Summary
I detta protokoll introducerar vi en metod för rening av dendritiska filopodia-rika fraktionen från fagocytiska Cup-liknande utskjutande struktur på odlade Hippocampus nervceller genom att dra nytta av den specifika och starka samhörighet mellan en dendritiska filopodial adhesion molekyl, TLCN, och en extracellulär matris molekyl, vitronectin.
Abstract
Dendritic filopodia är tunna och långa utskjutande bygger på aktin glödtråden, och de sträcker sig och dra som om du söker efter ett mål Axon. När dendritiska filopodia etablera kontakt med ett mål Axon, börjar de mognar i taggar, vilket leder till bildandet av en Synapse. Telencephalin (tlcn) är rikligt lokaliserad i dendritiska filopodia och gradvis utesluts från taggar. Överuttryck av TLCN i odlade Hippocampus nervceller inducerar dendritiska filopodia formation. Vi visade att telencephalin starkt binder till en extracellulär matrix molekyl, vitronectin. Vitronectin-belagda mikropärlor inducerad fagocytos kopp bildas på neuronala dendriter. I fagocytos Cup, tlcn, tlcn-bindande proteiner såsom fosforylerade Ezrin/radixin/moesin (Phospho-ERM), och F-Actin ackumuleras, vilket tyder på att komponenterna i fagocytos Cup liknar dendritiska filopodia. Således utvecklade vi en metod för rening av fagocytos Cup istället för dendritiska filopodia. Magnetisk polystyren pärlor var belagda med vitronectin, som är rikligt närvarande i kulturen medium Hippocampus nervceller och som inducerar fagocytos Cup formation på neuronala dendriter. Efter 24 h av inkubering, de fagocytos kopparna var milt solubilized med rengöringsmedel och samlas med hjälp av en magnet separator. Efter tvättning av pärlor, var bindande proteiner elueras och analyseras med silver färgning och Western blotting. I bindnings delen var tlcn och aktin rikligt närvarande. Dessutom var många proteiner som identifierats från fraktionen lokaliserade till dendritiska filopodia; Sålunda, vi kallade den bindande fraktionen som dendritiska filopodia-rika fraktion. Den här artikeln beskriver detaljer om reningsmetoden för den dendritiska filopodia-rika fraktionen.
Introduction
Dendritic filopodia tros vara föregångare till SPINES. Actin glödtrådar i dendritiska filopodia reglera deras förlängning och indragning1,2,3. Efter kontakt med en Axon, valda dendritiska filopodia börjar sin mognad i taggar, och en synaps bildas4,5. Komponenterna i taggar har fastställts från omfattande analys av postsynaptiska densitet fraktioner6,7, medan komponenterna i dendritiska filopodia fortfarande i stort sett okända. Det har visats att telencephalin (tlcn), ERM, syngap, ras, PI3 kinas, akt, mTOR, Polo-liknande Kinas 2, camkii, syndecan-2, paralemin-1, ARF6, och EphB reglera dendritiska filopodia formation5,8,9 ,10,11, medan en metod inte har utvecklats för en omfattande analys av molekyler som finns i dendritiska filopodia.
Tlcn (ICAM-5) är uttryckligen uttrycks av taggig nervceller i de mest rostralt hjärn segmentet, den telencephalon12. TLCN har 9 ig-liknande domäner i sin extracellulära regionen, en transmembranregion, och en cytoplasmisk svans13. Tlcn binder till aktie (VN) och LFA-1 integrin i dess extracellulära regionen, till presenilin i dess transmembranregionen, och till Phospho-ERM och α-actinin i dess cytoplasmiska region5,8,14,15 ,16. Tlcn binder till aktin cytoskelettet genom Phospho-ERM på spetsarna av dendritiska filopodia och α-actinin i taggar och dendritiska axlar8,16.
Vi visade att överuttryck av tlcn förstärkt dendritiska filopodia formation och inducerade återgång av taggar till filopodia10. Den konstitutiva aktiva formen av Ezrin bunden till TLCN cytoplasmiska regionen och förstärkt dendritiska filopodia formation8. Sålunda reglerar TLCN dendritiska filopodia formation genom Actin-bindande proteiner. Esselens et al. visade att mikrokulor inducerad tlcn ackumulering på odlade nervceller17. Vi visade att fagocytiska Cup strukturer bildades på neuronala dendriter runt VN-belagda mikrokulor i en tlcn-beroende sätt15. Beståndsdelar i dendritiska filopodia liknar de i fagocytos Cup. Det är svårt att samla dendritiska filopodia, men det är relativt lättare att samla fagocytos kopp med magnetiska mikropärlor. Således utvecklade vi en metod för att rena fagocytos Cup istället för dendritiska filopodia18. Här beskriver vi reningsmetoden för den dendritiska filopodia-rika fraktionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommitté RIKEN Wako.
1. kultur av hippocampus nervceller
- Beredning av odlingssubstrat
- Beredning av 200x vitamin mix. Lös 100 mg D-pantotensyra hemikalciumsalt, 100 mg kolinklorid, 100 mg folsyra, 180 mg i-inositol, 100 mg niacinamide, 100 mg pyridoxal HCl, och 100 mg tiamin HCL i 500 ml av ultrarent vatten med hjälp av en magnetisk omrörare. Lösningen är inte helt upplöst. Blanda försiktigt, alikvot i 50 mL rör och förvara vid-20 ° c.
- Beredning av riboflavin lösning. Lös 100 mg riboflavin i 500 ml ultrarent vatten med hjälp av en magnetisk omrörare. Lösningen är inte helt upplöst. Blanda försiktigt, alikvot i 50 mL rör och förvara vid-20 ° c.
- Beredning av 1 M CaCl2. Lös 7,35 g CaCl2· 2H2O i 50 ml ultrarent vatten med hjälp av en magnetisk omrörare.
- Beredning av minsta nödvändiga medium (MEM). Lös 400 mg KCL, 6800 mg NaCl, 2 200 mg NaHCO3, 158 mg NaH2Po4· 2H2O, 7000 mg D-glukos, och 200 mg MgSO4-7h2O i 950 ml av ultrarent vatten med hjälp av en magnetisk omrörare.
- Titrera 1,8 mL 1 M CaCl2 till MEM i ett drop-by-Drop sätt med hjälp av en 1 ml Pipettera med en konstant agitation på en magnetisk omrörare. Ställ in MEM på pH 7,25 med 1 mol/L HCl.
- Tillsätt 5 mL 200x vitamin blandning och 200 μL riboflavin-lösning till MEM. Justera volymen av lösningen till 1 000 ml med ultrarent vatten. Filtrera lösningen med ett 0,22 μm filtersystem och förvara det vid 4 ° c.
- Beredning av 10X DNase-I lagerlösningar. Lös 100 mg DNase-i i 12,5 mL Hanks balanserade saltlösning (HBSS), filtrera genom ett filter på 0,22 μm, alikvot i 1,5 mL-rör och förvara rören vid-20 ° c.
- Beredning av cytosin β-D-arabinofuranoside (ara-C) stamlösning. Lös 25 mg Ara-C i 8,93 mL ultrarent vatten (slutkoncentration på 10 mM), filtrera genom ett 0,22 μm-filter, alikvot i 1,5 mL-rör och förvara vid-20 ° c
- Beredning av plätering medium. Blanda 1 mL av den Amino Acid lösningen, 750 μL 1 M HEPES, 1 mL B27, 125 μL av 200 mM glutamin, 250 μL av penicillin/streptomycin, 2,5 mL av fetalt bovint serum (FBS), och 44,375 mL av MEM i en 50 mL tub.
- Beredning av stopp medium. Blanda 1 mL med aminosyran lösning, 750 μL 1 M HEPES, 5 mL FBS (slutlig 10%) och 43,25 mL MEM i en 50 mL tub.
- Beredning av poly-L-lysine-belagda rätter
- Coat 35 mm plast cellkultur rätter med 0,2 mg/mL av poly-L-lysin hydrobromid för 1 dag vid 25 ° c.
Anmärkning: Poly-L-lysin bör inte användas i stället för Poly-L-lysin hydrobromid. - Tvätta rätterna med 2 ml ultrarent vatten 3 gånger. Inkubera rätterna med 1,5 mL stopp medium vid 25 ° c fram till användning.
- Coat 35 mm plast cellkultur rätter med 0,2 mg/mL av poly-L-lysin hydrobromid för 1 dag vid 25 ° c.
- Dissektion av hippocampus nervceller från mus embryo
- Vävnad källa av hippocampus nervceller. Dissekera Hippocampus från vildtyp och TLCN-bristfällig C57BL6/J möss på embryonala dagar 16-17 enligt metoden för LU et al.19.
- Inkubera dissekerade hippocampi i 0,25% trypsin och 1x DNaseI i HBSS innehållande 15 mM HEPER, pH 7,2 för 15 min vid 37 ° c med agitation var 3 min. ta bort lösningen. Inkubera hippocampi i 10 mL stopp medium för att inaktivera trypsin vid 4 ° c i 5 min.
- Flytta hippocampi till 10 mL färskt stopp medium och inkubera vid 4 ° c i 5 min. flytta hippocampi till 10 mL färskt stopp medium och inkubera vid 4 ° c i ytterligare 5 min. flytta hippocampi till 900 μL av stopp mediet och 100 μL av 10X DNaseI i en 15 mL-röret. Separera hippocampi i isolerade nervceller genom att Pipettera 20 gånger med en 1 mL pipet.
Anmärkning: Spetsen på 1 mL Pipettera vidrör något botten av 15 mL röret under dissociation av hippocampi. - Tillsätt 9 mL pläteringsmedium, och filtrera genom en 70 μm cell SIL i en 50 mL tub. Räkna antalet celler med hjälp av en hemocytometern och justera till 3,5 x 104 celler/ml i plätering medium.
- Aspirera stopp medium från Poly-L-lysine-belagda rätter. Platta cellerna på Poly-L-lysine-belagda rätter på 7 x 104 celler/maträtt (2 ml/fat).
- Efter 60-64 h av inkubation under 5% CO2 vid 37 ° c, tillsätt 2 μl Ara-C stamlösning (slutlig 10 μm) till nervceller, och skaka skålen långsamt. Håll kultur rätterna i en fuktad låda utan att ändra odlingsmediet under 5% CO2 vid 37 ° c.
2. rening av dendritiska Filopodia-rik fraktion
- Efter 13 dagar in vitro (DIV), tillsätt magnetisk polystyren mikropärlor (3 x 106 partiklar/maträtt) till 20 rätter som innehåller odlade nervceller. Efter 1 dag, tvätta nervceller i 1 mL PBS med agitation 3 gånger för att ta bort medium och obundna mikropärlor. Efter avlägsnande PBS, lyse nervceller med 500 μl/maträtt av lysis buffert (PBS som innehåller 0,01% Triton X-100, EDTA-fri proteashämmare cocktail, och fosfatas hämmare cocktail).
- Samla in lysat med en cell skrapa och flytta lysate till låg proteinbindnings-mikrorör (10 rör). Ställ rören på en magnet separator och vänta i 1 min. samla supernatanten och använda den som obunden fraktion för silver färgning och Western blot-analys.
- Överför pärlorna till en ny mikrotub med låg proteinbindning, som sätts på en magnetisk separator, och ta bort supernatanten helt. Tillsätt 500 μL lyseringsbuffert och tvätta pärlorna med en Vortex mixer för 15 s. Ställ in röret på en magnet separator, vänta i 1 min, ta bort supernatanten och tillsätt 500 μL lyseringsbuffert. Upprepa tvättning av pärlorna 10 gånger och ta bort supernatanten.
- Elute proteiner bundna till pärlorna (den bundna fraktionen) genom tillsats av 50 μL 1x SDS prov buffert (62,5 mM Tris HCl, pH 6,8, 2,5% SDS och 10% glycerol) och koka röret vid 98 ° c i 5 min. Centrifugera röret vid 860 x g för 10 s och Ställ in röret på en magnetisk separator för 1 min. samla supernatanten och använda den som den bundna fraktionen.
Anmärkning: Protokollet kan pausas här. - Mät proteinkoncentrationerna av obundna och bundna fraktioner av BCA-proteinanalysen. Visualisera proteinlösningar med bromfenolblått och justera koncentrationen till 5 ng/μL för SDS-PAGE.
3. silver färgning och Western blot-analys
- Separera de bundna och obundna fraktionerna (50 ng) med SDS-PAGE med en 5-20% gradient gel. Silver-fläcken gelen.
- Western blot med anti-tlcn-C (1/3000), anti-bovint aktie (1/5000), anti-Actin (1/1000), och anti-α-tubulin (1/1000) som primära antikroppar och HRP-konjugerat get anti-kanin IgG (1/5000) som sekundär antikropp. Visualisera antigener med hjälp av kemiluminescent Western blotting Detection reagens och en av kemiluminiscensanalysatorn av Imager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I odlade Hippocampus nervceller, TLCN var rikligt lokaliserad till dendritiska filopodia, skaft, och Soma och samlokaliserade med F-Actin (figur 1a, B). När polystyren mikropärlor lades till odlade Hippocampus nervceller, var pärlorna automatiskt belagda med aktie (VN) härstammar från foster bovint serum (FBS) i odlingsmediet; de var främst bundna till dendriter, och de inducerade bildandet av fagocytos koppar (figur 1b-E). Fagocytos koppar baserades på arkformade aktin filament runt mikrokulor på dendriter. Tlcn, Phospho-ERM, och PI (4,5) P2, som är markörer för dendritiska filopodia, är mycket ackumulerade runt pärlor (figur 1d)8,15. Fagocytos koppar bildades endast på vildtyp Hippocampus nervceller, men inte på TLCN-bristfällig Hippocampus nervceller (figur 2A-D). Sålunda, den fagocytos Cup formation var ytterst beroende av närvaron av TLCN i dendriter.
Beståndsdelar i dendritiska filopodia verkade liknar de fagocytiska koppar. Nästa, vi renade fagocytos koppar i stället för dendritiska filopodia. Protokollet för rening av fagocytiska koppar visas schematiskt i figur 3. Magnetiska mikrokulor lades till vildtyp odlade Hippocampus nervceller, som inducerar bildandet av fagocytiska Cup strukturer. De fagocytiska Cup strukturerna var lyserade med ett svagt rengöringsmedel. Mikropärlorna samlades in efter Lys med hjälp av en magnet separator. Efter tvättning av pärlorna, var deras bindande proteiner kokt och eluerade i en SDS prov buffert.
Mängden proteiner i den bundna och obundna fraktionen mättes med hjälp av BCA-proteinanalyssatsen. Samma mängd proteiner i obundna och bundna fraktioner separerades av SDS-PAGE och färgas av silver färgning (figur 4a). Protein bands mönstren var nästan desamma för de obundna och bundna fraktionerna, men intensiteterna vid 50 och 70 kDa i den bundna fraktionen var lägre än i det obundna fraktionen. Dock var bandets intensitet inte uppenbarligen annorlunda mellan obundna och bundna fraktioner som utarbetats från TLCN-bristfällig kultur Hippocampus nervceller. För att bekräfta rening av fagocytos Cup strukturer, vi utförde västerländska blotting med anti-TLCN-C, anti-bovint vitronectin, anti-Actin, och anti-α-tubulin (figur 4b). TLCN och VN upptäcktes främst i den bundna fraktionen. Actin, Ezrin, Gαq, PLCβ1, MAP-2 och spectrin upptäcktes både i de bundna och obundna fraktionerna. Moesin, PSD-95, α-actinin och α-tubulin upptäcktes i det obundna fraktionen.
Figur 1: lokalisering av tlcn och F-Actin i dendritiska filopodia och fagocytos koppar. A) immunofluorescensfärgning av dendriter av en odlad Hippocampus neuron som uttrycker gapvenus med anti-GFP-antikropp (blå i en sammanfogad bild), anti-tlcn-antikropp (röd i en sammanfogad bild) och phalloidin (grön i en sammanfogad bild). Tlcn och F-Actin observeras rikligt i dendritiska filopodia. (B, C) Bildandet av fagocytos Cup strukturer på neuronala dendriter. Fluorescerande mikropärlor (blå i sammanslagna bilder av B, C) läggas till odlade Hippocampus nervceller fäster starkt på dendriter och inducera ansamling av TLCN (röd i sammanslagna bilder av B, C) och F-Actin (grön i sammanslagna bilder av B, C). (D) en lateral bild av en dendritiska fagocytos kopp rekonstruerad från konfokala bilder avslöjar tlcn (röd i sammanslagna bilder av d) som omger fluorescerande pärla (blå i sammanslagna bilder av d). Een dendritisk fagocytisk kopp som induceras av en magnetisk mikropärla fäst på en neuronala Dendrit och immunostained med anti-VN antikropp (blå i sammanslagna bilder av e), anti-tlcn antikropp (röd i sammanslagna bilder av e) och phalloidin (grön i sammanslagna bilder av E). skalstreck = 1 μm i (D); 2 μm i (A), (C) och (E); och 20 μm i (B). Denna siffra har modifierats från en tidigare studie18. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: TLCN-beroende bildning av fagocytisk kopp-liknande struktur. (a-D) Triple fluorescens-bilder av vildtyp (WT; A, C) och TLCN-brist (KO; C, D) nervceller som behandlats med VN-belagda fluorescerande pärlor (röd i sammanslagna bilder av A, B, C, D) och märkta med anti-TLCN antikropp (grön i sammanslagna bilder av A, B, C, D) och anti-fosho-ERM antikropp (blå i sammanslagna bilder av A, B) eller Alexa488-phalloidin (blå bilder av C, D). Skalstreck = 5 μm. Denna siffra har modifierats från en tidigare studie15. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: ett Schematiskt diagram som illustrerar Reningsproceduren för den dendritiska filopodia-rika fraktionen. Magnetiska mikrokulor lades på odlade Hippocampus nervceller att inducera bildandet av dendritiska fagocytos koppar. Efter 1 dag av inkubering, var nervceller solubilized med lysis buffert som innehåller 0,01% Triton X-100. Pärlorna separerades från den obundna fraktionen med hjälp av en magnet separator. Efter tvättning var de bundna proteinerna eluerade med SDS prov buffert och används som den bundna fraktionen. Röd: VN, grön: TLCN, andra färger: bundna proteiner. Denna siffra har modifierats från en tidigare studie18. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: bekräftelse av fagocytos Cup fraktion. A) Silver färgning av proteiner i de obundna och bundna fraktionerna av Mikropärlorna. Samma mängd (50 ng) av proteiner i obundna och bundna fraktioner renas från vildtyp (WT) och TLCN-bristfällig (TLCN KO) Hippocampus nervceller var åtskilda av SDS-sida och visualiseras med silver färgning. Banalys av obundna och bundna fraktioner av Western blot. Samma mängd (50 ng) av proteiner separerades med SDS-PAGE och utsattes för Western blot-analys med anti-TLCN, anti-VN, anti-Actin, anti-Ezrin, anti-moesin, anti-Gαq, anti-PLCβ1, anti-MAP-2, anti-spectrin, anti-PSD-95, anti-α-actinin, och anti-α-tubulin-antikroppar. Observera att TLCN, VN, Actin, Ezrin, PLCβ1, MAP-2 och spectrin observeras i den dendritiska filopodia-rika fraktionen. Denna siffra har modifierats från en tidigare studie18. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi utvecklade en reningsmetod för den dendritiska filopodia-rika fraktionen med hjälp av affinitet mellan celladhesionmolekylen TLCN och det extracellulära matrix proteinet vitronectin. Jämfört med PSD fraktion, det kan vara möjligt att identifiera de synaptiska proteiner som verkar på omogen synapsen från dendritiska filopodia-rika fraktionen. Sålunda, beståndsdelarna i dendritiska filopodia-rika fraktionen skiljer sig från de av PSD fraktion av 74%. Skiljer sig från PSD fraktion, vi använde odlade Hippocampus nervceller att aktivt bilda fagocytos koppar, och cellerna måste vara vid liv. För att bilda fagocytos Cup, använde vi samspelet mellan TLCN och vitronectin. TLCN uttrycket är begränsad i telencephalon. Sålunda, vi kan inte använda odlade nervceller som härrör från cerebellär. Men om vi päls pärlorna med olika proteiner, denna aktivitet-beroende reningsmetod kan tillämpas på cerebellär nervceller. Till exempel, när N-terminalen domän glutamat receptor delta2-belagda mikropärlor appliceras på cerebellär granule celler, presynaptiska neurexin och cbln1 identifierades från bindande proteiner. Därför kan denna aktivitetsberoende metod användas om beläggnings proteinerna ändras. Eftersom tillgången på vitronectin-belagda mikrokulor är begränsad till hjärnan slice och hjärnvävnad, fagocytos koppar bildas inte effektivt. Således, framtida uppgifter är att utveckla reningsmetoden för dendritiska filopodia-rika fraktionen från hjärnan slice och vävnad.
I detta protokoll, låg densitet kultur tillstånd används för Hippocampus nervceller, och tillväxten av gliaceller celler hämmas av tillsats av Ara-C10,20,21. Hippocampus nervceller odlas i MEM utarbetats av oss själva, men inte i neurobasal medium, som ofta används för kulturen i hippocampus nervceller. Hippocampus nervceller dör ofta av 14 DIV när odlade på neurobasal medium, vilket tyder på att det neurobasala mediet inte är lämplig för vår låg densitet kultur skick. Dessutom är en viktig aspekt av låg densitet kultur beläggning skålen med poly-L-lysine hydrobromid, som inte kan ersättas med poly-L-lysin.
För att få tillräcklig mängd proteiner från dendritiska filopodia-rika fraktionen, antalet Hippocampus nervceller och magnetiska mikropärlor är viktiga faktorer. För immunofärgning dendritiska filopodia, Hippocampus nervceller var pläterade på en 35 mm skålen på 5,6 x × 104 celler/maträtt, medan nervceller var pläterade på 7,0 x 104 celler/maträtt för rening av dendritiska filopodia-rika fraktion. Vid 14 DIV, nästan inga Hippocampus nervceller överlappade vid 5,6 x 104 celler/maträtt för immunofärgning, medan många av hippocampus nervceller delvis överlappade med andra nervceller på 7,0 x 104 celler/maträtt för rening av dendritiska filopodia-rika Bråkdel. Emellertid, dendritiska filopodia var rikligt närvarande vid båda tätheter av hippocampus nervceller. Hög densitet kulturer av hippocampus nervceller ofta mogna snabbare än låg densitet odlade Hippocampus nervceller; Sålunda, justera tätheten av hippocampus nervceller till låg densitet kultur är oumbärlig för att få dendritiska filopodia-rika fraktion. Microbeads lades till 1 x 106 mikrokulor/skålen för immunofärgning och vid 3 x 106 mikrokulor/maträtt för rening av dendritiska filopodia-rika fraktionen. För rening av fraktionen, när en tillräcklig mängd av pärlor lades, obundna pärlor spolades ut från Hippocampus nervceller.
I detta protokoll var mikrokulor automatiskt belagda med VN, som finns i odlingsmediet. Emellertid, mikrokulor kan vara belagda med rekombinant VN och läggas till Hippocampus nervceller. Eftersom VN är en mycket klibbigt protein, VN-belagda mikropärlor bildar enkelt aggregat. Sålunda, VN-belagda mikropärlor är sonicated och pipetteras för att separera från varandra strax före tillägg till Hippocampus nervceller.
Vi har tidigare visat att VN-belagda mikropärlor inducerar fosfor-ERM, PI (4,5) P2, och F-Actin tillsammans med tlcn ackumulering15. När den dendritiska filopodia-rika fraktionen analyserades av Western blotting, upptäcktes Phospho-ERM inte av anti-Phospho-ERM polyklonala antikropp och upptäcktes något av anti-Ezrin och anti-moesin monoklonala antikroppar. Det förefaller som om känsligheten hos de monoklonala antikropparna var högre än den anti-fosho-ERM-polyklonala antikroppen. Dessutom var ERM proteiner lokaliserade till nästan alla regioner i hippocampus nervceller, men Phospho-ERM proteiner var endast lokaliserade till spetsen av dendritiska filopodia och fagocytos Cup. Det anses att mängden Phospho-ERM-bindning till TLCN är begränsad jämfört med mängden nonfosforylerad ERM. Sålunda, upptäckten av Phospho-ERM i dendritiska filopodia-rika fraktion verkar vara svårt.
För att lossa Mikropärlorna från cellmembranet använde vi ett svagt rengöringsmedel, 0,01% Triton X-100. Tlcn är kopplat till aktin filament genom Phospho-ERM i dendritiska filopodia och fagocytiska Cup strukturer. För att rena proteiner som är indirekt kopplade till tlcn genom aktin filament använde vi ett svagt rengöringsmedel i detta protokoll. Koncentrationen av Triton X-100 kan dock ändras till en högre koncentration beroende på syftet med experimentet.
Esselens et al. har visat att fagocytos upptag av mikrokulor inducerad tlcn, pip2, och F-Actin ackumulering i odlade Hippocampus nervceller17. Enligt vår analys via konfokalmikroskopi efter 24 h inkubering med mikropärlor, var Mikropärlorna inte helt tas upp i cytoplasman. TLCN och PIP2, som är lokaliserade till cellmembranet, var lokaliserade runt pärlor, särskilt på botten av mikropärlor. Dessutom, 319 proteiner som identifierats från dendritiska filopodia-rika fraktionen analyserades med hjälp av KEGG Pathway analys. Fagocytos och autofagi vägar upptäcktes inte, men cytoskelettet organisation, exocytosis, Actin-filament-baserad process, och Microtubule-baserad process var signifikant berikas i fraktionen18.
Den molekylära mekanismen för dendritiska filopodia formation är fortfarande i stort sett okänd. Analys av fagocytos Cup struktur kan hjälpa till att förstå molekylära beståndsdelar och dynamiska funktioner i dendritiska filopodia. Det skulle vara intressant att analysera dendritiska filopodia-rika fraktion beredd från musmodeller av neuroutvecklingsrelaterade och neuropsykiatriska störningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Shigeo Okabe och Hitomi Matsuno för låg densitet kulturen i hippocampus nervceller, Masayoshi Mishina för TLCN-brist möss, Sachiko Mitsui och Momoko Shiozaki för tekniskt stöd, och medlemmar av Yoshihara laboratorium för hjälpsamma diskussioner . Detta arbete stöddes av JSPS KAKENHI Grant nos. JP20700307, JP22700354, och JP24500392 och MEXT KAKENHI Grant nos. JP23123525 till YF och JP20022046, JP18H04683 och JP18H05146 till YY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 1.7 mLl Low Binding MCT | Sorenson BioScience | 39640T | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 2530149 | |
| 35 mm plastic cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| Anti-actin | Sigma-Aldrich | A-5060 | |
| Anti-alpha-Actinin | Sigma-Aldrich | A-5044 | |
| Anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T-9026 | |
| Anti-Ezrin | Sigma-Aldrich | clone3C12, SAB4200806 | |
| Anti-Galphaq | Santacruz | sc-393 | |
| Anti-MAP2 | Chemicon | clone AP20, MAB3418 | |
| Anti-Moesin | Sigma-Aldrich | clone 38/87, M7060 | |
| Anti-PLCbeta1 | Santacuz | sc-5291 | |
| Anti-PSD95 | MA2 | ABR | |
| Anti-Spectrin beta | Chemicon | MAB1622 | |
| B27 | Gibco | 0080085SA | |
| BCA protein assay kit | Thermo | 23227 | |
| Bromophenol blue | Merck | 1.08122.0005 | |
| Calcium chrolide, hydrous | Wako | 038-19735 | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Choline chloride | Sigma-Aldrich | C7527 | |
| Complete EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C-6645 | |
| DNase-I | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P5155 | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo | 12321D | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
| e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel | ATTO | E-T520L | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| HRP-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| i-Inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | |
| LAS-1000 mini | Fuji Film | LAS-1000 mini | For detection of luminescence from WB membrane |
| Magnetic polystyrene microbeads | Sperotech | PM-20-10 | |
| MEM amino acid solution | Gibco | 11130-051 | 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine |
| Mini-slab size electrophoresis system | ATTO | AE-6530 | |
| Niacinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Penicilin / Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 4906845001 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Nacali | 28360-14 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P6155 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R9504 | |
| Silver Stain 2 Kit wako | Wako | 291-5031 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T1270 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 1703940JA | |
| Ultra pure water | MilliQ | For production of ultra pure water |
References
- Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1. Journal of Neuroscience. 18 (21), 8900-8911 (1998).
- Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia. Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).
- Ziv, N. E., Smith, S. J. Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation. Neuron. 17 (1), 91-102 (1996).
- Lohmann, C., Bonhoeffer, T. A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia. Neuron. 59 (2), 253-260 (2008).
- Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Current Opinion in Neurobiology. 19 (2), 146-153 (2009).
- Bayes, A., et al. Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins. PLoS One. 7 (10), e46683 (2012).
- Bayes, A., et al. Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density. Nature Neuroscience. 14 (1), 19-21 (2011).
- Furutani, Y., et al. Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation. Journal of Neuroscience. 27 (33), 8866-8876 (2007).
- Mao, Y. T., et al. Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase. Neuron. 98 (4), 767-782 (2018).
- Matsuno, H., et al. Telencephalin slows spine maturation. Journal of Neuroscience. 26 (6), 1776-1786 (2006).
- Raemaekers, T., et al. ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation. The EMBO Journal. 31 (15), 3252-3269 (2012).
- Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (11), 3921-3925 (1987).
- Yoshihara, Y., Mori, K. Telencephalin: a neuronal area code molecule? Neuroscience Research. 21 (2), 119-124 (1994).
- Annaert, W. G., et al. Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins. Neuron. 32 (4), 579-589 (2001).
- Furutani, Y., et al. Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin. Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 39041-39049 (2012).
- Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth. Journal of Cell Biology. 119 (Pt 15), 3057-3066 (2006).
- Esselens, C., et al. Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway. Journal of Cell Biology. 166 (7), 1041-1054 (2004).
- Furutani, Y., Yoshihara, Y. Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27 (2018).
- Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).
- Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit. The Journal of Neuroscience. 19 (18), 7781-7792 (1999).
- Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture. European Journal of Neuroscience. 10 (6), 2192-2198 (1998).
