应在检测前至少加水4小时。 - 关闭呼吸计界面内的加热元件, 并将仪器存放在15°c 孵化器内过夜, 以降低仪器内的核心温度, 防止动物在检测过程中过热。
注: 呼吸计配有加热元件, 但不能冷却。在15°c 的孵化器内, 呼吸计的温度将稳定在18-22°c 之间, 这是线虫维护的健康温度。
3. 药物装载和墨盒平衡
- 移液器取出并丢弃用于为传感器探头提供水合物的 dh2o,并将其替换为每口井中校准溶液 (ph 7.4) 的200μl。将 fccp 库存溶液稀释到 dh2o 中的 100μm fccp, 并在传感器墨盒中的注射端口 a 中添加20μl 稀释后的溶液.在传感器墨盒的 b 端口添加22μl 的 400 mm 氮化钠。
- 打开呼吸计, 在主屏幕上选择"开始";将显示模板页面。在模板页上, 选择 "空白"或以前设计的模板; 在 "模板" 页上, 选择 "空白" 或 "以前设计的模板"。将显示 "组" 页。在 "组" 页上, 选择 a 和 h 作为背景井, 并根据实验计划将剩余的6口井分配到适当的组中。
- 按右下角的箭头转到 "协议" 页。在 "协议" 页上, 确保选择"平衡"、 "基础" 和"喷射器 1" 和 "2 " 按钮。在此页上, 调整基础 ocr 的读数, 以及最大 ocr (注射1与 fccp 后) 和非线粒体 ocr (注射2后与氮化钠)。
注: 每个测量前面都有一个混合和等待步骤, 这些参数的时间范围如表 2所示。 - 选择右下角的箭头, 将出现加载传感器墨盒板的提示。按照提醒提示屏幕上的说明, 确保以正确的方向加载传感器墨盒板。呼吸计现在将平衡墨盒。
注: 这种平衡提供了充足的时间, 将动物被检测到适当的井的细胞板。
4. 蜗杆板的制备和检测运行
- 在电池板的8口井和井周围的储层中加入200μl 的 m9 缓冲液。
- 从每个菌株中选取 ~ 100个蠕虫到未播种的 ngm 板上, 并允许在铂族中停留 2-3分钟. 用 m9 缓冲液将白金采摘的末端弄湿, 并将20只年龄同步的动物放入 bb-g 井中, 使背景井 a 和 h 空。
注: 装入每口井后, 等待大约 2分钟, 让动物沉淀到井底。还建议运行蠕虫数曲线, 以优化每个仪器和实验室设置的每口井蠕虫数。 - 到现在为止, 应校准呼吸计, 并通过单击屏幕上的"确定" , 将弹出包含校准缓冲器的板, 并可从呼吸计中取出, 而传感器墨盒则停留在仪器内部。将校准板更换为包含动物的板。加载板并通过点击继续关闭门, 并允许检测运行。
5. 实验后数据分析
- 检测运行完成后, 按照屏幕上的提示操作, 取出电池板和传感器墨盒, 并将闪存驱动器插入 usb 端口, 以保存. war 格式的运行数据。取出传感器盒, 让动物在井底沉淀约 2分钟, 将细胞板放在立体解剖显微镜下, 计算每口井的动物数量。
- 打开计算机上的分析软件, 然后打开规范化选项卡, 将 ocr 规范化为动物编号。在 "修改" 选项卡下为不同组应用适当的标签, 并将文件导出为棱镜文件以供进一步分析。
注: 在添加 fccp 之前的前五个测量值的平均值是基本 ocr, 而在 fccp 添加后的五个测量值的平均值是最大 ocr 值和最后五个测量值的平均值 (至少应执行两个测量值)氮化钠添加后是非线粒体呼吸速率。该检测应重复三次, 以确保重现性。
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Representative Results
利用本文描述的方法, 测定了野生动物的 ocr 和三种不同的 sel-12突变体菌株。sel-12编码了前青霉素 17的线虫矫形器.人预觉素突变是家族性阿尔茨海默病发展过程中最常见的遗传畸变 18.我们的研究表明, 与野生动物相比,自己 12突变动物的线粒体钙含量升高.由于钙失调会导致自12突变体和野生动物线粒体功能3、19、20、ocr 改变, 以检验自 12突变的影响线粒体功能和健康。野生动物的基础 ocr 率一直低于 5-pmol 蠕虫, 而所有三株sel-12突变体的 ocr 显著升高 ~ 7 pmom# 蠕虫 (图 3和图 4)。如预期的那样, 在增加 fccp 后, 野生类型的 ocr 以及sel-12突变体的 ocr 增加 (图 3和图 5)。野生动物的 ocr 最大值为 ~ 7-pmom·蠕虫,而自己的 12个变种动物的 ocr 为 ~ 10 pmom·蠕虫 (图 5)。
图 1: 参与细胞呼吸的主要参与者的原理图以及 fccp 和氮化钠的影响.当质子被泵送到线粒体膜上时, 电子从 nadh 转移到 etc 复合体 i 会产生一个电化学梯度。质子通过复合 v 从膜间空间回流到线粒体基质中, 导致 atp 合成。fccp 的加入通过破坏线粒体膜电位从而破坏 atp 合成, 从而导致了这一过程的解耦, 而氧气消耗仍在继续, 从而允许测量最大 ocr。氮化钠 (nn3) 是复合物 iv 和 v 的抑制剂, 因此可以测量非线粒体呼吸。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2:线虫 ocr测量所涉及的步骤示意图。检测设置和运行 (左) 涉及的五个步骤以及每个步骤的时间框架 (右)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3:线虫呼吸测量仪中的特征 ocr 剖面.5个初始读数显示了基础呼吸, 然后分别在 fccp 和氮化钠注射后, 对非线粒体呼吸进行了5次读数和5次读数。误差条表示测量的标准误差 (sem)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 野生类型和各种自 12突变体的基底呼吸。平均基础性呼吸在第1天成人年龄匹配野生类型和sel-12突变体动物。从三次检测重复中汇编的数据。误差条表示 sem, * * * 表示 p & lt;0.0001。p值是使用双尾t-测试计算的。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 野生类型和各种自 12突变体的最大呼吸。fccp 注射后第1天成人年龄匹配野生类型和自 12个突变体动物的平均最大呼吸。从三次检测重复中汇编的数据。误差条表示 sem, * * * 表示 p & lt;0.0001。p值是使用双尾t-测试计算的。请点击这里查看此图的较大版本.
| m9 缓冲器 (1 升) | |||
| dh2o | 1, 000 毫升 | ||
| Nacl | 5克 | ||
| kh2po4 | 3克 | ||
| na2hpo4 | 6克 | ||
| 1 m mgso4 | 高压灭菌后添加1毫升 * | ||
| 在2瓶之间拆分: 每瓶500毫升。液体循环上的高压灭菌器 (曝光 15分钟) | |||
| 漂白剂溶液 (50 毫升) | |||
| dh2o | 36毫升 | ||
| 漂白剂 | 14毫升 | ||
| 10 n naoh | 800μl | ||
| 标准线虫生长介质 (ngm) 板 | |||
| 1升 | 0.5 升 | 0.25 升 | |
| Nacl | 3克 | 1.5 克 | 0.75 克 |
| 巴博托-阿加尔 | 17克 | 8.5 克 | 4.25 克 |
| 巴托佩普托内 | 2.5 克 | 1.25 克 | 0.625 克 |
| a. 液体循环上的高压灭菌器 (曝光 45分钟), 允许冷却至 ~ 60°c, 然后使用无菌技术并添加以下内容: | |||
| 1升 | 0.5 升 | 0.25 升 | |
| 1 m ccl2 | 1毫升 | 0.5 毫升 | 0.25 毫升 |
| 1 m mgso4 | 1毫升 | 0.5 毫升 | 0.25 毫升 |
| 100万 kpo4 | 25毫升 | 12.5 毫升 | 6.25 毫升 |
| 5 mgml 胆固醇 | 1毫升 | 0.5 毫升 | 0.25 毫升 |
| b. 每次加入后, 旋转要彻底混合。在所有的添加完成后, 倒板 | |||
表 1: ngm 板、m9 缓冲液和漂白剂溶液的配方。
| 校准 | 基底 | fccp | 氮化钠 |
| 端口: a | 港口: b | ||
| 平衡: 是 | 混合:00:02:00 | 混合:00:02:00 | 混合:00:02:00 |
| 等待:00:30 | 等待:00:30 | 等待:00:30 | |
| 措施:00:02:00 | 措施:00:02:00 | 措施:00:02:00 | |
| 周期: 5 | 周期: 至少5 | 周期: 2-5 | |
| 持续时间:27:30 | 持续时间:27:30 | 持续时间:00:00 |
表 2:c. 线虫的呼吸测量。
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Discussion
线粒体呼吸是线粒体功能的一个有见地的指标;因此, 能够测量生物系统中的耗氧率, 无论是在体外还是体内, 都是非常有价值的。呼吸计使用基于斑啉的荧光粉检测氧气水平, 这些荧光粉通过氧或依靠产生与氧气压力成正比的电流的安培氧传感器淬火。克拉克电极属于后一类, 在文献中得到了广泛的应用, 特别是在分析线虫的呼吸时。然而, 由于需要较大的样品尺寸和无法一次评估多个样品, 安培氧传感器效率低下。
该协议提供了一个简单的指南来测量 ocr 在活的, 完整的线虫, 而不分离线粒体, 这一过程可能会影响线粒体膜电位, 因此, ocr。鉴于动物在不同的生命阶段表现出不同的 ocr, 本协议中使用的动物应该是年龄同步的。年轻动物的 ocr 低于成年动物, 随着动物年龄的进一步 3岁, ocr 水平可能会再次下降。c. 线虫也通过使用 fudr 进行消毒, 以确保 ocr 不会被后代的存在所迷惑。然而, 如果要检查不同大小的动物, 就需要解决正常化的战略问题。
该协议利用白金采摘转移动物到检测板。与动物的液体转移不同的是, 这种操作使研究人员能够在转移之前和过程中仔细检查和确定动物的健康。此外, 它可以更好地控制蠕虫数量, 并防止引入鸡蛋和尸体。由于动物在检测过程中是活的和活跃的, 因此可能会产生探针定位的可变性。因此, 应进行一次式一次的检测, 并应至少重复三次。另外, 对动物数量后分析进行复检, 对动物数量正常化也很重要。此协议的一个主要缺点是无法同时比较两个以上的样本, 而不会影响单个检测中的复制数量。尽管有此限制, 该协议可以是一个非常强大的研究工具, 在比较两个基因型或条件时分析 ocr。此外, 该协议可以很容易地适应检查生长在不同食物来源、补充剂或药物治疗中的动物的 ocr。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者们要感谢凯文·比特曼博士在实验室建立海马 xfp 方面的指导。国家卫生研究院 gm088213 支持这项工作。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm, 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900, 2901 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Globe Scientific | 6285 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
| 22 × 22 mm coverslip | Globe Scientific | 1404-10 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD, Bacto | 211705 | |
| Bacto yeast extract | BD, Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Abcam | ab120081 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Deionized water (dH2O) | |||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thomas Scientific | C987Y85 | |
| Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 | |
| Seahorse XFp Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent | 103022-100 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 |
References
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