Summary
En este protocolo, introducimos un método para purificar la fracción dendrítica rica en filopodia a partir de la estructura de protrusión phagocítica similar a la copa en las neuronas del hipocampo cultivadas aprovechando la afinidad específica y fuerte entre un filopodial dendrítico molécula de adhesión, TLCN, y una molécula de matriz extracelular, vitroctina.
Abstract
La filopodia dendrítica son protuberancias delgadas y largas basadas en el filamento de actina, y se extienden y se retraen como si buscaran un axón objetivo. Cuando la filopodia dendrítica establece contacto con un axón objetivo, comienzan a madurar en espinas, lo que conduce a la formación de una sinapsis. La telencefalina (TLCN) se localiza abundantemente en filopodia dendrítica y se excluye gradualmente de las espinas. La sobreexpresión de TLCN en neuronas hipocampales cultivadas induce la formación de filopodia dendrítica. Mostramos que la telencefalia se une fuertemente a una molécula de matriz extracelular, vitronectina. Microperlas de Vitronectina inducida por la formación de copas fagocíticas en dendritas neuronales. En la copa fagocítica, se acumulan TLCN, proteínas de unión a TLCN como Ezrin/Radixin/Moesin(phospho-ERM) foso-ERM, y F-actina, lo que sugiere que los componentes de la copa fagocítica son similares a los de la filopodia dendrítica. Por lo tanto, desarrollamos un método para purificar la copa fagocítica en lugar de filopodia dendrítica. Las perlas de poliestireno magnético fueron recubiertas con vitronectina, que está abundantemente presente en el medio de cultivo de las neuronas del hipocampo y que induce la formación de copas fagocíticas en dendritas neuronales. Después de 24 horas de incubación, las copas fagocíticas fueron ligeramente solubilizadas con detergente y recogidas con un separador de imán. Después de lavar las cuentas, las proteínas de unión fueron eluidas y analizadas por la tinción de plata y la hincha occidental. En la fracción de unión, TLCN y actina estaban abundantemente presentes. Además, muchas proteínas identificadas a partir de la fracción fueron localizadas a la filopodia dendrítica; por lo tanto, nombramos la fracción de unión como la fracción dendrítica rica en filopodia. Este artículo describe los detalles sobre el método de purificación para la fracción dendrítica rica en filopodia.
Introduction
Filopodia dendrítica se cree que son precursores de las espinas. Los filamentos de actina en la filopodia dendrítica regulan su extensión y retracción1,2,3. Después de entrar en contacto con un axón, la filopodia dendrítica seleccionada comienza su maduración en espinas, y se forma una sinapsis4,5. Los componentes de las espinas se han determinado a partir de un análisis exhaustivo de las fracciones de densidad postsináptica6,7, mientras que los componentes de la filopodia dendrítica siguen siendo en gran medida desconocidos. Se ha demostrado que la telencefalina (TLCN), ERM, SynGAP, Ras, PI3 quinasa, Akt, mTOR, polo-como quinasa 2, CaMKII, syndecan-2, paralemin-1, ARF6, y EphB regulan la formación de filopodia dendrítica5,8,9 ,10,11, mientras que no se ha desarrollado un método para el análisis integral de moléculas presentes en la filopodia dendrítica.
TLCN (ICAM-5) se expresa específicamente por las neuronas espinosas en el segmento cerebral más rostral, el telencéfalo12. TLCN tiene 9 dominios similares a Ig en su región extracelular, una región transmembrana y una cola citoplasmática13. EL TLCN se une a vitronectina (VN) y a la integrina LFA-1 en su región extracelular, a la presenilinicina ensu región transmembrana, y a la fosfo-ERM y a la actina en su región citoplasmática 5,8,14,15 ,16. El TLCN se une al citoesqueleto de actina a través de fosfo-ERM en las puntas de filopodia dendrítica y de actinina en espinas y ejes dendríticos8,16.
Mostramos que la sobreexpresión de TLCN mejoró la formación de filopodia dendrítica e indujo la reversión de las espinas a la filopodia10. La forma activa constitutiva de ezrin ligada a la región citoplasmática TLCN y la formación de filopodia dendrítica mejorada8. Por lo tanto, TLCN regula la formación de filopodia dendrítica a través de proteínas de unión a la actina. Esselens y otros demostraron que las microperlas indujeron la acumulación de TLCN en las neuronas cultivadas17. Mostramos que las estructuras de copa shagocíticas se formaron sobre dendritas neuronales alrededor de microperlas recubiertas de VN de una manera dependiente del TLCN15. Los componentes de la filopodia dendrítica son similares a los de la copa fagocítica. Es difícil recoger filopodia dendrítica, pero es relativamente más fácil recoger la copa fagocítica usando microperlas magnéticas. Así, desarrollamos un método para purificar la copa fagocítica en lugar de la filopodia dendrítica18. Aquí, describimos el método de purificación para la fracción dendrítica rica en filopodia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de RIKEN Wako.
1. Cultura de las neuronas del hipocampo
- Preparación del medio de cultivo
- Preparación de la mezcla de vitamina 200x. Disolver 100 mg de sal hemicalcio ácido D-pantoténico, 100 mg de cloruro de colina, 100 mg de ácido fólico, 180 mg de i-inositol, 100 mg de niacinamida, 100 mg de pyridoxal HCl, y 100 mg de tiamina HCl en 500 ml de agua ultrapura utilizando un agitador magnético. La solución no está completamente disuelta. Mezclar cuidadosamente, alícuota en tubos de 50 ml y almacenar a -20 oC.
- Preparación de la solución de Riboflavina. Disolver 100 mg de Riboflavina en 500 ml de agua ultrapura utilizando un agitador magnético. La solución no está completamente disuelta. Mezclar cuidadosamente, alícuota en tubos de 50 ml y almacenar a -20 oC.
- Preparación de 1 M CaCl2. Disolver 7,35 g de CaCl2x 2Hen50 ml de agua ultrapura utilizando un agitador magnético.
- Preparación del medio esencial mínimo (MEM). Disolver 400 mg de KCl, 6800 mg de NaCl, 2.200 mg de NaHCO3, 158 mg de NaH2PO4x 2H2O, 7000 mg de D-glucosa y 200 mg de MgSO4-7H2O en 950 ml de agua ultrapura utilizando un agitador magnético.
- Valorar 1,8 ml de 1 M CaCl2 al MEM de una manera gota a gota utilizando un pipeta de 1 ml con una agitación constante en un agitador magnético. Ajuste el pH del MEM a pH 7,25 con 1 mol/L HCl.
- Añadir 5 ml de 200x de mezcla de vitaminas y 200 ml de solución de riboflavina al MEM. Ajuste el volumen de la solución a 1.000 ml con agua ultrapura. Filtrar la solución utilizando un sistema de filtro de 0,22 m y almacenarla a 4 oC.
- Preparación de 10 soluciones de stock DNase-I. Disolver 100 mg de DNase-I en 12,5 ml de la solución salequilibrada de Hanks (HBSS), filtrar a través de un filtro de 0,22 m, alícuota en tubos de 1,5 ml y almacenar los tubos a -20 oC.
- Preparación de la solución de stock de citosina-D-arabinofuranoside (Ara-C). Disolver 25 mg de Ara-C en 8,93 ml de agua ultrapura (concentración final de 10 mM), filtrar a través de un filtro de 0,22 m, alícuota en tubos de 1,5 ml y almacenar a -20 oC
- Preparación del medio de chapado. Mezclar 1 ml de solución de aminoácidoME, 750 ml de 1 M HEPES, 1 mL de B27, 125 ml de glutamina de 200 ml, 250 ml de penicilina/estreptomicina, 2,5 ml de suero bovino fetal (FBS) y 44,375 ml de MEM en un tubo de 50 ml.
- Preparación del medio Stop. Mezclar 1 ml de solución de aminoácidos MEM, 750 ml de 1 M HEPES, 5 mL de FBS (final 10%), y 43,25 ml de MEM en un tubo de 50 ml.
- Preparación de platos recubiertos de poli-L-lisina
- Recubrir platos de cultivo de células de plástico de 35 mm con 0,2 mg/ml de hidrobromuro de polillisina durante 1 día a 25 oC.
NOTA: Poli-L-lisina no debe utilizarse en lugar de poli-L-lisina hidrobromida. - Lavar los platos con 2 ml de agua ultrapura 3 veces. Incubar los platos con 1,5 ml de medio Stop a 25oC hasta su uso.
- Recubrir platos de cultivo de células de plástico de 35 mm con 0,2 mg/ml de hidrobromuro de polillisina durante 1 día a 25 oC.
- Disección de neuronas hipocampales a partir de embrión de ratón
- Fuente de tejido de las neuronas del hipocampo. Diseccionar el hipocampo de ratones C57BL6/J de tipo salvaje y deficiente en TLCN en los días embrionarios 16-17 según el método de Lu et al.19.
- Incubar hipocampo diseccionado en 0.25% trypsin y 1x DNaseI en HBSS que contiene 15 mM HEPES, pH 7.2 para 15 min a 37 oC con agitación cada 3 min. Retire la solución. Incubar el hipopótamo en 10 mL de medio STOP para inactivar la trippsina a 4oC durante 5 min.
- Mover el hipocampo a 10 mL de medio STOP fresco e incubar a 4 oC durante 5 min. Mover el hipocampo en 10 mL de medio STOP fresco e incubar a 4 oC durante otros 5 min. Mover el hipocampo en 900 éL de medio STOP y 100 oL de 10x DNaseI en un 15 min. tubo mL. Disociar el hipocampo en neuronas aisladas pipeteando 20 veces usando una pipeta de 1 ml.
NOTA: La punta del pipeteo de 1 ml toca ligeramente la parte inferior del tubo de 15 ml durante la disociación del hipocampo. - Agregue 9 ml de medio de chapado y filtre a través de un colador de células de 70 m en un tubo de 50 ml. Cuente el número de células usando un hemocitómetro y ajuste a 3.5 x 104 células/ml en el medio de chapado.
- Aspirar STOP medio de platos recubiertos de poli-L-lisina. Placar las células en platos recubiertos de poli-L-lisina a 7 x 104 células / plato (2 mL / plato).
- Después de 60-64 h de incubación por debajo del 5% de CO2 a 37 oC, añadir 2 seres de ara-C (final 10 m) a las neuronas, y agitar el plato lentamente. Mantener los platos de cultivo en una caja humidificada sin cambiar el medio de cultivo por debajo del 5% deCO2 a 37oC.
2. Purificación de la fracción defípoda dendrítica rica en filopodia
- Después de 13 días in vitro (DIV), añadir microperlas de poliestireno magnético (3 x 106 partículas / plato) a 20 platos que contienen las neuronas cultivadas. Después de 1 día, lavar las neuronas en 1 ml de PBS con agitación 3 veces para eliminar los microperlas medianas y no unidas. Después de eliminar el PBS, lise las neuronas con 500 l /plato de tampón de lisis (PBS que contiene 0.01% Triton X-100, cóctel inhibidor de proteasa libre de EDTA, y cóctel inhibidor de fosfatasa).
- Recoger el lisado con un rascador celular y mover el lisado a microtubos de baja unión a proteínas (10 tubos). Ajuste los tubos en un separador de imán y espere 1 min. Recoger el sobrenadante y utilizarlo como la fracción sin ataduras para la tinción de plata y el análisis de manchas occidentales.
- Transfiera las perlas a un nuevo microtubo de unión a proteínas, se ajuste a un separador magnético y retire por completo el sobrenadante. Añadir 500 l de tampón de lisis y lavar las perlas con un mezclador de vórtice durante 15 s. Ajuste el tubo en un separador de imán, espere 1 min, retire el sobrenadante y agregue 500 ml de tampón de lisis. Repita el lavado de las perlas 10 veces y retire el sobrenadante.
- Elute las proteínas unidas a las perlas (la fracción enlazada) por la adición de 50 l de 1 tampón de muestra de SDS (62,5 mM Tris HCl, pH 6,8, 2,5% SDS y 10% de glicerol) y hervir el tubo a 98 oC durante 5 min. Centrifugar el tubo a 860 x g durante 10 s y establecer el tubo de tubo en un separador magnético durante 1 min. Recoger el sobrenadante y utilizarlo como fracción enlazada.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. - Mida las concentraciones proteicas de las fracciones no consolidadas y enlazadas por el ensayo de proteína BCA. Visualice las soluciones proteicas con azul bromofenol y ajuste la concentración a 5 ng/L para SDS-PAGE.
3. Tinción de Plata y Análisis de Manchas Occidentales
- Separe las fracciones enlazadas y no enlazadas (50 ng) por SDS-PAGE utilizando un gel degradado de 5-20%. Mancha de plata el gel.
- Blot occidental usando anti-TLCN-C (1/3,000), vitronectina antibovina (1/5,000), anti-actina (1/1,000) y anti-a-tubulina (1/1.000) como anticuerpos primarios y IgG de cabra conjugado en HRP (1/5,000) como anticuerpo secundario. Visualice los antígenos utilizando el reactivo de detección de manchas occidentales quimioluminiscentes y un imager de quimioluminiscencia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En las neuronas del hipocampo cultivadas, el TLCN fue localizado abundantemente a la filopodia dendrítica, el eje y el soma y colocalizó con F-actina (Figura1A,B). Cuando se añadieron microperlas de poliestireno a las neuronas del hipocampo cultivadas, las cuentas fueron recubiertas automáticamente con vitronectina (VN) derivada del suero bovino fetal (FBS) en el medio de cultivo; estaban destinados principalmente a dendritas, e indujeron la formación de copas fagocíticas (Figura1B-E). Las copas fagocíticas se basaban en filamentos de actina en forma de hoja alrededor de microperlas en dendritas. TLCN, fosfo-ERM y PI(4,5)P2, que son marcadores de filopodia dendrítica, están altamente acumulados alrededor de perlas (Figura1D)8,15. Las copas fagocíticas sólo se formaron en neuronas hipocampales de tipo salvaje, pero no en neuronas hipocampales deficientes en TLCN (Figura2A-D). Por lo tanto, la formación de copa shagocítica dependía crucialmente de la presencia de TLCN en las dendritas.
Los componentes de la filopodia dendrítica parecían similares a los de las copas fagocíticas. A continuación, purificamos copas fagocíticas en lugar de filopodia dendrítica. El protocolo para la purificación de vasos fagocíticos se muestra esquemáticamente en la Figura3. Se añadieron microperlas magnéticas a las neuronas del hipocampo cultivadas de tipo salvaje, lo que induce la formación de estructuras de copas fagocíticas. Las estructuras de copa fagocíticas fueron lysed con un detergente débil. Las microperlas se recogieron después de la lisis utilizando un separador de imán. Después del lavado de las perlas, sus proteínas de unión fueron hervidas y eluydas en un tampón de muestra SDS.
La cantidad de proteínas en la fracción unida y no unida se midió utilizando el kit de ensayo de proteína BCA. La misma cantidad de proteínas en las fracciones no unidas y unidas fue separada por SDS-PAGE y teñida por tinción de plata (Figura4A). Los patrones de banda de proteína eran casi los mismos para las fracciones no enlazadas y enlazadas, pero las intensidades a 50 y 70 kDa en la fracción enlazada eran más bajas que las de la fracción no enlazada. Sin embargo, la intensidad de la banda no era obviamente diferente entre las fracciones no enlazadas y enlazadas preparadas a partir de las neuronas hipocampales de cultivo deficiente en TLCN. Para confirmar la purificación de las estructuras de copas fagocíticas, realizamos la hincha occidental utilizando anti-TLCN-C, vitronectina antibovina, anti-actina y anti-a-tubulina (Figura4B). TLCN y VN se detectaron principalmente en la fracción enlazada. Actin, ezrin, G-q, PLC-1, MAP-2 y spectrin se detectaron tanto en las fracciones enlazadas como en las no enlazadas. La moesina, la PSD-95, la actinina y la -tubulina se detectaron en la fracción no unida.
Figura 1: Localización de TLCN y F-actina en filopodia dendrítica y copas fagocíticas. (A) Tinción de inmunofluorescencia de dendritas de una neurona hipocampal cultivada que expresa gapVenus con anticuerpo anti-GFP (azul en una imagen fusionada), anticuerpo anti-TLCN (rojo en una imagen fusionada) y faloidina (verde en una imagen combinada). TLCN y F-actin se observan abundantemente en filopodia dendrítica. (B, C) Formación de estructuras de copa shagocíticas en dendritas neuronales. Microperlas fluorescentes (azul en imágenes combinadas de B, C) añadidas a las neuronas del hipocampo cultivadas se adhieren fuertemente a las dendritas e inducen la acumulación de TLCN (rojo en imágenes combinadas de B, C) y F-actina (verde en imágenes combinadas de B, C). (D) Una vista lateral de una copa fagocítica dendrítica reconstruida a partir de imágenes confocales revela TLCN (rojo en imágenes combinadas de D) que rodea el cordón fluorescente (azul en imágenes combinadas de D). (E) Una copa hemácótica dendrítica inducida por un microperladincargo magnético unido a una dendrita neuronal e inmuno-confitada con anticuerpos anti-VN (azul en imágenes fusionadas de E), anticuerpo anti-TLCN (rojo en imágenes fusionadas de E) y faloidina (verde en imágenes fusionadas de E). Barras de escala de 1 m in (D); 2 m in (A), (C) y (E); y 20 m en (B). Esta cifra ha sido modificada de un estudio anterior18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Formación dependiente de TLCN de estructura de copa fagocítica. (A-D) Imágenes de triple fluorescencia de tipo salvaje (WT; A, C) y deficiencia de TLCN (KO; C, D) neuronas tratadas con perlas fluorescentes recubiertas de VN (rojo en imágenes combinadas de A, B, C, D) y etiquetadas con anticuerpos anti-TLCN (verde en imágenes combinadas de A, B, C, D) y anticuerpos antifosfo-ERM (azul en imágenes combinadas de A, B) o Alexa488-phalloidin (azul en combinado imágenes de C, D). Barras de escala de 5 m. Esta cifra ha sido modificada de un estudio anterior15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Un diagrama esquemático que ilustra el procedimiento de purificación de la fracción dendrítica rica en filopodia. Se añadieron microperlas magnéticas a las neuronas del hipocampo cultivadas para inducir la formación de copas fagocíticas dendríticas. Después de 1 día de incubación, las neuronas fueron solubilizadas con tampón de lisis que contiene 0.01% Tritón X-100. Las cuentas se separaron de la fracción sin enlazar utilizando un separador magnético. Después del lavado, las proteínas enlazadas se eluyó con tampón de muestra SDS y se utilizaron como fracción enlazada. Rojo: VN, verde: TLCN, otros colores: proteínas unidas. Esta cifra ha sido modificada de un estudio anterior18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Confirmación de la fracción de copa fagocítica. (A) Tinción de plata de proteínas en las fracciones no unidas y enlazadas de los microperlas. La misma cantidad (50 ng) de proteínas en las fracciones no unidas y enlazadas purificadas a partir de neuronas hipocampales de tipo salvaje (WT) y deficiencia de TLCN (TLCN KO) fueron separadas por SDS-PAGE y visualizadas con tinción de plata. (B) Análisis de la mancha occidental de las fracciones no enlazadas y enlazadas. La misma cantidad (50 ng) de proteínas fueron separadas por SDS-PAGE y sometidas a análisis de manchas occidentales utilizando anti-TLCN, anti-VN, anti-actina, anti-ezrin, anti-moesina, anti-G-G-q, anti-PLC-1, anti-MAP-2, anti-spectrin, anti-PSD-95, anti---actinin, anticuerpos anti-tubulina. Tenga en cuenta que TLCN, VN, actin, ezrin, PLC-1, MAP-2 y la espectrorina se observan en la fracción dendritica rica en filopodia. Esta cifra ha sido modificada de un estudio anterior18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Desarrollamos un método de purificación para la fracción dendrítica rica en filopodia utilizando la afinidad entre la molécula de adhesión celular TLCN y la matriz extracelular profisitecina. En comparación con la fracción de PSD, podría ser posible identificar las proteínas sinápticas que actúan sobre la sinapsis inmadura de la fracción dendritica rica en filopodia. Por lo tanto, los componentes de la fracción dendrítica rica en filopodia son diferentes de los de la fracción PSD por 74%. A diferencia de la fracción de PSD, usamos neuronas hipocampales cultivadas para formar activamente copas fagocíticas, y las células necesitan estar vivas. Para formar la copa fagocítica, utilizamos la interacción entre TLCN y vitronectina. La expresión TLCN es limitada en el telencéfalo. Por lo tanto, no podemos utilizar neuronas cultivadas derivadas del cerebeloso. Sin embargo, si recubrimos las cuentas con diferentes proteínas, este método de purificación dependiente de la actividad podría aplicarse a las neuronas cerebelosas. Por ejemplo, cuando el dominio N-terminal de microperlas delta2 del receptor de glutamato recubierto delta2 se aplica a las células del gránulo cerebeloso, se identificaron neurexinas presinápticas y cbln1 a partir de las proteínas de unión. Por lo tanto, este método dependiente de la actividad podría utilizarse, si se cambian las proteínas del recubrimiento. Dado que el acceso de microperlas recubiertas de vitronectina se limita a la rebanada cerebral y el tejido cerebral, las copas fagocíticas no se forman eficientemente. Por lo tanto, las tareas futuras incluyen el desarrollo del método de purificación de la fracción dendrítica rica en filopodia de la rebanada cerebral y el tejido.
En este protocolo, condición de cultivo de baja densidad se utiliza para las neuronas del hipocampo, y el crecimiento de las células gliales se inhibe por la adición de Ara-C10,20,21. Las neuronas hipocampales se cultivan en MEM preparado por nosotros mismos, pero no en medio neurobasal, que es ampliamente utilizado para el cultivo de las neuronas hipocampales. Las neuronas hipocampales a menudo mueren por 14 DIV cuando se cultivan en medio neurobasal, lo que indica que el medio neurobasal no es adecuado para nuestra condición de cultivo de baja densidad. Además, un aspecto importante del cultivo de baja densidad es el recubrimiento del plato con hidrobromuro de poli-L-lisina, que no puede ser reemplazado por poli-L-lisina.
Para obtener una cantidad suficiente de proteínas de la fracción dendrítica rica en filopodia, el número de neuronas hipocampales y microperlas magnéticas son factores importantes. Para la inmunostaining filopodia dendrítica, las neuronas del hipocampo se celenaron en un plato de 35 mm a 5,6 x 104 células/plato, mientras que las neuronas estaban chapadas a 7,0 x 104 células/plato para la purificación de la fracción dendrítica rica en filopodia. A 14 DIV, casi ninguna neurona del hipocampo se superpone a 5,6 x 104 células/plato para inmunomanchación, mientras que muchas de las neuronas del hipocampo se superponieron parcialmente con las otras neuronas a 7,0 x 104 células/plato para la purificación de la filopodia dendrítica rica en filopodia Fracción. Sin embargo, la filopodia dendrítica estaba abundantemente presente en ambas densidades de las neuronas del hipocampo. Cultivos de alta densidad de las neuronas del hipocampo a menudo maduran más rápido que las neuronas del hipocampo cultivadas de baja densidad; por lo tanto, ajustar la densidad de las neuronas del hipocampo al cultivo de baja densidad es indispensable para obtener la fracción dendrítica rica en filopodia. Se añadieron microperlas a 1 x 106 microperlas/plato para inmunomancha y a 3 x 106 microperlas/plato para la purificación de la fracción dendrítica rica en filopodia. Para la purificación de la fracción, una vez que se añadió una cantidad suficiente de cuentas, las cuentas sin ataduras fueron lavadas de las neuronas del hipocampo.
En este protocolo, los microperlas se recubren automáticamente con VN, que está presente en el medio de cultivo. Sin embargo, las microperlas pueden ser recubiertas con VN recombinante y añadidas a las neuronas del hipocampo. Debido a que VN es una proteína muy pegajosa, los microperlas recubiertos de VN forman fácilmente agregados. Por lo tanto, las microperlas recubiertas de VN son sonicadas y pipetadas para disociarse unas de otras justo antes de la adición a las neuronas del hipocampo.
Anteriormente mostramos que los microperlas recubiertas de VN inducen fósforo-ERM, PI(4,5)P2y F-actin junto con la acumulación de TLCN15. Cuando la fracción dendrítica rica en filopodia fue analizada por la hincha occidental, el fosfo-ERM no fue detectado por el anticuerpo policlonal antifosfo-ERM y fue ligeramente detectado por anticuerpos monoclonales anti-ezriny y anti-moesina. Parece que la sensibilidad de los anticuerpos monoclonales fue mayor que el anticuerpo policlonal antifosfo-ERM. Además, las proteínas ERM se localizaron en casi todas las regiones de las neuronas del hipocampo, pero las proteínas fosfo-ERM sólo se localizaron en la punta de la filopodia dendrítica y la copa fagocítica. Se considera que la cantidad de enlace fosfo-ERM a TLCN es limitada en comparación con la cantidad de ERM no fosforilado. Por lo tanto, la detección de fosfo-ERM en la fracción dendrítica rica en filopodia parece ser difícil.
Para separar los microperlas de la membrana celular, utilizamos un detergente débil, 0.01% Triton X-100. El TLCN está vinculado al filamento de actina a través de fosfo-ERM en las estructuras de la filopodia dendrítica y la copa fagocítica. Para purificar proteínas indirectamente vinculadas a TLCN a través del filamento de actina, utilizamos un detergente débil en este protocolo. Sin embargo, la concentración de Tritón X-100 podría cambiarse a una concentración más alta dependiendo del propósito del experimento.
Esselens et al. ha demostrado que la ingesta fagocítica demicroperlas indujo TLCN, PIP 2, y la acumulación de F-actina en neuronas de hipocampo cultivadas17. Según nuestro análisis a través de microscopía confocal después de 24 h de incubación con microperlas, los microperlas no fueron completamente tomados en el citoplasma. TLCN yPIP 2, que se localizan en la membrana celular, fueron localizados alrededor de perlas, especialmente en la parte inferior de los microperlas. Además, se analizaron 319 proteínas identificadas a partir de la fracción dendrítica rica en filopodia utilizando el análisis de la vía KEGG. No se detectaron la fagocitosis y las vías de la autofagia, pero la organización del citoesqueleto, la exocitosis, el proceso basado en filamentos de actina y el proceso basado en microtúbulos se enriquecieron significativamente en la fracción18.
El mecanismo molecular de la formación de filopodia dendrítica sigue siendo en gran medida desconocido. El análisis de la estructura de la copa fagocítica podría ayudar a entender los componentes moleculares y las funciones dinámicas de la filopodia dendrítica. Sería interesante analizar la fracción dendrítica rica en filopodia preparada a partir de modelos de ratón de trastornos neuromovicicos y neuropsiquiátricos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Shigeo Okabe y Hitomi Matsuno por la cultura de baja densidad de las neuronas hipocampales, Masayoshi Mishina por ratones con deficiencia de TLCN, Sachiko Mitsui y Momoko Shiozaki por la asistencia técnica, y miembros del laboratorio Yoshihara para discusiones útiles . Este trabajo fue apoyado por JSPS KAKENHI Grant Nos. JP20700307, JP22700354, y JP24500392 y MEXT KAKENHI Grant Nos. JP23123525 a YF y JP20022046, JP18H04683 y JP18H05146 a YY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 1.7 mLl Low Binding MCT | Sorenson BioScience | 39640T | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 2530149 | |
| 35 mm plastic cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| Anti-actin | Sigma-Aldrich | A-5060 | |
| Anti-alpha-Actinin | Sigma-Aldrich | A-5044 | |
| Anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T-9026 | |
| Anti-Ezrin | Sigma-Aldrich | clone3C12, SAB4200806 | |
| Anti-Galphaq | Santacruz | sc-393 | |
| Anti-MAP2 | Chemicon | clone AP20, MAB3418 | |
| Anti-Moesin | Sigma-Aldrich | clone 38/87, M7060 | |
| Anti-PLCbeta1 | Santacuz | sc-5291 | |
| Anti-PSD95 | MA2 | ABR | |
| Anti-Spectrin beta | Chemicon | MAB1622 | |
| B27 | Gibco | 0080085SA | |
| BCA protein assay kit | Thermo | 23227 | |
| Bromophenol blue | Merck | 1.08122.0005 | |
| Calcium chrolide, hydrous | Wako | 038-19735 | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Choline chloride | Sigma-Aldrich | C7527 | |
| Complete EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C-6645 | |
| DNase-I | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P5155 | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo | 12321D | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
| e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel | ATTO | E-T520L | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| HRP-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| i-Inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | |
| LAS-1000 mini | Fuji Film | LAS-1000 mini | For detection of luminescence from WB membrane |
| Magnetic polystyrene microbeads | Sperotech | PM-20-10 | |
| MEM amino acid solution | Gibco | 11130-051 | 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine |
| Mini-slab size electrophoresis system | ATTO | AE-6530 | |
| Niacinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Penicilin / Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 4906845001 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Nacali | 28360-14 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P6155 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R9504 | |
| Silver Stain 2 Kit wako | Wako | 291-5031 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T1270 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 1703940JA | |
| Ultra pure water | MilliQ | For production of ultra pure water |
References
- Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1. Journal of Neuroscience. 18 (21), 8900-8911 (1998).
- Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia. Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).
- Ziv, N. E., Smith, S. J. Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation. Neuron. 17 (1), 91-102 (1996).
- Lohmann, C., Bonhoeffer, T. A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia. Neuron. 59 (2), 253-260 (2008).
- Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Current Opinion in Neurobiology. 19 (2), 146-153 (2009).
- Bayes, A., et al. Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins. PLoS One. 7 (10), e46683 (2012).
- Bayes, A., et al. Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density. Nature Neuroscience. 14 (1), 19-21 (2011).
- Furutani, Y., et al. Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation. Journal of Neuroscience. 27 (33), 8866-8876 (2007).
- Mao, Y. T., et al. Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase. Neuron. 98 (4), 767-782 (2018).
- Matsuno, H., et al. Telencephalin slows spine maturation. Journal of Neuroscience. 26 (6), 1776-1786 (2006).
- Raemaekers, T., et al. ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation. The EMBO Journal. 31 (15), 3252-3269 (2012).
- Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (11), 3921-3925 (1987).
- Yoshihara, Y., Mori, K. Telencephalin: a neuronal area code molecule? Neuroscience Research. 21 (2), 119-124 (1994).
- Annaert, W. G., et al. Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins. Neuron. 32 (4), 579-589 (2001).
- Furutani, Y., et al. Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin. Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 39041-39049 (2012).
- Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth. Journal of Cell Biology. 119 (Pt 15), 3057-3066 (2006).
- Esselens, C., et al. Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway. Journal of Cell Biology. 166 (7), 1041-1054 (2004).
- Furutani, Y., Yoshihara, Y. Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27 (2018).
- Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).
- Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit. The Journal of Neuroscience. 19 (18), 7781-7792 (1999).
- Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture. European Journal of Neuroscience. 10 (6), 2192-2198 (1998).
