Summary
В этом протоколе мы внедряем метод очистки дендритной филоподии богатой фракцией от фагоцитарной структуры выступа на культивированных гиппокампальных нейронах, воспользовавшись специфической и сильной близостью между дендритным филоподиалом молекула адгезии, TLCN и внеклеточная матричная молекула, витронектин.
Abstract
Дендритная филоподия тонкие и длинные выступы на основе нити актина, и они расширяются и убираются, как будто ища целевой аксон. Когда дендритная филоподия устанавливает контакт с аксоном-мишенью, они начинают созревать в шипы, что приводит к образованию синапса. Теленцефин (ТЛКН) обильно локализован в дендритной филоподии и постепенно исключается из шипов. Переэкспрессия TLCN в культивированных гиппокампальных нейронов вызывает дендритное образование филоподии. Мы показали, что теленцефин сильно связывается с внеклеточной молекулой матрицы, витронэктином. Микрошарики с покрытием витронектина индуцированные фагоцитарные чаши на нейрональных дендритов. В фагоцитической чашке, TLCN, TLCN-связывающих белков, таких как фосфорилированный эзрин/ Радисин / Моезин (фосфо-ERM), и F-актин накапливаются, что свидетельствует о том, что компоненты фагоцитарной чашки похожи на дендритный филоподия. Таким образом, мы разработали метод очистки фагоцитарной чашки вместо дендритной филоподии. Магнитные бусы полистирола были покрыты витронектином, который обильно присутствует в культуре среды гиппокампа нейронов и который вызывает формирование фагоцитарной чашки на нейрональных дендритов. После 24 ч инкубации, фагоцитарные чашки были слегка растворимы с моющим средством и собраны с помощью магнитного сепаратора. После мытья бисера, связывающие белки были eluted и проанализированы серебра окрашивания и западного blotting. В связывающей фракции, TLCN и актин были обильно присутствуют. Кроме того, многие белки, идентифицированные из фракции, были локализованы в дендритную филоподию; Таким образом, мы назвали связывающую фракцию дендритной филоподией богатой фракцией. В этой статье описаны детали относительно метода очистки для дендритной фракции, богатой филоподией.
Introduction
Дендритная филоподия считается предшественниками шипов. Актиновые нити в дендритной филоподии регулируютих расширение и опрокиды 1,2,3. После контакта с аксоном, выбранный дендритный филоподия начинает свое созревание в шипы, и синапс образуется4,5. Компоненты шипов были определены на основе всестороннегоанализа постсинаптических фракций плотности 6,7,в то время как компоненты дендритной филоподии остаются в значительной степени неизвестными. Было показано, что теленцефин (TLCN), ERM, SynGAP, Рас, PI3 киназы, Akt, mTOR, поло-как киназа 2, CaMKII, синдекан-2, паралемин-1, ARF6, и ЭфБ регулировать дендритное образование филоподии5,8,9 ,10,11, в то время как метод не был разработан для всестороннего анализа молекул, присутствующих в дендритной филоподии.
TLCN (ICAM-5) специально выражается колючими нейронами в самом ростральном сегменте мозга, теленефалионе12. TLCN имеет 9 Ig-подобных доменов в внеклеточной области, трансмембранной области, и цитоплазмический хвост13. TLCN связывается с витронектином (VN) и lfA-1 в его внеклеточной области, пресенилином в трансмембранной области, а также с фосфо-ЭРМ и А-актинином в его цитоплазменской области5,8,14,15 ,16. TLCN связывается с актином цитоскелетом через фосфо-ЭРМ на кончиках дендритной филоподии и актинина в шипах и дендритных валах8,16.
Мы показали, что переэкспрессия TLCN расширенной дендритной филоподии формирования и индуцированных реверсии шипов к филоподии10. Консилитативная активная форма эзрина связана с цитоплазменным регионом TLCN и усиленным дендритным образованием филоподия8. Таким образом, TLCN регулирует образование дендритного филоподии с помощью актиносвязных белков. Esselens et al. продемонстрировали, что микробусы индуцированные накопления TLCN на культурных нейронах17. Мы показали, что фагоцитные структуры чашки были сформированы на нейрональных дендритов вокруг VN покрытием микробусы в TLCN-зависимым образом15. Компоненты дендритной филоподии аналогичны фагоцитарной чашке. Трудно собрать дендритную филоподию, но собрать фагоцитарную чашку с помощью магнитных микробусов относительно легче. Таким образом, мы разработали метод очистки фагоцитарной чашки вместо дендритной филоподии18. Здесь мы описываем метод очищения дендритной фракции, богатой филоподией.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию RIKEN Wako.
1. Культура Гиппокампальных нейронов
- Подготовка культуры среды
- Приготовление 200-х витаминной смеси. Растворите 100 мг D-пантотеновой кислоты гемикальциевной соли, 100 мг холинового хлорида, 100 мг фолиевой кислоты, 180 мг иинозитол, 100 мг ниацинамида, 100 мг пиридоксала HCl и 100 мг тиамина HCl в 500 мл ультрачистой воды. Раствор не полностью растворяется. Тщательно перемешайте, аликот в 50 мл труб и хранить при -20 градусах Цельсия.
- Приготовление раствора рибофлавина. Растворите 100 мг рибофлавина в 500 мл ультрачистой воды с помощью магнитного мешалки. Раствор не полностью растворяется. Тщательно перемешайте, аликот в 50 мл труб и хранить при -20 градусах Цельсия.
- Приготовление 1 M CaCl2. Растворите 7,35 г CaCl22H2O в 50 мл ультрачистой воды с помощью магнитного мешалки.
- Подготовка минимальной основной среды (МЭМ). Растворите 400 мг KCl, 6800 мг NaCl, 2200 мг NaHCO3, 158 мг2PO42H2O, 7000 мг D-глюкозы и 200 мг MgSO4-7H2O в 950 мл ультрачистой воды с помощью магнитного мешалка.
- Титрат 1,8 мл 1 M CaCl2 в МЭМ в падение за падением образом с помощью 1 мл трубки с постоянным возбуждением на магнитном мешалке. Отрегулируйте рН MEM до pH 7.25 с 1 мол/л HCl.
- Добавьте в МЭМ 5 мл 200-х витаминных смесей и 200 л раствора рибофлавина. Отрегулируйте объем раствора до 1000 мл с помощью ультрачистой воды. Фильтр решение с помощью 0,22 мкм фильтр системы и хранить его при 4 градусах Цельсия.
- Подготовка 10x dNase-I фондовых решений. Растворите 100 мг DNase-I в 12,5 мл сбалансированного соляного раствора Хэнкса (HBSS), процедите фильтр 0,22 мкм, аликвот в трубках 1,5 мл и храните трубки при -20 градусов по Цельсию.
- Приготовление цитозиня-D-арабиноураганид (Ara-C) стокового раствора. Растворите 25 мг Ара-С в 8,93 мл ультрачистой воды (окончательная концентрация 10 мМ), процедите через фильтр 0,22 мкм, аликот в трубках 1,5 мл и храните при -20 градусах Цельсия
- Подготовка плаксивной среды. Смешайте 1 мл аминокислотного раствора MEM, 750 л из 1 M HEPES, 1 мл B27, 125 л глутамина 200 мм, 250 л пенициллина/стрептомицина, 2,5 мл сыворотки крупного рогатого скота (FBS) и 44,375 м м м м.
- Подготовка стоп-среды. Смешайте 1 мл аминокислотного раствора MEM, 750 л из 1 M HEPES, 5 мл FBS (окончательный 10%), и 43,25 мл МЕМ в трубке 50 мл.
- Приготовление посуды с поли-Л-лизинпокрытием
- Пальто 35 мм пластиковых клеточных культур блюд с 0,2 мг/мл поли-L-лизина гидробромид в течение 1 дня при 25 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поли-L-лизина не следует использовать вместо поли-L-лизина гидробромида. - Вымойте посуду с 2 мл ультрачистой воды 3 раза. Инкубировать блюда с 1,5 мл стоп-среды при 25 градусах Цельсия до использования.
- Пальто 35 мм пластиковых клеточных культур блюд с 0,2 мг/мл поли-L-лизина гидробромид в течение 1 дня при 25 градусах Цельсия.
- Рассечение гиппокампа нейронов из эмбриона мыши
- Ткань источник гиппокампа нейронов. Вскрыть гиппокампа от дикого типа и TLCN-дефицит C57BL6/J мышей на эмбриональных дней 16-17 в соответствии с методом Лу и др.19.
- Инкубировать расчлененные гиппокампа в 0,25% трипсина и 1x DNaseI в HBSS, содержащий 15 мМ HEPES, рН 7.2 на 15 мин при 37 градусов с возбуждением каждые 3 мин. Удалить раствор. Инкубировать гиппокампа в 10 мл STOP средних инактивировать трипсин при 4 кв КС в течение 5 минут.
- Переместите гиппокампа в 10 мл свежей среды STOP и инкубировать на 4 КК в течение 5 мин. Переместить гиппокампа в 10 мл свежей среды STOP и инкубировать на 4 кв. C в течение еще 5 мин. Перемещение бегемота в 900 л STOP среднего и 100 л 10x DNaseI в 15 мЛ трубка. Диссоциатив гиппокампа в изолированных нейронов путем pipetting 20 раз с помощью 1 мл пипетка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кончик трубы 1 мл слегка касается нижней части трубки 15 мл во время диссоциации гиппокампа. - Добавьте 9 мл покрытия среднего, и фильтр через 70 мкм ячейки ситечко в 50 мл трубки. Подсчитайте количество клеток с помощью гемоситометра и отрегулируйте до 3,5 х 104 ячеек/мл в среде покрытия.
- Аспир СТОП-среда из посуды с поли-Л-лизинпокрытием. Плита клетки на поли-L-лизин покрытием блюда на 7 х 104 ячейки / блюдо (2 мл/ блюдо).
- После 60-64 ч инкубации под 5% CO2 при 37 градусах По Цельсию добавьте 2 qL бульонного раствора Ara-C (окончательный 10 мкм) к нейронам и медленно встряхните блюдо. Храните культурные блюда в увлажненной коробке, не меняя культурную среду под 5% CO2 при 37 градусах Цельсия.
2. Очищение дендритных Филоподия богатых Фракция
- После 13 дней in vitro (DIV) добавьте магнитные полистиролные микробусы (3 х 106 частиц/блюдо) к 20 блюдам, содержащим культивированные нейроны. После 1 дня, мыть нейроны в 1 мл PBS с возбуждением 3 раза, чтобы удалить средних и несвязанных микробусов. После удаления PBS, лисизировать нейроны с 500 Л /блюдо из буфера лиза (PBS, содержащий 0,01% Тритон X-100, EDTA-бесплатный коктейль ингибитор протеазы, и фосфатазный ингибитор коктейль).
- Соберите лизат с помощью клеточного скребока и переместите лизат в низкобелковые микротрубки (10 труб). Установите трубки на магнитный сепаратор и ждите 1 мин. Соберите супернатант и используйте его в качестве несвязанной фракции для окрашивания серебра и анализа западной подрезки.
- Перенесите бусины в новую низкобелково-связывающую микротрубку, установленную на магнитном сепараторе, и полностью удалите супернатант. Добавьте 500 кл. буфера лисиса и промойте бисер с помощью вихревого смесителя на 15 с. Установите трубку на магнитный сепаратор, подождите 1 минуту, удалите супернатант и добавьте 500 л буфера лисиса. Повторите мытье бисера 10 раз и удалить супернатант.
- Elute белки связаны с бисером (связанная фракция) путем добавления 50 qL 1x SDS образец буфера (62,5 мм Tris HCl, рН 6,8, 2,5% SDS, и 10% глицерола) и варить трубку при 98 КС в течение 5 мин. Centrifuge трубки на 860 х г для 10 s набор на магнитном сепараторе в течение 1 мин. Соберите супернатант и используйте его в качестве связанной фракции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. - Измерьте концентрации белка несвязанных и связанных фракций по анализу белка BCA. Визуализируйте белковые растворы с голубым бромофенолом и отрегулируйте концентрацию до 5 нг/Л для SDS-PAGE.
3. Серебряное окрашивание и западный анализ пятна
- Разделите связанные и несвязанные фракции (50 нг) sDS-PAGE с помощью 5-20% градиентного геля. Серебряно-пятно гель.
- Западная подьеносец с использованием анти-TLCN-C (1/3,000), анти-бывина витронектин (1/5,000), анти-актин (1/1,000), и анти-я-тубулин (1/1,000) в качестве первичных антител и HRP-конъюгированный козаig IgG (1/5,000). Визуализируйте антигены с помощью хемилюминесцентного западного реагента обнаружения blotting и хемилюминесценции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В культивированных гиппокампе нейронов, TLCN был обильно локализован дендритной филоподии, вала, и сома и colocalized с F-актин(Рисунок 1A, B). Когда полистирол микробусы были добавлены в культивированные гиппокампа нейронов, бисер были автоматически покрыты витронектин (VN) полученных из сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) в культуре среды; они были в основном связаны с дендритами, и они индуцировали образование фагоцитических чашек(рисунок 1B-E). Фагоцитарные чашки были основаны на листообразных нитях актина вокруг микробусов на дендритах. TLCN, фосфо-ERM, и PI (4,5)P2, которые являются маркерами для дендритной филоподии, высоко накапливаются вокруг бисера (Рисунок 1D)8,15. Фагоцитарные чашки были сформированы только на нейронах гиппокампа дикого типа, но не на TLCN-дефицитных гиппокампальных нейронов(Рисунок 2A-D). Таким образом, формирование фагоцитической чашки в решающей степени зависело от присутствия TLCN в дендритах.
Компоненты дендритной филоподии оказались похожими на фагоцитарные чашки. Далее мы очищали фагоцитарные чашки вместо дендритной филоподии. Протокол для очищения фагоцитных чашек схематично показан на рисунке 3. Магнитные микробусы были добавлены в дикие культивированные гиппокампа нейронов, который индуцирует формирование фагоцитических структур чашки. Структуры фагоцититарной чашки были лисицированы слабым моющим средством. Микробусы были собраны после лисиса с помощью магнитного сепаратора. После мытья бисера их связывающие белки варились и удалялись в буфере образца СДС.
Количество белков в связанной и несвязанной фракции измерялось с помощью набора анализов белков BCA. Такое же количество белков в несвязанных и связанных фракциях было разделено SDS-PAGE и окрашено серебристым окрашиванием(рисунок 4A). Образцы белковых полос были почти одинаковыми для несвязанных и связанных фракций, но интенсивность на 50 и 70 кДа в связанной фракции была ниже, чем в несвязанной фракции. Тем не менее, интенсивность полосы, очевидно, не отличалась между несвязанными и связанными фракциями, подготовленными из нейронов гиппокампа, недостающих tLCN-недостаточной культуры. Для подтверждения очищения фагоцитных структур чашки, мы выполнили западное blotting с использованием анти-TLCN-C, анти-бывина витронектин, анти-актин, и анти--тубулин(рисунок 4B). TLCN и VN были в основном обнаружены в связанной фракции. Актин, эзрин, Гюк, ПЛКЗ1, MAP-2 и спектрин были обнаружены как в связанных, так и в несвязанных фракциях. Моезин, PSD-95, З-актинин и з-тубулин были обнаружены в несвязанной фракции.
Рисунок 1: Локализация TLCN и F-актина в дендритной филоподии и фагоцитических чашках. (A) Иммунофлуоресценция окрашивание дендритов культивированного гиппокампа нейронов, выражающих gapVenus с анти-GFP антитела (синий в сливом изображении), анти-TLCN антитела (красный в объединенном изображении), и фаллоидин (зеленый в объединенном изображении). TLCN и F-актин обильно наблюдаются в дендритной филоподии. (B, C) Формирование фагоцитических структур чашки на нейрональных дендритов. Флуоресцентные микробусы (синие в объединенных изображениях B, C) добавленные к культивированным гиппокампам нейроны прочно придерживаются дендритов и вызывают накопление TLCN (красный цвет в объединенных изображениях B, C) и F-актина (зеленый в объединенных изображениях B, C). (D) Боковой вид дендритной фагоцитовой чашки, реконструированные из конфокальных изображений показывает TLCN (красный в слитых изображениях D) окружающих флуоресцентный бисер (синий в слитых изображений D). (E) Дендритный фагоцитов чашка индуцируется магнитной микробидой прилагается на нейрональный дендрит и иммуноокрашенные анти-VN антитела (синий в слитых изображений E), анти-TLCN антитела (красный в слитых изображений E), и фаллоидин (зеленый в слитых изображений E) Шкала баров 1 мкм в (D); 2 мкм в (A), (C) и (E); и 20 мкм в (B). Эта цифра была изменена по сравнению с предыдущим исследованием18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: TLCN-зависимое образование фагоцитарной чашеобразной структуры. (A-D) Тройное флуоресценции изображений дикого типа (WT; A, C) и TLCN-дефицит (KO; C, D) нейроны, обработанные флуоресцентными бусинами С.Н. (красные в объединенных изображениях A, B, C, D) и помеченные анти-TLCN антителами (зеленые в объединенных изображениях A, B, C, D) и антифосфо-ERM антитела (синие в слитых изображениях A, B) или Alexa488-phalloid изображения C, D). Шкала баров 5 мкм. Эта цифра была изменена по сравнению с предыдущим исследованием15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Схематическая диаграмма, иллюстрирующая процедуру очищения дендритной фракции, богатой филоподией. Магнитные микробусы были добавлены на культивированные гиппокампа нейронов, чтобы вызвать образование дендритных фагоцитных чашек. После 1 дня инкубации, нейроны были растворимы с лисис буфер, содержащий 0,01% Тритон X-100. Бусы были отделены от несвязанной фракции с помощью магнитного сепаратора. После мытья, связанные белки были eluted с sDS образец буфера и используется в качестве связанной фракции. Красный: VN, зеленый: TLCN, другие цвета: связанные белки. Эта цифра была изменена по сравнению с предыдущим исследованием18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Подтверждение фракции фагоцитовой чашки. (A) Серебряное окрашивание белков в несвязанных и связанных фракциях микробусов. Такое же количество (50 нг) белков в несвязанных и связанных фракциях, очищенных от дикого типа (WT) и TLCN-дефицитных (TLCN KO) гиппокампальных нейронов были разделены SDS-PAGE и визуализированы с серебряным окрашиванием. (B) Западный анализ поделок несвязанных и связанных фракций. Такое же количество (50 нг) белков были разделены SDS-PAGE и подвергнуты западному анализу помок с использованием анти-TLCN, анти-VN, анти-актина, анти-эзрина, анти-мозина, анти-Гзк, анти-ПЛКЗ1, анти-MAP-2, анти-спектрин, анти-PSD-95, анти-Анти-Анти-Анти-Анти-Анти-Анти-Анти-Анти-анти-акт, анти-к-тубулин антител. Обратите внимание, что TLCN, VN, актин, эзрин, ПЛКЗ1, MAP-2 и спектрин наблюдаются в дендритной фракции, богатой филоподией. Эта цифра была изменена по сравнению с предыдущим исследованием18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы разработали метод очистки дендритной фракции, богатой филоподией, используя сродство между молекулой клеточной адгезии TLCN и внеклеточным матричным белками vitronectin. По сравнению с фракцией PSD, можно было бы определить синаптические белки, действующие на незрелый синапс из дендритной фракции, богатой филоподией. Таким образом, составы дендритной фракции, богатой филоподией, отличаются от составляющих фракции PSD на 74%. В отличие от фракции PSD, мы использовали культивированные гиппокампа нейронов активно формировать фагоцитические чашки, и клетки должны быть живы. Для формирования фагоцитарной чашки мы использовали взаимодействие между TLCN и витронектин. Выражение TLCN ограничено в теленцефалоне. Таким образом, мы не можем использовать культурные нейроны, полученные из мозжечка. Однако, если мы покрываем бусины различными белками, этот зависимый от активности метод очистки может быть применен к мозжечковым нейронам. Например, когда N-терминальный домен глутамата рецептора дельта2-покрытые микробусы применяются к мозжечковым гранулным клеткам, пресинаптик нейрексина и cbln1 были определены из связывающих белков. Таким образом, этот зависящий от активности метод может быть использован, если белки покрытия изменены. Так как доступ микрошариков с витронектиновым покрытием ограничен ломтиками мозга и мозговой ткани, фагоцитарные чашки не формируются эффективно. Таким образом, будущие задачи включают разработку метода очистки дендритной филоподии богатой фракцией из среза мозга и ткани.
В этом протоколе, низкая плотность культуры состояние используется для гиппокампа нейронов, и рост глиальных клеток тормозится добавлением Ara-C10,20,21. Гиппокампальные нейроны культивируются в MEM, подготовленных нами, но не в нейробазальной среде, которая широко используется для культуры гиппокампа нейронов. Гиппокампальные нейроны часто умирают 14 DIV, когда культивируется на нейробазальной среде, что указывает на то, что нейробазальная среда не подходит для нашего состояния культуры низкой плотности. Кроме того, важным аспектом культуры низкой плотности является покрытие блюда поли-Л-лизином гидробромида, который нельзя заменить поли-L-лизином.
Для получения достаточного количества белков из дендритной филоподии богатых фракции, количество гиппокампа нейронов и магнитных микробусов являются важными факторами. Для иммуно-дендритной филоподии гиппокампа нейроны были покрыты на 35 мм блюдо на 5,6 х х 104 клетки / блюдо, в то время как нейроны были покрыты на 7,0 х 104 клетки / блюдо для очистки дендритной филоподии богатых фракции. На 14 DIV, почти нет гиппокампа нейронов перекрывается на 5,6 х 104 клетки / блюдо для иммуно-стирок, в то время как многие из гиппокампа нейронов частично перекрывается с другими нейронами на 7,0 х 104 клетки / блюдо для очистки дендритных филоподия богатых Фракция. Тем не менее, дендритная филоподия обильно присутствовала на обеих плотности гиппокампа нейронов. Культуры высокой плотности гиппокампа нейронов часто созревают быстрее, чем низкой плотности культивированных нейронов гиппокампа; таким образом, корректировка плотности гиппокампа нейронов с низкой плотностью культуры является необходимым для получения дендритных филоподия богатых фракции. Микробусы были добавлены в 1 х 106 микробусы / блюдо для иммуно-стирок и в 3 х 106 микробусы / блюдо для очистки дендритной филоподии богатых фракции. Для очищения фракции, как только достаточное количество шариков было добавлено, несвязанные бусы были вымыты из гиппокампа нейронов.
В этом протоколе, microbeads были автоматически покрыты VN, который присутствует в среде культуры. Тем не менее, микробусы могут быть покрыты рекомбинантными VN и добавлены к гиппокампа нейронов. Поскольку VN является очень липким белком, микрошарики с покрытием VN легко образуют агрегаты. Таким образом, VN покрытием microbeads sonicated и пипсовые, чтобы отделить друг от друга как раз перед добавлением к гиппокампа нейронов.
Ранее мы показали, что VN покрытием микробусы индуцирует фосфор-ERM, PI (4,5)P2, и F-актин вместе с TLCN накопления15. Когда дендритная фракция, богатая филоподией, была проанализирована западным излобителем, фосфо-ЭРМ не был обнаружен антифосфо-ЭРМ-поликлональными антителами и слегка обнаружен антиизрином и анти-мозезинскими моноклональными антителами. Похоже, что чувствительность моноклональных антител была выше, чем антифосфо-ЭРМ поликлональных антител. Кроме того, белки ERM были локализованы почти во всех регионах гиппокампа нейронов, но фосфо-ERM белки были локализованы только на кончике дендритной филоподии и фагоцитарной чашки. Считается, что количество фосфо-ЭРМ, связывающего сят-р ЦОДН, ограничено по сравнению с количеством нефосфорилированного ЭРМ. Таким образом, обнаружение фосфо-ЭРМ в дендритной фракции, богатой филоподией, представляется сложным.
Чтобы отделить микробусы от клеточной мембраны, мы использовали слабое моющее средство, 0,01% Triton X-100. TLCN связан с актина нити через фосфо-ERM в дендритной филоподии и фагоцитарной структуры чашки. Для очистки белков, косвенно связанных с TLCN через актиновый нить, мы использовали слабое моющее средство в этом протоколе. Однако концентрация Triton X-100 может быть изменена на более высокую концентрацию в зависимости от цели эксперимента.
Esselens et al. показали, что фагоцитарное поглощение микробусов индуцированного TLCN, PIP2и накопления F-актина в культивированных гиппокампальных нейронах17. Согласно нашему анализу с помощью конфокальной микроскопии после 24 ч инкубации с микробусами, микробусы не были полностью приняты в цитоплазму. TLCN и PIP2, которые локализованы в клеточной мембране, были локализованы вокруг бисера, особенно на дне микробусов. Кроме того, 319 белков, выявленных из дендритной фракции, богатой филоподией, были проанализированы с помощью анализа путей KEGG. Фагоцитоз и аутофагия пути не были обнаружены, но цитоскелет организации, экзоцитоз, актин-нить на основе процесса, и микротубулы на основе процесса были значительно обогащены в фракции18.
Молекулярный механизм формирования дендритного филоподии остается в значительной степени неизвестным. Анализ структуры фагоцитической чашки может помочь понять молекулярные компоненты и динамические функции дендритной филоподии. Было бы интересно проанализировать дендритные филоподия богатые фракции, подготовленные из мышиных моделей нейроразвития и нейропсихиатрических расстройств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Сигэо Окабе и Хитоми Мацуно за культуру низкой плотности гиппокампа нейронов, Масаёси Мишина за несовершенных мышей TLCN, Сатико Мицуи и Момоко Сиодзаки за техническую помощь, а также членов лаборатории Yoshihara для полезных обсуждений . Эта работа была поддержана JSPS KAKENHI Грант Нос. JP20700307, JP22700354, а также JP24500392 и MEXT KAKENHI Грант Нос. JP23123525 до YF и JP20022046, JP18H04683 и JP18H05146 до YY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 1.7 mLl Low Binding MCT | Sorenson BioScience | 39640T | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 2530149 | |
| 35 mm plastic cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| Anti-actin | Sigma-Aldrich | A-5060 | |
| Anti-alpha-Actinin | Sigma-Aldrich | A-5044 | |
| Anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T-9026 | |
| Anti-Ezrin | Sigma-Aldrich | clone3C12, SAB4200806 | |
| Anti-Galphaq | Santacruz | sc-393 | |
| Anti-MAP2 | Chemicon | clone AP20, MAB3418 | |
| Anti-Moesin | Sigma-Aldrich | clone 38/87, M7060 | |
| Anti-PLCbeta1 | Santacuz | sc-5291 | |
| Anti-PSD95 | MA2 | ABR | |
| Anti-Spectrin beta | Chemicon | MAB1622 | |
| B27 | Gibco | 0080085SA | |
| BCA protein assay kit | Thermo | 23227 | |
| Bromophenol blue | Merck | 1.08122.0005 | |
| Calcium chrolide, hydrous | Wako | 038-19735 | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Choline chloride | Sigma-Aldrich | C7527 | |
| Complete EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C-6645 | |
| DNase-I | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P5155 | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo | 12321D | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
| e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel | ATTO | E-T520L | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| HRP-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| i-Inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | |
| LAS-1000 mini | Fuji Film | LAS-1000 mini | For detection of luminescence from WB membrane |
| Magnetic polystyrene microbeads | Sperotech | PM-20-10 | |
| MEM amino acid solution | Gibco | 11130-051 | 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine |
| Mini-slab size electrophoresis system | ATTO | AE-6530 | |
| Niacinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Penicilin / Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 4906845001 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Nacali | 28360-14 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P6155 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R9504 | |
| Silver Stain 2 Kit wako | Wako | 291-5031 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T1270 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 1703940JA | |
| Ultra pure water | MilliQ | For production of ultra pure water |
References
- Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1. Journal of Neuroscience. 18 (21), 8900-8911 (1998).
- Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia. Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).
- Ziv, N. E., Smith, S. J. Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation. Neuron. 17 (1), 91-102 (1996).
- Lohmann, C., Bonhoeffer, T. A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia. Neuron. 59 (2), 253-260 (2008).
- Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Current Opinion in Neurobiology. 19 (2), 146-153 (2009).
- Bayes, A., et al. Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins. PLoS One. 7 (10), e46683 (2012).
- Bayes, A., et al. Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density. Nature Neuroscience. 14 (1), 19-21 (2011).
- Furutani, Y., et al. Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation. Journal of Neuroscience. 27 (33), 8866-8876 (2007).
- Mao, Y. T., et al. Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase. Neuron. 98 (4), 767-782 (2018).
- Matsuno, H., et al. Telencephalin slows spine maturation. Journal of Neuroscience. 26 (6), 1776-1786 (2006).
- Raemaekers, T., et al. ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation. The EMBO Journal. 31 (15), 3252-3269 (2012).
- Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (11), 3921-3925 (1987).
- Yoshihara, Y., Mori, K. Telencephalin: a neuronal area code molecule? Neuroscience Research. 21 (2), 119-124 (1994).
- Annaert, W. G., et al. Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins. Neuron. 32 (4), 579-589 (2001).
- Furutani, Y., et al. Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin. Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 39041-39049 (2012).
- Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth. Journal of Cell Biology. 119 (Pt 15), 3057-3066 (2006).
- Esselens, C., et al. Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway. Journal of Cell Biology. 166 (7), 1041-1054 (2004).
- Furutani, Y., Yoshihara, Y. Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27 (2018).
- Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).
- Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit. The Journal of Neuroscience. 19 (18), 7781-7792 (1999).
- Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture. European Journal of Neuroscience. 10 (6), 2192-2198 (1998).
