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Neuroscience

डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया समृद्ध अंश का शुद्धिकरण

doi: 10.3791/59292 Published: May 2, 2019

Summary

इस प्रोटोकॉल में, हम एक डेन्ड्रिटिक फिलोपोडायल के बीच विशिष्ट और मजबूत संबंध का लाभ लेने के द्वारा सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स पर phagocytic कप की तरह बहिर्वेश संरचना से डेन्ड्रिटिक filopodia समृद्ध अंश को शुद्ध करने के लिए एक विधि परिचय आसंजन अणु, TLCN, और एक extracellular मैट्रिक्स अणु, vitronectin.

Abstract

डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया एक्टिन फिलामेंट के आधार पर पतले और लंबे समय तक बाहर निकालते हैं, और वे एक लक्ष्य एक्सॉन के लिए खोज के रूप में विस्तार और वापस ले लेते हैं। जब डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया एक लक्ष्य एक्सॉन के साथ संपर्क स्थापित करता है, तो वे रीढ़ की हड्डी में परिपक्व होने लगते हैं, जिससे एक synapse के गठन के लिए अग्रणी होता है। टेलीनसेफेलिन (टीएलसीएन) डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया में प्रचुर मात्रा में स्थानीयकृत है और धीरे-धीरे रीढ़ की हड्डी से बाहर रखा गया है। सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में टीएलसीएन का अतिव्यंजक डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया गठन को प्रेरित करता है। हमने दिखाया कि टेलिनेसेफेलिन एक अतिरिक्त कोशिकीय मैट्रिक्स अणु, विट्रोनेक्टिन से दृढ़ता से बांधता है। विट्रोनेक्टिन लेपित माइक्रोबीड्स न्यूरोनल डेन्ड्राइट पर फेगोसाइटिक कप गठन को प्रेरित करता है। फागोसाइटिक कप में, टीएलसीएन, टीएलसीएन-बाइंडिंग प्रोटीन जैसे फॉस्फोरिलेटिड एज़रिन/रेडिक्सिन/मोसिन (फॉस्फो-ईआरएम) और एफ-एक्टिन जमा होते हैं, जो बताते हैं कि फागोसाइटिक कप के घटक डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया के समान होते हैं। इस प्रकार, हमने डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया के स्थान पर फागोसाइटिक कप को शुद्ध करने के लिए एक विधि विकसित की। चुंबकीय पॉलीस्टाइरीन मोती विट्रोनेक्टिन के साथ लेपित थे, जो हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की संस्कृति माध्यम में प्रचुर मात्रा में मौजूद है और जो न्यूरोनल डेन्ड्राइट पर फेगोसाइटिक कप गठन को प्रेरित करता है। 24 ज ऊष्मायन के बाद, phagocytic कप डिटर्जेंट के साथ हल्के solubilized थे और एक चुंबक विभाजक का उपयोग कर एकत्र. मोती धोने के बाद, बाध्यकारी प्रोटीन eluted और चांदी धुंधला और पश्चिमी सोख्ता द्वारा विश्लेषण किया गया. बाध्यकारी अंश में, TLCN और actin प्रचुर मात्रा में मौजूद थे. इसके अलावा, अंश से पहचाने गए कई प्रोटीन को डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया में स्थानीयकृत किया गया; इस प्रकार, हमने बंधनीय अंश को डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया समृद्ध अंश के रूप में नामित किया। यह लेख डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया समृद्ध अंश के लिए शुद्धि विधि के बारे में विवरण का वर्णन करता है।

Introduction

डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया को रीढ़ की हड्डी का अग्रदूत माना जाता है। डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया में एक्टिन फिलामेंट उनके विस्तार और वापसी1,2,3को विनियमित करते हैं . एक एक्सॉन के साथ संपर्क करने के बाद, चयनित डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया रीढ़ की हड्डी में अपनी परिपक्वता शुरू करते हैं, और एक सिनेप्स का गठन4,5होता है। रीढ़ के घटक पोस्टीनैप्टिक घनत्व के व्यापक विश्लेषण से निर्धारित किए गए हैं6,7, जबकि डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया के घटक काफी हद तक अज्ञात रहते हैं। यह दिखाया गया है कि टेलीनसेफेलिन (TLCN), ERM, SynGAP, रास, PI3 kinase, Akt, MTOR, पोलो की तरह kinase 2, CaMKII, syndecan-2, paralemin-1, ARF6, और EphB को विनियमित डेन्ड्रिटिक filopodia गठन5,8,9 10,11, जबकि डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया में मौजूद अणुओं के व्यापक विश्लेषण के लिए एक विधि विकसित नहीं की गई है।

TLCN (ICAM-5) विशेष रूप से सबसे रोस्ट्रल मस्तिष्क खंड में spiny न्यूरॉन्स द्वारा व्यक्त की है, telencephalon12. TLCN अपने extracellular क्षेत्र में 9 आईजी की तरह डोमेन है, एक transmembrane क्षेत्र, और एक साइटोप्लाज्मिक पूंछ13. TLCN अपने extracellular क्षेत्र में vitronectin (VN) और LFA-1 integrin के लिए बांधता है, अपने transmembrane क्षेत्र में presenilin करने के लिए, और फॉस्फो-ईआरएम और अपने साइटोप्लाज्मिक क्षेत्र में जेड-actinin5,8,14,15 ,16. TLCN रीढ़ की हड्डी और डेन्ड्रिटिक शाफ्ट8,16में डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया और जेड-एक्टिनिन के सुझावों पर फॉस्फो-ईआरएम के माध्यम से actin cytoskeleton को बांधता है।

हमने दिखाया कि टीएलसीएन ने डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया के गठन को बढ़ाया और रीढ़ की हड्डी को फिर से शुरू करने के लिए फिलोपोडिया10को प्रेरित किया . TLCN कोशिकाद्रव्यी क्षेत्र और उन्नत डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया गठन8के लिए बाध्य ezrin के गठन सक्रिय रूप . इस प्रकार, TLCN actin-बाध्यकारी प्रोटीन के माध्यम से डेन्ड्रिटिक filopodia गठन को नियंत्रित करता है. Esselens एट अल. प्रदर्शन किया है कि microbeads सुसंस्कृत न्यूरॉन्स17पर TLCN संचय प्रेरित . हमने दिखाया कि वीएन लेपित माइक्रोबीड्स के चारों ओर न्यूरॉनल डेन्ट्रेट्स पर टीएलसीएन-निर्भर तरीके से15के बारे में फेगोसाइटिक कप संरचनाओं का गठन किया गया था। डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया के घटक फैगोसाइटिक कप के समान होते हैं। डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया को एकत्र करना मुश्किल है, लेकिन चुंबकीय माइक्रोबीड्स का उपयोग करके फैगोसाइटिक कप एकत्र करना अपेक्षाकृत आसान है। इस प्रकार हमने डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया18के स्थान पर फागोसाइटिक कप को शुद्ध करने की एक विधि विकसित की। यहाँ, हम डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया समृद्ध अंश के लिए शुद्धि विधि का वर्णन करते हैं।

Protocol

यहां वर्णित सभी विधियों को रिकेन वाको की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1. हिप्पोकैम्पस न्यूरोंस की संस्कृति

  1. संस्कृति माध्यम की तैयारी
    1. 200x विटामिन मिश्रण की तैयारी. डी-पैन्टोथेनिक एसिड हेमीकैल्सियम नमक की 100 मिलीग्राम, कोलीन क्लोराइड की 100 मिलीग्राम, फोलिक एसिड की 100 मिलीग्राम, आई-इनोसिटॉल की 180 मिलीग्राम, नियासिनमाइड की 100 मिलीग्राम, पाइरिडोक्सल एचसीएल की 100 मिलीग्राम और अल्ट्राप्यूर जल का उपयोग करते हुए थाइमिन एचसीएल के 100 मिलीग्राम। समाधान पूरी तरह से भंग नहीं है। सावधानी से, 50 एमएल ट्यूबों में एलिकोट को मिलाकर -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. Riboflavin समाधान की तैयारी. एक चुंबकीय विलोपन का उपयोग कर ultrapure पानी के 500 एमएल में Riboflavin के 100 मिलीग्राम भंग. समाधान पूरी तरह से भंग नहीं है। सावधानी से, 50 एमएल ट्यूबों में एलिकोट को मिलाकर -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. 1 M CaCl2की तैयारी | चुंबकीय विभीक जल के50 एमएल में 7ण्35 ह ब्ब् 2 ब्2ह2ह 2 हे को भंग की ंह।
    4. न्यूनतम आवश्यक माध्यम (एमईएम) की तैयारी। केसीएल की 400 मिलीग्राम, 6800 मिलीग्राम नासीएल, 2,200 मिलीग्राम नाहको3,158 मिलीग्राम नाह2पीओ4जेडएच2ओ, 7000 मिलीग्राम डी-ग्लूकोज, और 200 मिलीग्राम MgSO4-7H2O में 950 मिलीग्राम अल्ट्राप्यूर पानी का उपयोग करते हुए एक चुंबकीय रस्टर का उपयोग किया।
    5. एक चुंबकीय हलचल पर एक निरंतर आंदोलन के साथ एक 1 एमएल पाइप का उपयोग कर एक ड्रॉप-दर-ड्रॉप तरीके से एमईएम के लिए 1.8 एमएल का 1.8 एमएल का उपयोग करें। एमईएम के पीएच को 1 मोल/एल एचसीएल के साथ 7ण्25 में समायोजित करें।
    6. एमईएम के लिए 200x विटामिन मिश्रण के 5 एमएल और Riboflavin समाधान के 200 डिग्री एल जोड़ें। अल्ट्राप्यूर पानी के साथ 1,000 एमएल के लिए समाधान की मात्रा समायोजित करें। 0ण्22डिग्री उ फ़िल्टर सिस्टम का उपयोग करके समाधान को फ़िल्टर करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें.
    7. 10x DNase-I शेयर समाधान की तैयारी. हैंक्स के संतुलित नमक समाधान (HBSS) के 12.5 एमएल में DNase-I के 100 मिलीग्राम भंग, एक 0.22 डिग्री मीटर फिल्टर के माध्यम से फिल्टर, 1.5 एमएल ट्यूबों में alicot, और ट्यूबों की दुकान -20 डिग्री सेल्सियस.
    8. साइटोसिन जेड-डी-अरबिनोफ्रानोसाइड (आरा-सी) स्टॉक समाधान तैयार करना। अल्ट्राप्यूर पानी के 8.93 एमएल में आरा-सी के 25 मिलीग्राम भंग (10 एम एम की अंतिम एकाग्रता), 0.22 डिग्री मीटर फिल्टर के माध्यम से फिल्टर, 1.5 एमएल ट्यूबों में अलीकोट और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
    9. प्लेटिंग माध्यम की तैयारी। मिश्रण 1 एमएल एमईएम एमिनो एसिड समाधान, 1 एम एचईपीएस के 750 एमएल, बी 27 के 1 एमएल, 200 एमएम ग्लूटामाइन के 125 एमएल, पेनिसिलिन के 250 एमएल /
    10. मध्यम बंद करो की तैयारी. मिश्रण 1 एमएल एमईएम एमिनो एसिड समाधान, 750 $L के 1 M HEPES, FBS के 5 एमएल (अंतिम 10%), और एक 50 एमएल ट्यूब में एमईएम के 43.25 एमएल.
  2. पॉली-एल-लीज्या लेपित व्यंजन तैयार करना
    1. कोट 35 मिमी प्लास्टिक सेल संस्कृति व्यंजन के साथ 0.2 मिलीग्राम / पाली-L-lysine hydrobromide के 1 दिन के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर.
      नोट: पॉली-एल-लाइसीन का उपयोग पॉली-एल-लाइसिन हाइड्रोब्रोमाइड के स्थान पर नहीं किया जाना चाहिए।
    2. 3 बार अल्ट्रापुरे पानी के 2 एमएल से बर्तन धो लें। उपयोग करने तक 25 डिग्री सेल्सियस पर स्टॉप मीडियम के 1.5 एमएल के साथ व्यंजन इनक्यूबेट करें।
  3. माउस भ्रूण से हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स का विच्छेदन
    1. हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स का ऊतक स्रोत. हिपोकैम्पस को जंगली प्रकार और TLCN-कमी C57BL6/J चूहों से भ्रूण ीय दिनों 16-17 पर लू एट अल19की विधि के अनुसार दूर करें।
    2. HBSS में 0.25% ट्रिप्सिन और 1x DNaseI में इनक्यूबेट विच्छेदित हिप्पोकैम्पी, जिसमें 15 एम एम हेप्स, पीएच 7.2 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन के साथ हर 3 मिनट पर समाधान निकालें। स्टॉप मध्यम के 10 एमएल में हिप्पोकैम्पी को 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करने के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. हिप्पोकैम्पी को ताजा स्टॉप मीडियम के 10 एमएल में ले जाएं और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। हिप्पोकैम्पी को 15 मिनट के लिए ताजा स्टॉप मीडियम के 10 एमएल में और 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। हिप्पोकैम्पी को STOP मध्यम के 900 $L और 100 डिग्री डीनेसेआई के 100 डिग्री सेल्सियस में ले जाएं। एमएल ट्यूब. एक 1 एमएल पाइप्ट का उपयोग कर 20 बार पाइपिंग द्वारा अलग न्यूरॉन्स में हिप्पोकैम्पी को अलग करें।
      नोट: हिप्पोकैम्पी के वियोजन के दौरान 1 एमएल पाइप्ट की नोक 15 एमएल ट्यूब के निचले हिस्से को थोड़ा छू लेती है।
    4. प्लेटिंग माध्यम के 9 एमएल जोड़ें, और एक 50 एमएल ट्यूब में एक 70 डिग्री मीटर सेल छलनी के माध्यम से फिल्टर। हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की संख्या की गणना करें और प्लेटिंग माध्यम में 3.5 x 104 कोशिकाओं/
    5. पाली-एल-लीसाइन-कोटेड व्यंजन से एस्पायर स्टॉप मीडियम। पाली-L-Lysine लेपित व्यंजन पर कोशिकाओं प्लेट 7 x 104 कोशिकाओं /
    6. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 के तहत ऊष्मायन के 60-64 एच के बाद, न्यूरॉन्स के लिए आरा-सी स्टॉक समाधान (अंतिम 10 डिग्री सेल्सियस) के 2 डिग्री एल जोड़ें, और पकवान धीरे-धीरे हिला। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 के तहत संस्कृति माध्यम को बदलने के बिना एक humidified बॉक्स में संस्कृति व्यंजन रखें।

2. डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया समृद्ध अंश का शुद्धिकरण

  1. इन विट्रो (DIV) में 13 दिनों के बाद, सुसंस्कृत न्यूरॉन्स युक्त 20 व्यंजन के लिए चुंबकीय polystyrene microbeads (3 x 106 कणों / 1 दिन के बाद, आंदोलन के साथ पीबीएस के 1 एमएल में न्यूरॉन्स धोने 3 बार मध्यम और असीम microbeads को दूर करने के लिए. पीबीएस को हटाने के बाद, lysis बफर के 500 $L/dish के साथ न्यूरॉन्स lyse (पीबीएस युक्त 0.01% Triton एक्स-100, EDTA मुक्त प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल, और फॉस्फेटेज अवरोधक कॉकटेल).
  2. एक सेल खुरचनी के साथ lysate ले लीजिए और कम प्रोटीन बाध्यकारी microtubes (10 ट्यूबों) के लिए lysate ले जाएँ. एक चुंबक विभाजक पर ट्यूब सेट और 1 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें supernatant लीजिए और चांदी धुंधला और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए असीम अंश के रूप में इसका इस्तेमाल करते हैं.
  3. एक नया कम प्रोटीन बाध्यकारी microtube, एक चुंबकीय विभाजक पर सेट करने के लिए मोती स्थानांतरण, और पूरी तरह से supernatant हटा दें. lysis बफर के 500 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और 15 s के लिए एक भंवर मिक्सर का उपयोग कर मोती धोने. एक चुंबक विभाजक पर ट्यूब सेट, 1 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें, supernatant निकालें, और lysis बफर के 500 $L जोड़ें. 10 बार मोती की धुलाई दोहराएँ और supernatant हटा दें.
  4. Elute प्रोटीन मोती के लिए बाध्य (सीमा अंश) 1x एसडीएस नमूना बफर के 50 डिग्री एल के अलावा द्वारा (62.5 एम एम Tris एचसीएल, पीएच 6.8, 2.5% एसडीएस, और 10% ग्लिसरॉल) और 10 मिनट के लिए ट्यूब 98 डिग्री सेल्सियस पर उबाल ट्यूब सेट ट्यूब और 10 एस के लिए 860 ग्राम पर ट्यूब सेट और 1 मिनट के लिए एक चुंबकीय विभाजक पर. supernatant लीजिए और यह बाध्य अंश के रूप में उपयोग करें.
    नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है।
  5. बीसीए प्रोटीन परख द्वारा असीम और बाध्य भिन्नों के प्रोटीन सांद्रता को मापें। ब्रोमोफेनोल नीले रंग के साथ प्रोटीन समाधान कल्पना और एसडीएस-पेज के लिए 5 एनजी /जेडएल के लिए एकाग्रता को समायोजित।

3. रजत दाग और पश्चिमी ब्लाट विश्लेषण

  1. एक 5-20% ढाल जेल का उपयोग कर SDS-पेज द्वारा बाउंड और अनबाउंड भिन्न (50 एनजी) को अलग करें। चांदी- जेल दाग.
  2. पश्चिमी दाग विरोधी TLCN-C (1/3,000), विरोधी गोजातीय vitronectin (1/5,000), विरोधी actin (1/1,000), और विरोधी-tubulin (1/1,000) प्राथमिक एंटीबॉडी और एचआरपी-कंजुटेड बकरी विरोधी खरगोश IgG (1/5,000) के रूप में माध्यमिक शरीर के रूप में का उपयोग कर. केमियुमिनसेंट वेस्टर्न ब्लॉटिंग डिटेक्शन रिएजेंट और एक केमियुमिनेस इमेजर का उपयोग करके एंटीजन को विज़ुअल करें।

Representative Results

सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में, TLCN प्रचुर मात्रा में डेन्ड्रिटिक filopodia, शाफ्ट, और सोमा के लिए स्थानीयकृत किया गया था और एफ-एक्टिन के साथ colocalized (चित्र 1A, बी)। जब polystyrene microbeads सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के लिए जोड़ा गया था, मोती स्वचालित रूप से संस्कृति माध्यम में भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) से व्युत्पन्न vitronectin (VN) के साथ लेपित थे; वे मुख्य रूप से डेंड्राइट से बंधे हुए थे, और उन्होंने फैगोसाइटिक कपों के गठन को प्रेरित किया (चित्र 1बी-ई)। फागोसाइटिक कप डेंड्राइट्स पर माइक्रोबीड्स के आसपास शीट के आकार के एक्टिन फिलामेंट पर आधारित थे। TLCN, फॉस्फो-ERM, और PI(4,5)P2, जो डेन्ड्रिटिक filopodia के लिए मार्कर हैं, मोती के आसपास अत्यधिक संचित कर रहे हैं (चित्र 1 D)8,15. Phagocytic कप केवल जंगली प्रकार हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स पर गठन किया गया था, लेकिन TLCN कमी हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स पर नहीं (चित्र 2A-D).. इस प्रकार, फेगोसाइटिक कप गठन डेन्ड्राइट्स में टीएलसीएन की उपस्थिति पर महत्वपूर्ण रूप से निर्भर था।

डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया के घटक फैगोसाइटिक कपों के समान दिखाई देते थे। इसके बाद, हम डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया के बजाय फेगोसाइटिक कप शुद्ध करते हैं। फागोसाइटिक कपों के शुद्धिकरण के लिए प्रोटोकॉल को योजनाबद्ध रूप से चित्र 3में दर्शाया गया है। चुंबकीय microbeads जंगली प्रकार सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के लिए जोड़ा गया है, जो phagocytic कप संरचनाओं के गठन को प्रेरित करता है. फागोसाइटिक कप संरचनाओं को एक कमजोर डिटर्जेंट के साथ lysed थे. माइक्रोबीड्स एक चुंबक विभाजक का उपयोग कर lysis के बाद एकत्र किए गए थे। मोती धोने के बाद, उनके बाध्यकारी प्रोटीन उबला हुआ था और एक एसडीएस नमूना बफर में eluted.

बाध्य और असीमित अंश में प्रोटीन की मात्रा बीसीए प्रोटीन परख किट का उपयोग कर मापा गया था. असीम और सीमाबद्ध भिन्नों में प्रोटीन की समान मात्रा को एसडीएस-पेज द्वारा पृथक किया गया था और चांदी के दाग से दागित किया गया था (चित्र 4क)। प्रोटीन बैंड पैटर्न लगभग असीम और बाध्य भिन्नों के लिए एक ही थे, लेकिन बाध्य अंश में 50 और 70 kDa पर तीव्रता असीम अंश में उन लोगों की तुलना में कम थे. हालांकि, बैंड तीव्रता स्पष्ट रूप से TLCN कमी संस्कृति हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स से तैयार असीम और बाध्य भिन्न के बीच अलग नहीं था. फागोसाइटिक कप संरचनाओं की शुद्धि की पुष्टि करने के लिए, हमने एंटी-टीएलसीएन-सी, एंटी-बोवाइन विट्रोनेक्टिन, एंटी-एक्टिन, और एंटी-टूबुलिन (चित्र 4बी)का उपयोग करके पश्चिमी सोख्ता प्रदर्शन किया। TLCN और VN मुख्य रूप से बाध्य अंश में पाया गया. Actin, ezrin, जीजेड, PLC$1, मानचित्र-2, और spectrin दोनों बाध्य और असीम भिन्नमें पाया गया. मोसिन, PSD-95, जेड-actinin, और $-tubulin असीम अंश में पाए गए.

Figure 1
चित्र ााा्वित १: डेन् ड्रिटिक फिलोपोडिया और फागोसाइटिक कपों में टीएलसीएन और एफ-एक्टिन का स्थानीयकरण। (ए) एक सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन के डेन्ड्रेट्स का इम्यूनोफ्लोरेसेंस दाग एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी (एक मर्ज की गई छवि में नीला), एंटी-टीएलसीएन एंटीबॉडी (एक मर्ज की गई छवि में लाल), और फल्लॉयडिन (एक मर्ज की गई छवि में हरा)। टीएलसीएन और एफ-एक्टिन डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया में प्रचुर मात्रा में पाए जाते हैं। (बी, सी) न्यूरोनल डेन्ड्राइट पर फागोसाइटिक कप संरचनाओं का गठन। फ्लोरोसेंट माइक्रोबीड्स (बी, सी के विलय ित छवियों में नीले) को सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में जोड़ा गया है जो डेन्ड्रेट्स पर दृढ़ता से पालन करते हैं और टीएलसीएन (बी, सी के विलय ित छवियों में लाल) और एफ-एक्टिन (बी, सी के विलय ित छवियों में हरे रंग) के संचय को प्रेरित करते हैं। (घ) एक डेन्ड्रिटिक फैगोसाइटिक कप का एक पार्श्व दृश्य जो confocal छवियों से पुनर्निर्माण किया गया है, TLCN (डी के विलयित छवियों में लाल) फ्लोरोसेंट मनका (डी के विलयित चित्रों में नीला) का पता चलता है। (ई) एक डेन्ड्रिटिक फैगोसाइटिक कप जो एक न्यूरोनल डेन्ड्रिट पर संलग्न एक चुंबकीय माइक्रोबीएड द्वारा प्रेरित किया गया है और एंटी-वीएन एंटीबॉडी (ई के विलयित छवियों में नीला), एंटी-टीएलसीएन एंटीबॉडी (ई के विलय छवियों में लाल), और फेलॉयडिन (मर्ज की गई छवियों में हरा) ई) स्केल बार्स ] 1 $m में (डी); (क), (सी), और (ई) में 2 डिग्री मी; और 20 डिग्री मी (बी) में। यह आंकड़ा पिछले18अध्ययन से संशोधित किया गया है . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: टीएलसीएन-निर्भर फागोसाइटिक कप जैसी संरचना का गठन। (-डी) जंगली प्रकार के ट्रिपल फ्लोरोसेंट छवियों (WT; ए, सी) और TLCN कमी (KO; सी, डी) वीएन लेपित फ्लोरोसेंट मोती के साथ इलाज न्यूरॉन्स (ए, बी, सी, डी के विलय छवियों में लाल) और विरोधी TLCN एंटीबॉडी के साथ लेबल (ए, बी, सी, डी के विलय छवियों में हरे) और विरोधी phospho-ERM एंटीबॉडी (ए, बी की छवियों में नीले विलय) या Alexa48-phalloidin (नीले रंग में विलय) सी, डी की छवियों). स्केल बार्स $ 5 $m. यह आंकड़ा पिछले 15अध्ययन से संशोधित किया गया है . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया समृद्ध अंश की शुद्धि प्रक्रिया का चित्रण करने वाला एक योजनाबद्ध आरेख। चुंबकीय सूक्ष्म जीवों को सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स पर जोड़ा गया था ताकि डेन्ड्रिटिक फैगोसाइटिक कप के गठन को प्रेरित किया जा सके। ऊष्मायन के 1 दिन के बाद, न्यूरॉन्स lysis बफर युक्त 0.01% Triton एक्स-100 के साथ solubilized थे. मोती एक चुंबकीय विभाजक का उपयोग कर अनबाउंड अंश से अलग किए गए थे। धोने के बाद, बाध्य प्रोटीन एसडीएस नमूना बफर के साथ eluted और बाध्य अंश के रूप में इस्तेमाल किया गया. लाल: वीएन, हरे: TLCN, अन्य रंग: बाध्य प्रोटीन. यह आंकड़ा पिछले18अध्ययन से संशोधित किया गया है . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: फागोसाइटिक कप अंश की पुष्टि। (क) माइक्रोबीड्स के असीम एवं बाउंड भिन्नों में प्रोटीनों का रजत धुंधला होना। जंगली प्रकार (WT) और TLCN कमी (TLCN KO) हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स से शुद्ध असीम और बाध्य अंशों में प्रोटीन की एक ही राशि (50 एनजी) एसडीएस-पेज द्वारा अलग किया गया और चांदी के दाग के साथ कल्पना की गई। (ठ) असीम तथा बद् ध भिन्नों का पश्चिमी दाग विश्लेषण। प्रोटीन की एक ही राशि (50 एनजी) एसडीएस-पेज द्वारा अलग कर दिया गया था और विरोधी TLCN, विरोधी VN, विरोधी actin, विरोधी ezrin, विरोधी-मोसिन, विरोधी-जीजेड, विरोधी पीएलसी 1, विरोधी-MAP-2, विरोधी spectrin, विरोधी-पीएसडी-95, विरोधी-actin, और विरोधी-actin, का उपयोग कर पश्चिमी दाग विश्लेषण के अधीन प्रति-जेड-टूबुलिन एंटीबॉडी। ध्यान दें कि TLCN, VN, actin, ezrin, PLC$1, मानचित्र-2, और spectrin डेन्ड्रिटिक filopodia समृद्ध अंश में मनाया जाता है. यह आंकड़ा पिछले18अध्ययन से संशोधित किया गया है . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

हमने सेल आसंजन अणु TLCN और extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन vitronectin के बीच संबंध का उपयोग कर के डेन्ड्रिटिक filopodia समृद्ध अंश के लिए एक शुद्धि विधि विकसित की है. PSD अंश की तुलना में, यह डेन्ड्रिटिक filopodia समृद्ध अंश से अपरिपक्व synapse पर अभिनय synaptic प्रोटीन की पहचान करने के लिए संभव हो सकता है. इस प्रकार, डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया समृद्ध अंश के घटक PSD अंश के घटकों से 74% से अलग हैं। PSD अंश से अलग है, हम सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स का इस्तेमाल करने के लिए सक्रिय रूप से phagocytic कप फार्म, और कोशिकाओं को जीवित रहने की जरूरत है. फागोसाइटिक कप बनाने के लिए, हमने TLCN और vitronectin के बीच अन्योन्यक्रिया का उपयोग किया। TLCN अभिव्यक्ति telencephalon में सीमित है. इस प्रकार, हम सेरेबेलर से व्युत्पन्न सुसंस्कृत न्यूरॉन्स का उपयोग नहीं कर सकते. हालांकि, अगर हम विभिन्न प्रोटीन के साथ मोती कोट, इस गतिविधि पर निर्भर शुद्धि विधि सेरेबेलर न्यूरॉन्स के लिए लागू किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, जब ग्लूटामेट रिसेप्टर डेल्टा2-कोटेड माइक्रोबीड्स के एन-टर्मिनल डोमेन को सेरेबेलर ग्रैन्युल कोशिकाओं पर लागू किया जाता है, तो बाइंडिंग प्रोटीन से presynaptic न्यूरेक्सिन और cbln1 की पहचान की गई थी। इसलिए, इस गतिविधि पर निर्भर विधि इस्तेमाल किया जा सकता है, अगर कोटिंग प्रोटीन बदल रहे हैं. चूंकि vitronectin लेपित microbeads का उपयोग मस्तिष्क टुकड़ा और मस्तिष्क के ऊतकों तक ही सीमित है, phagocytic कप कुशलता से गठन नहीं कर रहे हैं. इस प्रकार, भविष्य के कार्यों में मस्तिष्क टुकड़ा और ऊतक से डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया समृद्ध अंश की शुद्धि विधि विकसित करना शामिल है।

इस प्रोटोकॉल में, कम घनत्व संस्कृति हालत हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के लिए प्रयोग किया जाता है, और glial कोशिकाओं के विकास आरा -सी10,20,21के अलावा द्वारा बाधित कर रहे हैं. हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स एमईएम में खुद के द्वारा तैयार सुसंस्कृत हैं, लेकिन न्यूरोबेसल माध्यम में नहीं, जो व्यापक रूप से हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की संस्कृति के लिए प्रयोग किया जाता है। हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स अक्सर 14 DIV द्वारा मर जाते हैं जब neurobasal माध्यम पर सुसंस्कृत, जो इंगित करता है कि neurobasal माध्यम हमारे कम घनत्व संस्कृति की स्थिति के लिए उपयुक्त नहीं है. इसके अलावा, कम घनत्व संस्कृति का एक महत्वपूर्ण पहलू पॉली-एल-lysine hydrobromide, जो पाली-एल-lysine के साथ प्रतिस्थापित नहीं किया जा सकता है के साथ पकवान कोटिंग है.

डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया समृद्ध अंश से प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा प्राप्त करने के लिए, हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स और चुंबकीय microbeads की संख्या महत्वपूर्ण कारक हैं. इम्यूनोस्टेनिंग डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया के लिए, हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स को 35 मिमी डिश पर 5.6 x$ 104 कोशिकाओं/डिश पर चढ़ाया गया था, जबकि न्यूरॉन्स को डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया-रिच अंश की शुद्धि के लिए 7.0 x 104 कोशिकाओं/ 14 DIV में, लगभग कोई हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स 5.6 x 104 कोशिकाओं/dish पर इम्यूनोस्टेनिंग के लिए ओवरलैप किया, जबकि हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के कई आंशिक रूप से 7.0 x 104 कोशिकाओं पर अन्य न्यूरॉन्स के साथ ओवरलैप / अंश. हालांकि, डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के दोनों घनत्वों पर प्रचुर मात्रा में मौजूद थे। हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की उच्च घनत्व संस्कृतियों अक्सर कम घनत्व सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की तुलना में तेजी से परिपक्व; इस प्रकार, कम घनत्व संस्कृति के लिए हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के घनत्व का समायोजन डेन्ड्रिटिक filopodia समृद्ध अंश प्राप्त करने के लिए अपरिहार्य है. माइक्रोबीड्स को इम्यूनोस्टेनिंग के लिए 1 x 106 माइक्रोबीड्स/डिश में जोड़ा गया था और डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया समृद्ध अंश की शुद्धि के लिए 3 x 106 माइक्रोबीड्स/ अंश की शुद्धि के लिए, एक बार मोती की पर्याप्त मात्रा में जोड़ा गया था, असीम मोती हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स से बाहर धोया गया.

इस प्रोटोकॉल में, microbeads स्वचालित रूप से वीएन, जो संस्कृति के माध्यम में मौजूद है के साथ लेपित थे. हालांकि, microbeads पुनः संयोजक वीएन के साथ लेपित किया जा सकता है और हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के लिए जोड़ा. क्योंकि वीएन एक बहुत चिपचिपा प्रोटीन है, वीएन लेपित microbeads आसानी से समुच्चय फार्म. इस प्रकार, वीएन लेपित microbeads sonicated और एक दूसरे से बस हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के अलावा से पहले अलग करने के लिए पाइपेट कर रहे हैं.

हमने पहले दिखाया था कि वीएन लेपित माइक्रोबीड्स फॉस्फोर-ईआरएम, पीआई (4,5)पी2और एफ-एक्टिन को TLCN संचय15के साथ प्रेरित करता है। जब डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया समृद्ध अंश का पश्चिमी सोख्ता द्वारा विश्लेषण किया गया था, तो फॉस्फो-ईआरएम को एंटी-फॉस्फो-ईआरएम पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी द्वारा पता नहीं लगाया गया था और एंटी-एज़रिन और एंटी-मोसिन मोनोक्लोनल एंटीबॉडी द्वारा थोड़ा पता लगाया गया था। ऐसा प्रतीत होता है कि मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की संवेदनशीलता एंटी-फॉस्फो-ईआरएम पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी की तुलना में अधिक थी। इसके अलावा, ईआरएम प्रोटीन हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के लगभग सभी क्षेत्रों के लिए स्थानीयकृत थे, लेकिन फॉस्फो-ईआरएम प्रोटीन केवल डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया और फेगोसाइटिक कप की नोक के लिए स्थानीयकृत थे। यह माना जाता है कि TLCN के लिए फॉस्फो-ERM बाध्यकारी की मात्रा nonphosphorylated ERM की मात्रा की तुलना में सीमित है. इस प्रकार, डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया समृद्ध अंश में फॉस्फो-ईआरएम का पता लगाना मुश्किल प्रतीत होता है।

कोशिका झिल्ली से microbeads अलग करने के लिए, हम एक कमजोर डिटर्जेंट, 0.01% Triton एक्स-100 का इस्तेमाल किया. TLCN डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया और फागोसाइटिक कप संरचनाओं में फॉस्फो-ईआरएम के माध्यम से actin फिलामेंट से जुड़ा हुआ है। actin फिलामेंट के माध्यम से परोक्ष रूप से TLCN से जुड़े प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए, हम इस प्रोटोकॉल में एक कमजोर डिटर्जेंट का इस्तेमाल किया. हालांकि, प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर Triton X-100 की एकाग्रता एक उच्च एकाग्रता के लिए बदला जा सकता है.

Esselens एट अल पता चला है कि microbeads प्रेरित TLCN,रंज 2, और एफ-actin के phagocytic तेज सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स17में . microbeads के साथ ऊष्मायन के 24 एच के बाद confocal माइक्रोस्कोपी के माध्यम से हमारे विश्लेषण के अनुसार, microbeads पूरी तरह से कोशिका द्रव्य में नहीं लिया गया. TLCN और रंज2, जो कोशिका झिल्ली के लिए स्थानीयकृत कर रहे हैं, मोती के आसपास स्थानीयकृत थे, विशेष रूप से microbeads के तल पर. इसके अलावा, 319 प्रोटीन डेन्ड्रिटिक filopodia से पहचान की समृद्ध अंश KEGG मार्ग विश्लेषण का उपयोग कर विश्लेषण किया गया. फागोसाइटोसिस और ऑटोफैगी रास्ते का पता नहीं लगाया गया था, लेकिन साइटोस्केलेटन संगठन, एक्सोसाइटोसिस, एक्टिन-फिलामेंट आधारित प्रक्रिया, और माइक्रोट्युबल आधारित प्रक्रिया अंश18में काफी समृद्ध थे।

डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया गठन का आण्विक तंत्र काफी हद तक अज्ञात रहता है। फागोसाइटिक कप संरचना का विश्लेषण आणविक घटकों और डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया के गतिशील कार्यों को समझने में मदद कर सकता है। न्यूरोडेवलपमेंटल और न्यूरोसाइकेट्रिक विकारों के माउस मॉडल से तैयार डेन्ड्रिटिक फिलोपोडिया समृद्ध अंश का विश्लेषण करना दिलचस्प होगा।

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की कम घनत्व संस्कृति के लिए Shigeo Okabe और Hitomi Matsuno धन्यवाद, TLCN कमी चूहों के लिए Masayoshi Mishina, Sachiko Mitsui और Momoko Shiozaki तकनीकी सहायता के लिए, और सहायक विचार विमर्श के लिए Yoshihara प्रयोगशाला के सदस्यों . इस कार्य को जेएसपीएस काकेनही ग्रांट नं. JP20700307, JP22700354, और JP24500392 और MEXT KAKENHI अनुदान Nos. JP23123525 YF और JP20022046, JP18H04683, और JP18H05146 YY करने के लिए.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M HEPES Gibco 15630-080
1.7 mLl Low Binding MCT Sorenson BioScience 39640T
200 mM L-Glutamine Gibco 2530149
35 mm plastic cell culture dishes Corning 430165
Anti-actin Sigma-Aldrich A-5060
Anti-alpha-Actinin Sigma-Aldrich A-5044
Anti-alpha-tubulin Sigma-Aldrich T-9026
Anti-Ezrin Sigma-Aldrich clone3C12, SAB4200806
Anti-Galphaq Santacruz sc-393
Anti-MAP2 Chemicon clone AP20, MAB3418
Anti-Moesin Sigma-Aldrich clone 38/87, M7060
Anti-PLCbeta1 Santacuz sc-5291
Anti-PSD95 MA2 ABR
Anti-Spectrin beta Chemicon MAB1622
B27 Gibco 0080085SA
BCA protein assay kit Thermo 23227
Bromophenol blue Merck 1.08122.0005
Calcium chrolide, hydrous Wako 038-19735
Cell scraper Falcon 353085
Cell strainer Falcon 352350
Choline chloride Sigma-Aldrich C7527
Complete EDTA free protease inhibitor cocktail Roche 11873580001
Cytosine beta-D-arabinofuranoside Sigma-Aldrich C-6645
DNase-I Sigma-Aldrich DN-25
D-Pantothenic acid hemicalcium salt Sigma-Aldrich P5155
DynaMag-2 Magnet Thermo 12321D
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent GE RPN2232
e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel ATTO E-T520L
Folic acid Sigma-Aldrich F8758
HBSS Gibco 14175095
HRP-conjugated anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 111-035-144
i-Inositol Sigma-Aldrich I7508
LAS-1000 mini Fuji Film LAS-1000 mini For detection of luminescence from WB membrane
Magnetic polystyrene microbeads Sperotech PM-20-10
MEM amino acid solution Gibco 11130-051 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine
Mini-slab size electrophoresis system ATTO AE-6530
Niacinamide Sigma-Aldrich N0636
Penicilin / Streptomycin Gibco 15070063
PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail Roche 4906845001
Poly-L-lysine hydrobromide Nacali 28360-14
Pyridoxal HCl Sigma-Aldrich P6155
Riboflavin Sigma-Aldrich R9504
Silver Stain 2 Kit wako Wako 291-5031
Thiamine HCl Sigma-Aldrich T1270
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Bio-rad 1703940JA
Ultra pure water MilliQ For production of ultra pure water

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References

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Furutani, Y., Yoshihara, Y. Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction. J. Vis. Exp. (147), e59292, doi:10.3791/59292 (2019).More

Furutani, Y., Yoshihara, Y. Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction. J. Vis. Exp. (147), e59292, doi:10.3791/59292 (2019).

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