Summary
נשימה מיטוכונדריאלי חיוני להישרדות organismal; לכן, קצב צריכת החמצן היא מדד מצוין של בריאות מיטוכונדריאלי. פרוטוקול זה, אנו מתארים את השימוש respirometer זמינים מסחרית כדי למדוד הבזליים, שיעורי צריכת חמצן מירבית חיים, שלמים, ולא תאי בחופשיות Caenorhabditis elegans.
Abstract
הפונקציה מיטוכונדריאלי האופטימלי הוא קריטי עבור פעילות תאית בריאה, במיוחד בתאי בעלי אנרגיה גבוהה דרישות כמו אלה במערכת העצבים, שרירים. בקנה אחד עם זה, תפקוד מיטוכונדריאלי היה קשור עם מספר עצום של מחלות ניווניות והתיישנות באופן כללי. Caenorhabditis elegans כבר מערכת מודל רב עוצמה עבור שחקרתי המורכבות הרבה של הפונקציה מיטוכונדריאלי. נשימה מיטוכונדריאלי הוא סימן חזק של פונקציה מיטוכונדריאלי, respirometers פיתחה לאחרונה מציעים פלטפורמה המדינה-of-the-art כדי למדוד את הנשימה בתאים. ב פרוטוקול זה, אנו מספקים שיטה לנתח חיים, שלמים C. elegans. פרוטוקול זה משתרע על פני תקופה של ~ 7 ימים, כולל שלבי (1) גדל וסינכרון של C. elegans, (2) הכנת תרכובות כדי להיות מוזרק, הידרציה של הגששים, equilibration וטעינה של מחסנית סמים (3), (4) הכנת assay תולעת צלחת assay לרוץ ו ניתוח נתונים לאחר הניסוי (5).
Introduction
אדנוזין טריפוספט (ATP), המקור העיקרי של אנרגיה תאית, מיוצר בתוך המיטוכונדריה על ידי אנזימים בשרשרת האלקטרונים תחבורה (וכו ') הממוקם בתוך הקרומית מיטוכונדריאלי הפנימי. פירובט, מטבוליט מפתח מנוצל לייצור ATP מיטוכונדריאלי, מיובא לתוך מאטריקס מיטוכונדריאלי איפה decarboxylated לייצר אצטיל קואנזים A (CoA). לאחר מכן, אצטיל CoA מזין את מעגל קרבס וכתוצאה מכך הדור של nicotinamide אדנין dinucleotide (NADH), מולקולה נשא אלקטרונים מפתח. כמו אלקטרונים NADH מועברים למנהל חמצן דרך ועוד, פרוטונים לבנות בחלל intermembrane מיטוכונדריאלי, דבר המתבטא הדור הצבע אלקטרוכימי על פני הקרום. אלה פרוטונים יזרום אז מן המרחב intermembrane מעבר הדרגתי אלקטרוכימי הזה בחזרה לתוך המטריקס מיטוכונדריאלי דרך הנקבובית פרוטון של ATP סינתאז, נהיגה הסיבוב שלה, הסינתזה של ATP1 (איור 1).
הפונקציה מיטוכונדריאלי אינה מוגבלת ייצור אנרגיה, אבל הוא גם מכריע הומאוסטזיס סידן, מינים חמצן תגובתי (ROS) ניקוי של אפופטוזיס, אנושות מיצוב תפקידם בריאות organismal2. הפונקציה מיטוכונדריאלי יכול להיות מוערך באמצעות מגוון של מבחני, כולל אך לא מוגבל ניתוחים המודדים מיטוכונדריאלי קרומית אפשרית רמות ATP ו- ROS, ריכוזי סידן מיטוכונדריאלי. עם זאת, אלה מבחני לספק תמונה אחת של פונקציה מיטוכונדריאלי, ולכן אולי לא מספקת תצוגה מקיפה של בריאות מיטוכונדריאלי. מאז צריכת חמצן בעת יצירת ATP הוא מסתמך על מספר עצום של תגובות רציפים, היא מגישה כסמן מעולה של פונקציה מיטוכונדריאלי. מעניין, וריאציות שיעורי צריכת חמצן נצפו כתוצאה בתפקוד מיטוכונדריאלי3,4,5.
שיעורי צריכת חמצן (OCR) של החיים דוגמאות ניתן למדוד באמצעות טכניקות ניתן לחלק לשתי קבוצות: amperometric חיישני חמצן, חומר זרחני מבוססי פורפירין זה יכול לכלותה חמצן6. חיישני חמצן Amperometric נעשה שימוש נרחב מודדים OCR ב בתרבית תאים, רקמות, וב -דגם מערכות, כגון C. elegans. עם זאת, חומר זרחני מבוססי פורפירין המכיל respirometers יש את היתרונות הבאים: (1) שהם מאפשרים השוואה לצד השני של שני מדגמים שהפקידים, (2) הם דורשים גודל מדגם קטן יותר (למשל, תולעים 20 לכל טוב לעומת ~ 2, 000−5, 000 תולעים קאמרית)7, ו- (3) ניתן לתכנת את respirometer לעשות ארבע זריקות מורכבים שונים-רצוי פעמים לאורך כל רץ ניסיוני, ומבטל את הצורך עבור יישום ידני.
פרוטוקול זה, הם שלבים המעורבים בשימוש של פורפירין מבוססות חיישן חמצן respirometer מודדים OCR ב- חיים, שלמים C. elegans מתואר. אמנם יש פרוטוקול בכתב לשימוש בפורמט גדול, תפוקה גבוהה respirometer8, פרוטוקול זה כבר מותאם לשימוש עם מכשיר ידידותי, נגיש וקטן בהיקף תקציב נוסף. פרוטוקול זה שימושי במיוחד להערכת ההבדל ב- OCR בין שני זנים, שבו לא נדרש ההקרנה תפוקה גבוהה, השימוש בו יהיה מוגזם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: איור 2 מספק מבט סכמטי של פרוטוקול מלא.
1. צמיחה וסינכרון של האוכלוסייה נמטודות9,10
- העברת L4 הזחלים של רקע גנטי הרצוי (למשל, N2 [wild type] ובעלי sel-12) על גבי נמטודות מדיה (NGM) לוחיות גדילה (ראה טבלה 1 למתכון) טרי נזרע עם מדשאה Escherichia coli (OP50)11. להשתמש לפחות שני 100 מ"מ או שלוש צלחות 60 מ מ עבור כל זן. דגירה התולעים בטמפרטורה המתאימה צמיחה (בין 15-25 ° C) במשך 3-4 ימים או עד שהצלחות מרוכז עם מספר רב של ביצים ותולעים gravid.
- לשטוף ביצים עם תולעים מהצלחות, באמצעות כ- 6 מ של מאגר M9 (ראה טבלה 1 למתכון) לכל 100 מ מ צלחת של נמטודות ולהעביר אותם עם זכוכית פיפטות פסטר לתוך צינורות בודדים 15 מ"ל צנטריפוגה עבור כל זן. ספין הצינורות האלה למטה למשך 3 דקות ב- 6,180-g ולשאוב החוצה מאגר M9, שמירה רק בגדר חיות וביצים.
- להוסיף 3-4 מ"ל של פתרון אקונומיקה (ראה טבלה 1 למתכון) כל שפופרת, לסירוגין מערבולת עבור מאגר M9 להוסיף 6 מינימלית למלא כל שפופרת, ספין-6,180 x g עבור 1 דקות, תשאף תגובת שיקוע. חזור על זה לשטוף עם M9 שלוש פעמים ולהעביר בגדר ביצה אל צינור טריים 15 מ"ל המכיל כ- 9 מ של מאגר M9.
- לסנכרן התולעים המקווקו טרי על ידי nutating ב 20 מעלות צלזיוס במשך 16 – 48 ה ספין הצינורות האלה למטה ב 6,180 g x 1.5 דקות ואני אוריד את החיות L1 מסונכרן על לוחות NGM בודדים נזרע טרי עם מדשאה של OP50 (כ 6,000 – 10,000 בעלי. חיים לכל צלחת 100 מ מ) לשמור 20 º C.
- בעלי חיים אלה מגיעים הזחל L4 לאחר ~ 42 h. בשלב זה, להעביר הזחלים L4 באמצעות איסוף פלטינה כדי OP50 נזרע NGM צלחות המכילה 0.5 מ ג / מ ל 5-פטור-2'-deoxyuridine (FUdR) כדי למנוע מהם בהפקת רומא.
הערה: ודא כי במסגרת ניסוי כל זני מסונכרנים עבור כמות דומה של זמן. FUdR טיפול sterilizes החיות ומונעת ביצה הנחת על רומא הייצור, אשר עשויה להשפיע על OCR. בעלי חיים אלה סטיריליים ינותחו למחרת (יום 1 למבוגרים בעלי חיים ב- h ~ 66) עבור וזמינותו. FUdR דווח לפגיעה פיזיולוגיה, תוחלת החיים של תולעים מוטציה מסויימת. לכן, זה צריך להילקח בחשבון כאשר התרופה משמשת עבור עיקור12,13,14. תולעים יכולים גם להיות מעוקר בכך ועשתה מוטציות כגון fem-1(hc17) או fem-3(e2006). עם זאת, מוטציות אלה העלולים להשפיע מיטוכונדריאלי פונקציה.
2. הכנת תרכובות כדי להיות מוזרק, הידרציה של הגששים
הערה: במהלך וזמינותו לרוץ, שני שיעורי נשימה הבזליים ו מקסימלי נמטודות נמדדים. נשימה מקסימלי המופעלת את החיות על התוספת של קרבוניל ציאניד-4 (trifluormethoxy) phenylhydrazone (FCCP), ionophore uncoupling זה מפריע קרום מיטוכונדריאלי פוטנציאליים ובכך סינתזת ATP על ידי הובלת פרוטונים דרך ממברנה מיטוכונדריאלי, תוך מתן אפשרות שאיבה פרוטונים, אלקטרונים תחבורה וצריכת החמצן להמשיך4,15 חשיפות של סינתזת ATP (איור 1). השלב האחרון וזמינותו מערבת התוספת של אזיד הנתרן (נאן3), מעכבת מתחמי IV ו- V בוכו ', המאפשרת לקבוע שאינו מיטוכונדריאלי נשימה16 (איור 1). ניתן לבצע את הפעולות הבאות יום לפני המרוץ assay בפועל.
- להכין מלאי פתרונות של FCCP 1 מ"ל (10 מ מ דימתיל סולפוקסיד [דימתיל סולפוקסיד]: 1000 x ריכוז הסופית assay) נאן3 (400 מ dH2o: 10 x ריכוז הסופית assay) ואת החנות ב-20 ° C.
הערה: הפעל עקומת ריכוז כדי למטב את ריכוז FCCP נדרש להפיק תגובה מקסימלי OCR עבור כל כלי וכל הגדרה מעבדה. - מימה הדיו חיישן על-ידי הוספת µL 200 של dH2O מכל קידוח (ו המאגר המקיף) בצלוחית, להבטיח כי החיישן הגששים טובע dH2O, חנות ללילה בטמפרטורת החדר.
הערה: מחסנית יכול להיות שמאל הגששים שקוע עבור עד 72 שעות, אך במקרה לחות מתמשכת, הלוחות צריכים להיות עטוף בסרט פרפין ומאוחסנים ב 4 º C. אם הידרציה לילה אינו אפשרי, כדאי hydrated הדיו חיישן במשך לפחות 4 שעות לפני וזמינותו. - לבטל את גוף החימום בממשק respirometer ולאחסן את המכשיר בתוך חממה 15 ° C ונישלח נמוך וטמפרטורת בתוך המכשיר כדי למנוע התחממות יתר במהלך וזמינותו להפעיל את החיות.
הערה: respirometer הינו מצויד עם אלמנט חימום אבל לא יכול להיות מקורר. בתוך חממה 15 ° C, respirometer יהיה על טמפרטורה יציבה בין 18 – 22 ° C, אשר הוא חום בריא לתחזוקה C. elegans .
3. סמים equilibration וטעינה של מחסנית
- פיפטה החוצה וזורקים את dH2O נהגה מימה החיישן רגשים ולהחליף אותו עם µL 200 של הפתרון calibrant (pH 7.4) כל היטב. לדלל את הפתרון FCCP מניות 100 מיקרומטר FCCP dH2O ולהוסיף 20 µL של הפתרון מדולל הזרקת ליציאה a במחסנית חיישן. הוספת µL 22 של אזיד הנתרן 400 מ ליציאה B של מיכל הדיו סניור.
- להפוך את respirometer על מסך הבית בחר התחל; תבניות העמוד יופיע. בדף ' תבניות ', בחר ריקים או תבנית מעוצבת בעבר; הדף קבוצות יופיעו. בדף ' קבוצות ', בחר הבארות A ו- H הבארות רקע והקצה הבארות 6 הנותרים לקבוצות המתאים, לפי התוכנית הניסיונית.
- ללחוץ על החץ בפינה הימנית התחתונה כדי לעבור אל הדף פרוטוקול. בדף פרוטוקול, להבטיח כי Equilibrate, התאים הבזליים , זריקות 1 ו- 2 הכפתורים שנבחרו. בדף זה, להתאים את מספר קריאות של OCR הבזליים, וכן OCR מקסימלי (לאחר ההזרקה 1 עם FCCP) ואת שאינו מיטוכונדריאלי OCR (לאחר ההזרקה 2 עם אזיד הנתרן).
הערה: כל אחת מהמידות לפניו תערובת, רגע צעד ומסגרות הזמן עבור פרמטרים אלה מוצגות בטבלה מס ' 2. - בחר על החץ בפינה הימנית התחתונה, תופיע הודעה שתדווח כדי לטעון את הצלחת מחסנית חיישן. ודא כי הצלחת מחסנית חיישן נטען בהכיוון נכון, ועקוב אחר ההוראות על המסך בקש תזכורת. Respirometer עכשיו equilibrate את מיכל הדיו.
הערה: equilibration הזה מספק מספיק זמן כדי למקם את החיות כדי להיות לבדיקה לתוך ולס המתאימות של צלחת התא.
4. הכנת צלחת התולעת ואת וזמינותו לרוץ
- להוסיף 200 µL מאגר M9 לתוך כל הבארות 8 של צלחת התא ולתוך המאגרים הבארות שמסביב.
- לבחור ~ 100 תולעים מהמאמץ כל על גבי לוחות NGM unseeded ואפשר לנוח במשך 2-3 דקות רטוב לסוף של האיסוף פלטינה עם מאגר M9 ולקחת 20 בעלי חיים גיל-מסונכרנות לתוך בארות B-G, עוזב את הבארות רקע A ו- H ריק.
הערה: לאחר טעינה אחד. ובכן, חכה כ 2 דקות כדי לאפשר את החיות להתמקם בתחתית הבארות. רצוי גם כך עקומת בתולעת מספר לפעול כדי למטב את המספר תולעת לכל טוב עבור כל כלי וכל הגדרה מעבדה. - עד עכשיו, respirometer צריכה להיות מכויל, על ידי לחיצה טוב על המסך, הצלחת המכיל מאגר כיול הוצאת ו ניתן להסיר את respirometer, ואילו מחסנית חיישן נשאר בתוך המכשיר. החלף את הצלחת calibrant לצלחת המכילה בעלי חיים. לטעון את הצלחת לסגור את הדלת על ידי להכות את המשך ומאפשרים וזמינותו לפעול.
5. ניסוי שלאחר הניתוח
- לאחר סיום המרוץ assay, ועקוב אחר ההנחיות על המסך להסרת צלחת תא חיישן מחסנית ואת להכניס כונן הבזק ליציאת ה-USB כדי לשמור את הנתונים לרוץ בתבנית של מלחמה. הסר את מיכל הדיו חיישן ולאפשר החיות לתחתית הבארות מסתפק כ 2 דק למקם את הצלחות תא מערכת סטריאו לנתח מיקרוסקופ, לספור את מספר בעלי חיים לכל טוב.
- פתח את תוכנת ניתוח במחשב, פתיחת הכרטיסיה נורמליזציה לנרמל OCR למספר בעלי חיים. החל תוויות המתאימים עבור הקבוצות השונות תחת הכרטיסייה שינוי, לייצא את הקובץ כקובץ פריזמה לצורך ניתוח נוסף.
הערה: הממוצע של המדידות חמישה, לפני התוספת של FCCP הוא OCR הבזליים, בעוד הממוצע של המדידות חמישה לאחר FCCP תוספת OCR מקסימלי לבין ממוצע המדידות האחרונות חמש (מינימום של שתי מדידות שצריך לעשות) לאחר תוספת אזיד הנתרן הוא קצב הנשימה הלא-מיטוכונדריאלי. הבדיקה יש לחזור שלוש פעמים כדי לוודא הפארמצבטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות הפרוטוקול כפי שיתואר בהמשך, OCR של חיות פראי סוג ו מוטנטים שונים sel-12 שלושה זנים היו נחושים. sel-12 מקודד את ortholog C. elegans presenilin17. מוטציות בגן presenilin האנושי הם המפגע גנטי הנפוצים ביותר הקשורים להתפתחות מחלת אלצהיימר משפחתית18. המחקרים שלנו הראו רמות סידן גבוהות מיטוכונדריאלי sel - 12 חיות לעומת חיות פראי סוג3. מאז dysregulation סידן יכול לגרום פונקציה מיטוכונדריאלי שונה3,19,20, OCR ב sel-12 מוטציה ובעלי חיים פראי סוג נמדדו לבחון את ההשפעה של מוטציות sel-12 על הפונקציה מיטוכונדריאלי ובריאות. חיות פראי סוג הראו בעקביות הבזליים OCR המחירים להלן 5 pmol/min/תולעת, בעוד כל שלושה זנים של מוטציות sel-12 הראה OCR גבוהות באופן משמעותי ~ 7 pmol/min/תולעת (איור 3 ו- 4 באיור). על התוספת של FCCP, כצפוי, הייתה עלייה OCR פראי סוג, וכן מוטציות sel-12 (איור 3 ואיור 5). חיות פראי סוג הראה OCR המרבי של ~ 7 pmol/min/תולעת, בעוד sel-12 מוטציות היו OCR ~ 10 pmol/min/תולעת (איור 5).
איור 1: סכימטי של השחקנים הראשיים מעורב נשימה תאית ואת השפעת אזיד FCCP ו נתרן. העברת אלקטרונים מ- NADH ועוד מורכבות שאני תוצאות בדור הצבע אלקטרוכימי על פני קרום מיטוכונדריאלי הפנימי פרוטונים לקבל נמרצים לעבר זה. הפרוטונים לזרום חזרה אל המטריקס מיטוכונדריאלי מן המרחב intermembrane באמצעות תוצאות מורכבות V ב- ATP סינתזה. תוספת של FCCP גורמת uncoupling של תהליך זה על ידי לשבש את פוטנציאל הממברנה מיטוכונדריאלי וע י כך סינתזת ATP, בעוד צריכת החמצן ממשיכה, ומאפשר לשקילת OCR מקסימלי. אזיד הנתרן (נאן3) הוא מעכב של מתחמי IV ו- V, ובכך לאפשר לשקילת שאינם מיטוכונדריאלי נשימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: תיאור סכמטי של שלבים המעורבים המידה של זיהוי תווים אופטי ב- C. elegans. הצעדים חמש הכרוכים הגדרת assay (שמאל) ואת פרק זמן עבור כל שלב (נכון). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: OCR מאפיין פרופיל ב- C. elegans respirometry. חמשת המקראות הראשוני להראות את הנשימה הבזליים, ואחריו חמש קריאות של מקסימלי, חמש קריאות של נשימה מיטוכונדריאלי לאחר זריקות אזיד FCCP ו נתרן, בהתאמה. קווי שגיאה מייצגים השגיאה הסטנדרטית של מדידה (SEM). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: נשימה הבזליים פראי סוג, מוטציות שונות sel-12 . ממוצע הבזליים הנשימה בבעלי חיים יום 1 למבוגרים תואם גיל wild type, sel-12 מוטציה. הנתונים נאספו מתוך שלושה assay חוזר. קווי שגיאה מייצגים SEM ו * * * מציין p < 0.0001. ערכים p חושבו באמצעות דו-זנבית t-מבחן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: נשימה מקסימלי פראי סוג, מוטציות שונות sel-12 . ממוצע מקסימלי הנשימה בבעלי חיים יום 1 למבוגרים תואם גיל wild type, sel-12 מוטציה לאחר ההזרקה FCCP. הנתונים נאספו מתוך שלושה assay חוזר. קווי שגיאה מייצגים SEM ו * * * מציין p < 0.0001. ערכים p חושבו באמצעות דו-זנבית t-מבחן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| מאגר M9 (1 ליטר) | |||
| dH2O | 1,000 מ | ||
| NaCl | 5 g | ||
| 2פו ח'4 | דור 3 | ||
| נה2HPO4 | 6 g | ||
| 1 מ' MgSO4 | 1 מ"ל * להוסיף לאחר autoclaving | ||
| פיצול בין 2 בקבוקים: 500 מ ל כל אחד. אוטוקלב במחזור נוזלי (15 דקות חשיפה) | |||
| פתרון אקונומיקה (50 מ"ל) | |||
| dH2O | 36 מ"ל | ||
| אקונומיקה | 14 מ | ||
| 10 N NaOH | 800 ΜL | ||
| לוחות מדיה צמיחה תולעים נימיות (NGM) רגיל | |||
| 1 ליטר | 0.5 L | 0.25 L | |
| NaCl | דור 3 | 1.5 גרם | 0.75 g |
| מה נשארתי-אגר | 17 גרם | 8.5 גרם | 4.25 גרם |
| מה נשארתי-peptone | 2.5 g | 1.25 גרם | 0.625 g |
| א אוטוקלב במחזור נוזלי (45 דקות חשיפה), מאפשרים מגניב ~ 60 מעלות ואז להשתמש בטכניקה סטרילי, להוסיף את הפעולות הבאות: | |||
| 1 ליטר | 0.5 L | 0.25 L | |
| CaCl 1 מ'2 | 1 מ"ל | 0.5 mL | 0.25 mL |
| 1 מ' MgSO4 | 1 מ"ל | 0.5 mL | 0.25 mL |
| 1 מ' KPO4 | 25 מ | מ"ל | 6.25 מ |
| כולסטרול 5 מ"ג/מ"ל | 1 מ"ל | 0.5 mL | 0.25 mL |
| b. מערבולת לערבב היטב לאחר כל הוספה. אחרי כל התוספות נעשים, יוצקים צלחות | |||
טבלה 1: מתכונים NGM צלחות, M9 מאגר של אקונומיקה פתרון.
| כיול | הבסיס | FCCP | אזיד הנתרן |
| יציאות: A | יציאות: B | ||
| Equilibration: כן | מיקס: 02: 00:00 | מיקס: 02: 00:00 | מיקס: 02: 00:00 |
| רגע: 00: 00:30 | רגע: 00: 00:30 | רגע: 00: 00:30 | |
| מידה: 02: 00:00 | מידה: 02: 00:00 | מידה: 02: 00:00 | |
| מחזורים: 5 | מחזורים: לפחות 5 | מחזורים: 2−5 | |
| משך: 00: 22:30 | משך: 00: 22:30 | משך: 00: 09:00 |
בטבלה 2: assay מאפיין פרמטרים ב- C. elegans respirometry.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
נשימה מיטוכונדריאלי הוא מחוון תובנה של פונקציה מיטוכונדריאלי; לכן, היכולת למדוד את שיעור צריכת החמצן במערכת הביולוגית, בין אם במבחנה או ויוו הוא חשוב מאוד. Respirometers חש רמות החמצן באמצעות חומר זרחני מבוססי פורפירין זה לקבל מתרצה באמצעות חמצן או באמצעות חיישני חמצן amperometric המסתמכים על הדור של פרופורציונלי הנוכחי חשמלי חמצן בלחץ... קלארק אלקטרודה נופל לתוך הקטגוריה השנייה, שימש בהרחבה בספרות, במיוחד במהלך ניתוח נשימה C. elegans. עם זאת, הצורך גודל דגימה גדולה וחוסר היכולת להעריך מדגם אחד או יותר בכל פעם עושה amperometric חיישני חמצן לא יעיל.
פרוטוקול זה מספק מדריך פשוט מודדים OCR ב- חיים, שלמים C. elegans ללא בידוד המיטוכונדריה, תהליך זה יכול להשפיע קרום מיטוכונדריאלי פוטנציאליים ולכן OCR. בהתחשב בכך חיות התערוכה OCR שונים בשלבים שונים של החיים, חיות בשימוש פרוטוקול זה צריך להיות גיל מסונכרנים. חיים צעירים יש OCR נמוכה יותר בהשוואה למבוגרים חיות ושחרר רמות OCR יכול שוב כמו חיות נוספות גיל3. C. elegans גם סטריליים על ידי שימוש FUdR על מנת להבטיח כי OCR הם לא מבולבל על ידי הנוכחות של רומא. עם זאת, אם חיות בגדלים שונים להיבדק, אסטרטגיות עבור נרמול צריכים להיות מופנית.
פרוטוקול זה מנצל איסוף פלטינה להעברת חיות לצלחת וזמינותו. בניגוד להעברת נוזלים של בעלי חיים, זו מניפולציה מאפשר החוקר בקפידה לבחון ולקבוע את הבריאות של בעלי החיים לפני, במהלך ההעברה. בנוסף, זה מאפשר שליטה טובה יותר של התולעת מספר ומונעת המבוא של ביצים, ולשלדים. מאז החיות חי ופעיל במהלך הריצה assay, השתנות סביר להניח נובעים בדיקה מיצוב. מבחני לכן לעשות כן, צריך להיות מינימום של שלוש פעמים חוזר על עצמו. בנוסף, כפול בדיקת ספירה חיה ניתוח פוסט חשוב עבור נרמול למספר בעלי חיים. חיסרון גדול של פרוטוקול זה הוא חוסר היכולת להשוות יותר משתי דגימות בבת אחת, מבלי להתפשר על המספר של משכפל בתוך וזמינותו יחיד. למרות מגבלה זו, פרוטוקול זה יכול להיות כלי מחקר רב עוצמה בניתוח OCR בעת השוואת שני אחרים או תנאים. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות לבחון OCR של בעלי-חיים גדל על מקורות מזון שונים, תוספי מזון או טיפולים תרופות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצה להכיר את ד ר קווין Bittman להדרכה שלו בהקמת את XFp סוסון ים במעבדה. מכוני הבריאות הלאומיים הענק ש-gm088213 נתמך עבודה זו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm, 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900, 2901 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Globe Scientific | 6285 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
| 22 × 22 mm coverslip | Globe Scientific | 1404-10 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD, Bacto | 211705 | |
| Bacto yeast extract | BD, Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Abcam | ab120081 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Deionized water (dH2O) | |||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thomas Scientific | C987Y85 | |
| Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 | |
| Seahorse XFp Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent | 103022-100 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 |
References
- Nelson, D. L., Cox, M. M. Ch. 19. Lehninger Principles of Biochemistry. Ahr, K. , W. H. Freeman and Company. 707-772 (2008).
- Marchi, S., et al. Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death. Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).
- Sarasija, S., et al. Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. eLife. 7, (2018).
- Luz, A. L., et al. Mitochondrial Morphology and Fundamental Parameters of the Mitochondrial Respiratory Chain Are Altered in Caenorhabditis elegans Strains Deficient in Mitochondrial Dynamics and Homeostasis Processes. PLoS One. 10, e0130940 (2015).
- Ryu, D., et al. Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C. elegans and increases muscle function in rodents. Nature Medicine. 22, 879-888 (2016).
- Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, 1041-1053 (2013).
- Schulz, T. J., et al. Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress. Cell Metabolism. 6, 280-293 (2007).
- Koopman, M., et al. A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 11, 1798-1816 (2016).
- Sarasija, S., Norman, K. R. Analysis of Mitochondrial Structure in the Body Wall Muscle of Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 8, (2018).
- Sarasija, S., Norman, K. R. Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein. Bio-protocol. 8, (2018).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. 47 (47), (2011).
- Aitlhadj, L., Sturzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131, 364-365 (2010).
- Rooney, J. P., et al. Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans. Experimental Gerontology. 56, 69-76 (2014).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing and Development. 132, 519-521 (2011).
- Heytler, P. G., Prichard, W. W. A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones. Biochemical and Biophysical Research Communications. 7, 272-275 (1962).
- Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).
- Levitan, D., Greenwald, I. Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer's disease gene. Nature. 377, 351-354 (1995).
- Sherrington, R., et al. Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease. Nature. 375, 754-760 (1995).
- Glancy, B., Balaban, R. S. Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics. Biochemistry. 51, 2959-2973 (2012).
- Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201, 1453-1466 (2015).
