Summary
Gli organoidi sviluppati dalle ghiandole mammarie del topo sono stati irradiati e caratterizzati per valutare i tratti epiteliali e le interazioni con le cellule immunitarie. Gli organoidi irradiati possono essere utilizzati per valutare meglio le interazioni delle cellule cellulari che possono portare al reclutamento di cellule tumorali nel tessuto normale irradiato.
Abstract
Gli organoidi derivati dal tessuto digerito sono costrutti tridimensionali (3D) multicellulari che ricapitolano meglio le condizioni in vivo rispetto ai monostrati cellulari. Anche se non possono modellare completamente la complessità in vivo, mantengono alcune funzionalità dell'organo originale. Nei modelli tumorali, gli organoidi sono comunemente usati per studiare l'invasione delle cellule tumorali. Questo protocollo mira a sviluppare e caratterizzare gli organoidi dal normale e irradiato tessuto della ghiandola mammaria del topo per valutare la risposta alle radiazioni nei tessuti normali. Questi organoidi possono essere applicati a futuri studi di cancro in vitro per valutare le interazioni delle cellule tumorali con organoidi irradiati. Le ghiandole mammarie sono state resecate, irradiate a 20 GY e digerite in una soluzione di collagenasi VIII. Gli organoidi epiteliali sono stati separati tramite differenziazione centrifuga e gli organoidi 3D sono stati sviluppati in micropiastre 96 e a bassa adesione. Gli organoidi hanno espresso il caratteristico marcatore epiteliale citcheratina 14. L'interazione macrofage con gli organoidi è stata osservata negli esperimenti di co-coltura. Questo modello può essere utile per studiare le interazioni tumorale-stromali, l'infiltrazione delle cellule immunitarie e la polarizzazione dei macrofati all'interno di un microambiente irradiato.
Introduction
Circa il 60% dei pazienti con triplo cancro al seno negativo (TNBC) sceglie la terapia di conservazione del seno (BCT) come forma di trattamento1. In questa modalità di trattamento, il tumore contenente parte del tessuto mammario viene rimosso, e il tessuto normale circostante è esposto a radiazioni ionizzanti per uccidere eventuali cellule tumorali residue. Il trattamento riduce la recidiva in gran parte della popolazione di cancro al seno; Tuttavia, circa 13,5% dei pazienti trattati con TNBC esperienza locoregionale recidive2. Pertanto, studiando come la radiazione può reclutare cellule tumorali circolanti (CTCs) porterà a importanti approfondimenti sulla ricorrenza locale3,4.
Il lavoro precedente ha dimostrato che la radiazione del tessuto normale aumenta il reclutamento di vari tipi di cellule5. Nei modelli preclinici di TNBC, l'irradiazione del tessuto normale ha aumentato il macrofago e successivamente il reclutamento delle cellule tumorali nei tessuti normali5. Stato immunitario influenzato il reclutamento delle cellule tumorali nei siti irradiati, con la migrazione delle cellule tumorali osservata in soggetti immunocompromessi. Ricapitolando queste interazioni utilizzando organoidi derivati da ghiandole mammarie permetterà l'osservazione della migrazione cellulare e interazioni cellulare-stromali in tempo reale con microscopia e imaging cellulare vivo per determinare il ruolo del danno da radiazioni in alterare comportamento delle cellule tumorali.
Gli organoidi mammari del topo hanno aiutato a chiarire i passi chiave nello sviluppo della ghiandola mammaria. Un organoide mammario è un costrutto tridimensionale multicellulare di epitelio mammario isolato che è più grande di 50 μm6,7,8,9,10. Usando organoidi epiteliali primari, Simian et al. ha valutato i fattori necessari per la ramificazione nella ghiandola mammaria7. Ha scoperto che la diffusione può avvenire senza una transizione epiteliale a mesenchimale, fornendo informazioni sulla cascata metastatica8. I metodi per la generazione e la caratterizzazione di organoidi dal tessuto della ghiandola mammaria sono ben consolidati6,11,12,13. Tuttavia, a nostra conoscenza, non sono stati segnalati metodi per la coltivazione di organoidi irradiati da ghiandole mammarie. Un protocollo per la coltivazione e la caratterizzazione di organoidi irradiati sarebbe un passo critico nella ricapitolazione del reclutamento di cellule immunitarie e tumorali indotta da radiazioni.
In questo articolo riportiamo un metodo per coltivare e caratterizzare organoidi epiteliali mammari irradiati in micropiastre a bassa adesione rivestite con un polimero idrofilo che supporta la formazione di sferoidi. Questi organoidi sono stati co-coltivati con macrofagi per esaminare la cinetica di infiltrazione delle cellule immunitarie. Questo lavoro può essere esteso per includere organoidi co-coltura con cellule adiposo per ricapitolare caratteristiche mammarie, cellule di cancro al seno per visualizzare il reclutamento delle cellule tumorali, e CD8 + cellule T per studiare le interazioni del tumore-immunitarie. I protocolli precedentemente stabiliti possono essere utilizzati per valutare gli organoidi irradiati. I modelli precedenti che cocoltivano organoidi mammari e cellule immunitarie hanno fatto luce sui meccanismi di metastasi e diffusione. Ha riscontrato che la regolazione delle cellule T CD4 + dei macrofagi associati al tumore ha migliorato un fenotipo metastatico di adenocarcinomi mammari14. I modelli di co-coltura sono stati utilizzati anche per chiarire i meccanismi di sviluppo biologico. Chiarito il ruolo delle cellule T CD4 + come down-regolatori di organogenesi mammaria15. Tuttavia, il nostro gruppo è il primo a stabilire una procedura per visualizzare come l'irraggiamento del tessuto normale influenza il comportamento delle cellule immunitarie. Poiché l'irraggiamento tissutale normale è stato dimostrato per migliorare il reclutamento delle cellule tumorali5, questo protocollo può essere ulteriormente sviluppato per analizzare come il comportamento delle cellule tumorali è alterato dall'irradiazione di tessuti e cellule normali, portando ad una maggiore comprensione del recidiva di cancro.
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Protocol
Gli studi sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida e i protocolli istituzionali approvati dal Comitato istituzionale di cura e uso degli animali Vanderbilt University.
1. preparazione di topi e l'acquisizione di cellule (adattato da Nguyen-Ngoc et al.11)
- Sacrificio atimici nu/nu topi (8-10 settimane di età) utilizzando Co2 asfissia seguita da lussazione cervicale. Pulire la pelle utilizzando 70% etanolo.
- Reinviare le ghiandole mammarie addominali e inguinali dai topi utilizzando forbici pre-sterilizzate e pinze. Rimuovere i linfonodi prima della resezione. Risciacquare in sterile 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (Figura 1a).
- Posizionarlo in provette da 15 mL con 10 mL di Dulbecco ' s Modified Eagle media/miscela nutriente F12 (DMEM/F12) per il trasporto. I campioni possono essere conservati durante la notte a 4 ° c o trasformati immediatamente. Continuate a ghiaccio.
- Irradiare campioni a 20 GY utilizzando una fonte di cesio (Figura 1B).
- 45 minuti dopo l'irradiazione, posizionare le ghiandole mammarie in una piastra cellulare sterile da 35 mm e tritare con scalpelli (Figura 1C, D). Mince con circa 40 colpi fino a quando il tessuto si rilassa e si ottengono pezzi che non sono più grandi di circa 1 mm2 in zona.
- Trasferire alla soluzione di collagenasi in una provetta da centrifuga da 50 mL. La soluzione di collagenasi è costituita da 2 mg/mL di collagenasi (vedere tabella dei materiali), 2 mg/ml di tripsina, 5% v/v di siero bovino fetale (FBS), 5 μg/ml di insulina e 50 μg/ml di gentamicina nei media DMEM/F12. Utilizzare 10 mL di soluzione di collagenasi per mouse.
- Mettere in un bagno d'acqua a 37 ° c, Vortex ogni 10 min per 30-60 min. la digestione è completa quando la soluzione di collagenasi è torbida (Figura 1e, F).
- Ruotare la soluzione digerita a 450 x g per 10 minuti a temperatura ambiente (RT). Saranno osservati tre strati. Il supernatante è composto da grasso, lo strato intermedio è una soluzione acquosa, e il fondo è un pellet. Il pellet apparirà rosso in quanto è una miscela di cellule epiteliali, cellule stromali individuali e globuli rossi (Figura 1g).
- Prima del contatto, precoat tutte le pipette, puntali per pipette e provette centrifughe con soluzione di albumina bovina (BSA). La soluzione BSA è costituita da 2,5 w/v% BSA in salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS). Per il pre-rivestimento, semplicemente aggiungere quindi rimuovere la soluzione BSA all'interno della punta della pipetta e tubi. La soluzione BSA può essere riutilizzata, anche se deve essere filtrata sterile prima di ogni esperimento.
- Per un ulteriore recupero, trasferire il supernatante ad un nuovo tubo da 15 mL rivestito con BSA. Pipettare su e giù vigorosamente per disperdere lo strato di grasso. Centrifugare a 450 x g per 10 minuti a RT. aspirare il supernatante, lasciando una piccola quantità di media nel tubo per evitare di aspirare il pellet cellulare.
- Aspirare lo strato acquoso dal tubo con il pellet originale.
- Aggiungere 10 mL di DMEM/F12 al tubo con il pellet originale e trasferire al secondo tubo. Pipettare vigorosamente per combinare e risospendere i due pellet.
- Centrifugare a 450 x g per 10 minuti a RT. aspirare il supernatante e aggiungere 4 ml di DMEM/F12 al tubo.
- Aggiungere 40 μl di deossiribonucleasi (DNAse) alla sospensione e agitare delicatamente a mano per 2-5 min alla soluzione RT. DNAse è costituito da 4 U/ml di dnasi in DMEM/F12.
- Aggiungere 6 mL di DMEM/F12 e pipettare accuratamente. Centrifugare il tubo a 450 x g per 10 min a RT.
- Aspirare il supernatante al marchio 0,5 mL. Risospendere in 10 mL di DMEM/F12 e pipettare accuratamente.
- Impulso a 450 x g e Stop 4 s dopo aver raggiunto quella velocità.
- Ripetere i passaggi 1.16-1.17 altre tre volte per purificare gli organoidi tramite differenziazione centrifuga. Il pellet dovrebbe ora essere un colore Biancaneve costituito solo da organoidi epiteliali (Figura 1h).
Nota: gli organoidi possono anche essere filtrati utilizzando filtri a rete sterile da 40 μm. Dopo il passo 1,16, pipettare i supporti contenenti organoidi attraverso un filtro in una provetta da centrifuga, quindi risciacquare con 5 o 10 mL di supporti DMEM/F12. Capovolgere il filtro su una nuova provetta centrifuga da 50 mL. Passare 10 mL di media DMEM/F12 attraverso, andando il modo opposto per risciacquare qualsiasi retentate. Il retentato deve consistere in organoidi, e il filtrato deve consistere principalmente di cellule stromali, che possono essere scartate o mantenute se lo si desidera.
2. determinare la densità e placcatura organoidi
- Risospendere il pellet in 10 mL di DMEM/F12. Pipettare accuratamente per creare una soluzione omogenea.
- Trasferire 50 μL in una capsula di Petri da 30 mm e visualizzarla sotto un microscopio a contrasto di fase a 20x. Contare il numero di organoidi con un contatore tally.
Nota: qui i puntali per pipette sono stati costantemente utilizzati con un diametro minimo di 457 μm, che è 5-10 volte il diametro degli organoidi che vengono seminati. Per il trasferimento di volumi di 2 mL o più grandi (ad es. passi 1,16 e 2,1), utilizzare pipette sierologiche con diametri della punta superiori a 1.500 μm. - Calcola la densità organoide utilizzando la seguente equazione:
La densità desiderata è 1.000 organoidi/mL per semplificare ulteriormente la diluizione. Se la densità è troppo bassa, centrifugare a 450 x g per 5 min e aspirare media. Aggiungere i supporti necessari per raggiungere 1.000 organoidi/mL e pipettare accuratamente per creare una miscela omogenea.- Per coltivare organoidi in una matrice proteica, i semi organoidi ad una concentrazione di 1 organoide/L in collagene di tipo 1 diluito a 87% o nella membrana seminterrato estratta dal sarcoma del topo Engelbreth-Holm-Swarm. Mentre si lavora con i campioni, tenere il ghiaccio.
- Per congelare gli organoidi, trasferire il volume desiderato in una provetta centrifuga separata. Girare verso il basso a 450 x g per 5 min. aspirate media, e quindi aggiungere lo stesso volume di 90% FBS/10% DMSO. Risospendere gli organoidi e poi l'aliquota in criotubi. Trasferire a-80 ° c e poi all'azoto liquido entro una settimana.
- Per scongelare, riscaldare in un bagnomaria a 37 ° c per un min. Centrifugare a 450 x g per 5 min, quindi aspirare i mezzi di congelamento. Risciacquare con DPBS sterile, quindi centrifugare nuovamente. Aspirate DPBS e aggiungete un supporto organoide.
- Pipettare 50 μL (50 organoidi) in ciascun pozzetto della piastra di adesione bassa (Figura 1I).
- Aggiungere 150 μL di supporto organoide per portare il volume di lavoro totale a 200 μL. il supporto organoide è composto da 1% di penicillina-streptomicina e 1% di insulina-transferrina-selenio (ITS) nei media DMEM/F12.
- Ogni 2 giorni sostituire i supporti con attenzione.
Nota: le piastre a bassa adesione non sono trattate con colture tissutali; Pertanto, le cellule possono essere facilmente staccate. Aspirare lentamente il supporto inclinando la piastra e inserendo la punta della pipetta sul bordo di ogni pozzetto. Lasciare una piccola quantità di media nella parte inferiore del pozzo. Aggiungere lentamente nuovi supporti per evitare di applicare forze di taglio inutili agli organoidi.
3. co-coltura con i macrofagi
- Mantenere GFP o i macrofagi RAW 264,7 etichettati con dTomato nei supporti DMEM completati con 10% FBS e 1% di penicillina-streptomicina. Seme 1 x 104,5 x 104, o 1 x 105 cellule/ml in media organoide.
- Utilizzare il contrasto di fase in tempo reale delle cellule e l'imaging fluorescente per monitorare l'infiltrazione dei macrofiti.
4. colorazione immunofluorescenza degli organoidi
Nota: gli organoidi possono essere macchiati in pozzi a bassa adesione o possono essere trasferiti a vetrini a camera. Per il trasferimento, pipettare delicatamente su e giù fino a quando gli organoidi si sono staccati dalle piastre. Trasferire ai vetrini della camera e incubare per 4-8 h per consentire agli organoidi di aderire alla superficie della piastra.
- Rimuovere il fluido organoide dai pozzetti aspirando con cautela. Fissare i campioni con il 10% di formalina tamponata neutra per 15 minuti in RT.
- Lavare 3X 5 min in 1X PBS. Se lo si desidera, i campioni fissi possono essere conservati a 4 ° c per una settimana per ulteriori macchie.
- Permeabilizzare con 0,1% 4-(1, 1, 3, 3-tetrametilbutil) fenil-polietilenglicole per 5 min.
Nota: per macchiarsi di F-actina, incubare i campioni con colorante nucleare di bisbenzimide diluito 1:1000 e 1,67 nM in 1% in PBS/BSA per 1 h a RT. Quindi, procedere al passaggio 4,8. - Bermeabilize con 0.5 PBS. I campioni possono essere conservati in immagini 4opy e immagini immunofluorescenti. meccanismi che contribuiscono alla RLOCK CTC con il 5% di siero di capra normale in 0,1% PBS/polietilenglicole sorbitan monolaurato (PBST) per 1 h a RT. Lavare 3X 5 min con PBS.
- Incubare con anti-cytokeratin 14 diluito 1:1000, E-cadherin diluito 1:200 o stretto Junction protein One diluito 1:100 in 1% NGS in PBST per 1 h a RT. Lavare 3X 5 min in PBST.
- Incubare con capra anti-coniglio secondario diluito 1:200 con 1% NGS/PBST per 1 h a RT. coprire con un foglio per evitare l'esposizione alla luce.
- Lavare 3X 5 min in PBS. Utilizzare il colorante nucleare (vedere tabella dei materiali) per macchiare i nuclei.
- Lavare 3X 5 min in PBS. Se si utilizza la slitta a camera, montare con un coprioggetti. Conservare avvolto in lamina a 4 ° c per un massimo di 2 settimane.
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Representative Results
Gli organoidi mammari epiteliali irradiati sono stati ottenuti con successo dalle ghiandole mammarie del topo, elaborati e coltivati su piastre a bassa adesione (Figura 1). La resa organoide è stata testata dalla semina in diversi ambienti di crescita (Figura 2a-G). La semina delle cellule direttamente sulla coltura tissutale trattata di piastre cellulari da 10 cm ha prodotto una crescita eccessiva delle cellule fibroblasti. I fibroblasti sono stati identificati sotto microscopia a contrasto di fase in o vicino allo stesso piano di messa a fuoco degli organoidi, e sono rapidamente cresciuti da organoidi placcati in pochi giorni. Una crescita dei fibroblasti è stata osservata anche quando gli organoidi sono stati seminati nella membrana del seminterrato e nelle matrici di proteine del collagene (Figura 2e, F).
Una varietà di condizioni è stata testata nell'ottimizzazione della crescita organoide irradiata (Figura 2h). I tipi di collagenasi i e VIII di Clostridium Histolyticum sono stati usati come enzima nella digestione organoide passo12,16,17. I rendimenti organoidi sono stati significativamente più elevati dopo la digestione con collagenasi VIII. Ciò può essere dovuto ai processi di purificazione utilizzati nella produzione dell'enzima: la collagenasi di tipo I è parzialmente purificata e può causare inutili danni alle proteine e ai recettori delle membrane, portando a una scarsa formazione organoide, alla lisi cellulare o alla digestione eccessiva16 , 17 anni di , 18. non sono state osservate differenze significative nella resa tra gli organoidi irradiati e di controllo.
Gli organoidi irradiati potrebbero essere coltivati in piastre a bassa adesione (Figura 3A-C) o all'interno della membrana seminterrato (Figura 3D-G), ma la crescita più rapida si è verificata in piastre a bassa adesione (Figura 3h). Gli organoidi hanno ricapitolato le caratteristiche della ghiandola mammaria. Le punte di freccia bianche indicano costrutti morfologicamente simili ai condotti e ai lobi19, 20,21 (Figura 3C), che sono fondamentali per la produzione e il trasporto di latte nella ghiandola mammaria21. Tuttavia, ulteriore caratterizzazione è necessaria per confermare questa osservazione. Le tendenze di crescita hanno indicato che gli organoidi non irradiati sono cresciuti più velocemente degli organoidi irradiati (Figura 3h), probabilmente a causa dell'arresto della crescita cellulare risultante da meccanismi di riparazione del danno al DNA; Tuttavia, la tendenza non è stata statisticamente significativa22. È stata osservata una aggregazione occasionale di organoidi a bassa adesione e gli organoidi potevano essere coltivati fino a due settimane prima di dissociarsi.
Gli organoidi hanno espresso caratteristiche epiteliali, che sono state valutate attraverso la colorazione di immunofluorescenza di citocheratina 14 (K14), e-cadherin (e-CAD), e la proteina di giunzione stretta 1 (zo-1)23,24,25 ( Figura 4). Gli organoidi irradiati hanno espresso marcatori epiteliali. K14, un marcatore di mioepitelio23, è stato espresso fortemente sulla superficie degli organoidi irradiati (Figura 4a). Inoltre, e-CAD e ZO-1 sono stati espressi all'interno di giunzioni cellulari di organoidi (Figura 4B, C). Queste proteine sono essenziali per una corretta adesione delle cellule24. Dopo l'irradiazione, gli organoidi continuavano a mantenere le loro caratteristiche epiteliali.
La colorazione fluorescente degli organoidi potrebbe essere visualizzata all'interno di piastre a bassa adesione utilizzando la microscopia a fluorescenza (Figura 5a-D); Tuttavia, la visualizzazione più chiara è stata ottenuta tramite microscopia confocale (Figura 5E-F). L'intensità della fluorescenza totale corretta è stata calcolata sottraendo lo sfondo e normalizzando per area organoide (Figura 5g). Gli organoidi in crescita nelle piastre di adesione a 96 e a bassa aderenza hanno semplificato anche gli esperimenti di co-coltura. Quando è stata seminata a concentrazioni tipiche della ghiandola mammaria, i macrofagi sono co-localizzati con controllo e organoidi irradiati (Figura 6)24,26.
Figura 1. Flusso di lavoro del metodo. A) le ghiandole mammarie sono state resecate dai topi. Sono state utilizzate le ghiandole mammarie addominali e inguinali. B) le ghiandole mammarie sono state irradiate in provette da centrifuga da 50 ml contenenti supporti DMEM/F12. C) le ghiandole mammarie sono state trasferite in piastre sterili a sei pozzetti e tagliate con bisturi chirurgici fino a macinata (D). E) le ghiandole mammarie sono state trasferite in provette da centrifuga da 50 ml contenenti 5 ml di media sterile DMEM/F12 per ghiandola e digerite in una soluzione di collagenasi VIII (F). (G) dopo essere stato trasferito a un tubo da 15 ml, la differenziazione centrifuga è stata utilizzata per rimuovere le cellule stromali, le cellule singole e i globuli rossi, osservati in un pellet rosso (testa a freccia bianca) fino a quando sono stati ottenuti solo organoidi epiteliali bianchi (H ). I). 50 gli organoidi sono stati placcati in 200 μl di media in piastre di adesione 96-well e immagine con microscopia a contrasto di fase la barra di scala rappresenta 50 μm. fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 2. Placcatura organoide in matrici proteiche 3D e in plastica trattata con coltura tissutale. Organoidi seminati in collagene (a) e la membrana seminterrato (B), immagine dopo 84 ore di crescita. La proliferazione dei fibroblasti si è verificata in organoidi placcati in matrice (C, D). Le immagini di contrasto di fase degli organoidi ordinati attraverso la filtrazione sono state ottenute 192 ore dopo la semina. Non sono state osservate differenze significative tra il filtrato (e) e il retentato (F), con la conseguente crescita dei fibroblasti confluenti. Le cellule in e e F sono state seminate su plastica trattata con coltura tissutale. Dopo la tripsinizzazione per 5 minuti a RT, i fibroblasti sono stati rimossi tramite aspirazione; Tuttavia, le cellule epiteliali rimanenti costituivano una coltura monostrato invece di organoidi tridimensionali (G). Le barre di scala per a-G rappresentano 100 μm.H) sono stati testati diversi tipi di collagenasi (I (ci) e VIII (cviii)) e metodi di lavorazione delle cellule (filtrazione e differenziazione centrifuga (cent diff)) e la resa organoide per ghiandola mammaria è stata quantificato (n = 2 ghiandole per CI, filtro; 2 ghiandole per CVIII, filtro; 4 ghiandole per CI, cent diff e 12 ghiandole per CVIII, cent diff). La significatività statistica è stata determinata utilizzando un t-test a due code, non accoppiato, * * * p < 0,0001. Le barre di errore rappresentano un errore standard. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 3. Crescita organoide rappresentativa. Immagini a contrasto di fase di crescita organoide irradiata in piastre a bassa adesione ottenute 20 (A), 44 (B) e 106 (C) ore dopo la semina. Le punte di freccia bianche indicano strutture che hanno una morfologia simile ai condotti e ai lobi. Immagini a contrasto di fase di crescita organoide irradiata nella membrana seminterrato ottenuta 42 (D), 66 (e), 60 (F) e 114 (G) ore dopo la semina. Le barre di scala rappresentano 50 μm. H. Le misurazioni dell'area sono state ottenute in diverse condizioni di crescita: organoidi immediatamente seminati dopo la digestione e la cernita (irradiato (●), controllo (▪)), e organoidi seminate nella membrana seminterrato (irradiato (○), controllo (□)) (n = 3 ghiandole). I calcoli di area sono stati effettuati utilizzando il software ImageJ. Le barre di errore rappresentano un errore standard. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 4. Espressione di marcatore epiteliale su organoidi irradiati. Cytokeratin 14 (K14, verde), un marcatore per lo strato basale di epitelia squamoso e non squamoso, è stato espresso su organoidi irradiati (a). E-cadherin (E-CAD), una proteina essenziale per l'adesione, è stata espressa all'interno delle giunzioni tra le cellule in organoidi irradiati (B). La proteina di giunzione stretta uno (ZO-1) è stata espressa anche all'interno di giunzioni cellulari di organoidi irradiati (C). Le immagini sono state ottenute in vetrini a camera tramite microscopia confocale. Una macchia di acido nucleico è stato utilizzato per visualizzare i nuclei (blu). Tutti gli organoidi sono stati fissati e iminvecchiati dopo una settimana di crescita. Le barre di scala sono 50 μm. fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Espressione di F-actina in organoidi. F-actina (rosso), un MICROFILAMENTO nelle cellule epiteliali, è stato espresso con minore intensità in organoidi non irradiati (a, C, E) rispetto agli organoidi irradiati (B, D, F). Una macchia di acido nucleico è stato utilizzato per visualizzare i nuclei (blu). Le immagini sono state scattate su piastre a bassa aderenza 96 pozzetti (A, B) e a 16 pozzetti (C, D). Le immagini sono state scattate anche con microscopia confocale (E, F). Tutti gli organoidi sono stati fissati e iminvecchiati dopo una settimana di crescita. Le barre di scala sono 50 μm. G. I dati di fluorescenza di Phalloidin da immagini a piastre a bassa adesione sono stati quantificati in ImageJ (n = 3 ghiandole). Le barre di errore indicano un errore standard. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 6. Valutare le interazioni tra cellule cellulari attraverso la co-coltura organoide-macrofage. I macrofagi (rosso) infiltrato controllo (A) e irradiati (B) organoidi. Le barre di scala rappresentano 50 μm. La percentuale media di macrofagi nel campo dell'immagine (C) è stata riportata a 24 ore di co-coltura per il controllo (giallo) e gli organoidi irradiati (arancio) (n = 3 ghiandole per ogni campione). I macrofagi sono stati seminati a concentrazioni di 10.000 cellule/mL, 50.000 cellule/mL e 100.000 cellule/mL, e la loro infiltrazione è stata catturata ogni 30 minuti tramite imaging a fluorescenza a cellule vive. Tutti gli esperimenti di co-coltura sono iniziati 7 giorni dopo la semina organoide iniziale. La significatività statistica è stata determinata utilizzando un t-test a due code, non accoppiato, * p < 0,05, * * * p < 0,0001. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
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Discussion
In questo protocollo, abbiamo sviluppato un metodo per la crescita riproducibile e la caratterizzazione di organoidi mammari irradiati (Figura 1). Una dose di irradiazione di 20 GY è stata applicata allo specchio precedenti modelli in vivo di reclutamento di cellule tumorali5. L'irradiazione delle ghiandole mammarie ex vivo prima della formazione organoide ha permesso di isolare gli effetti di danno da radiazioni senza una corrispondente infiltrazione di cellule immunitarie. Lo sviluppo di un modello di tessuto normale irradiato in vitro consente la visualizzazione in tempo reale delle interazioni cellulari che possono contribuire al reclutamento di CTC indotta da radiazioni11,12.
Seguire attentamente i passaggi 1.5-1.18 è stato fondamentale per massimizzare la resa organoide. Abbiamo aggiunto le aliquote scongelati di collagenasi concentrata alla soluzione digestiva. A causa della natura altamente viscoso della collagenasi concentrata, ci possono essere alcune variazioni di quantità e quindi nell'attività enzimatica, quindi la digestione organoide deve essere attentamente monitorata per evitare l'eccessiva digestione. È anche importante digerire gli organoidi in un tubo da 50 mL in quanto ciò consente un'area di superficie uniforme per la digestione. Altri studi hanno utilizzato la filtrazione per purificare gli organoidi19,23; Tuttavia, abbiamo ottenuto un rendimento molto più elevato purificante con differenziazione centrifuga (Figura 2h). Le pipette pre-vernicianti, i puntali per pipette e i tubi centrifughe con la soluzione BSA sono essenziali per massimizzare la resa. Gli organoidi aderiscono notevolmente alla plastica non rivestita quando l'applicazione della soluzione è trascurata.
Grande cura deve essere presa per evitare aspiranti organoidi. Questo è un rischio che si verifica durante la purificazione, il cambiamento dei media e la colorazione per i marcatori fluorescenti. Utilizzando piastre a bassa adesione per la crescita consente un facile trasferimento di organoidi e rimuove la necessità di organoidi da sezionare in OCT per ulteriore colorazione, una procedura necessaria per la membrana seminterrato incorporato organoidi11. Oltre a benefici da una crescita superiore, semina organoidi irradiati in piastre a bassa adesione richiesto meno passaggi ed era meno tecnicamente impegnativo di coltura organoidi nella membrana seminterrato o collagene. Tuttavia, quando si macchia per i marcatori, può essere utile per visualizzare gli organoidi sotto un microscopio per garantire che l'aspirazione accidentale non si verifichi.
Inoltre, ci sono molte considerazioni che devono essere contabilizzate quando imaging organoidi. All'interno della membrana seminterrato incorporati organoidi, occasionale crescita di fibroblasti possono essere osservati (Figura 2C, D). La proliferazione di fibroblasti in organoidi coltivati in 3D può essere causata da organoidi che fanno contatto con la superficie trattata della coltura tissutale poiché l'adesione conduce alla produzione di fattore di crescita di fibroblasti upregulate nelle cellule aderenti27. È interessante notare che la morfologia di questi fibroblasti è sorprendentemente simile ai pre-adipociti, in quanto entrambi i tipi di cellule presentano forme allungate a28. In ulteriori indagini, l'esposizione a insulina, desametasone e 3-isobutilil-1-metilxantina (IBMX) può produrre cellule con un lignaggio adipogenico, stimolando un passaggio verso una forma cellulare più sferica associata ad adipociti28, 29. abbiamo ottenuto immagini chiare utilizzando la microscopia a contrasto di fase di bassa adesione a crescita libera (Figura 3A-C) e la membrana seminterrato incorporato (Figura 3D-G) organoidi. Tuttavia, il monitoraggio della crescita organoide individuale in piastre a bassa adesione era difficile a causa delle minime aderenze focali tra le cellule e la superficie ben, con conseguente movimento organoide e aspirazione occasionale.
Una volta macchiati per i marcatori di superficie, la microscopia confocale rese la localizzazione più chiara dei marcatori (Figura 5E, F) rispetto alla microscopia a campo Widefield (Figura 5a-D). Dalla quantificazione della fluorescenza, le tendenze nell'espressione di Phalloidin suggeriscono che gli organoidi irradiati hanno espresso un aumento di F-actina rispetto al controllo (Figura 5g). La riorganizzazione del citoscheletro actina è stata osservata in cellule endoteliali microvascolari dermiche irradiate a dosaggi simili30.
Per le sequenze di imaging estese, come la co-coltura temporizzata con cellule immunitarie (Figura 6), è richiesta una camera di imaging a cellule vive con umidità e controllo Co2 31. Le immagini delle cellule in tempo reale scattate ogni 30 minuti hanno rivelato che i macrofagi sono co-localizzati con organoidi dopo 24 ore (Figura 6a, B), migrando preferenzialmente verso organoidi irradiati (Figura 6C). L'infiltrazione del macrofago nel tessuto normale irradiato è stata osservata in vivo, è attribuita a gradienti chemochine e citochine, e in genere precede il reclutamento CTC5. Gli studi futuri valuteranno le interazioni di macrofage classiche e alternativamente attivate con gli organoidi poiché le dinamiche polarizzate del macrofage possono svolgere un ruolo importante nel determinare la risposta alle radiazioni32,33. Ulteriori analisi valuteranno la conseguenza della fame sierica e gli effetti di crescita della coltura di organoidi in mezzi completi, poiché queste variabili possono avere effetti significativi sulle interazioni tra cellule immunoorganiche. Questo sistema può essere ulteriormente adattato per la co-coltura con altri tipi di cellule, tra cui cellule T CD8 +, cellule stromali, adipociti e cellule tumorali del seno. L'osservazione in tempo reale con tecniche come l'imaging cellulare dal vivo faciliterà la spiegazione dei potenziali meccanismi che contribuiscono al reclutamento di CTC nei tessuti normali irradiati, che possono avere implicazioni significative per i pazienti affetti da recidiva TNBC.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo la Dott. ssa Laura L. Bronsart per aver fornito GFP e i macrofagi RAW 264,7 con etichetta dTomato. Questa ricerca è stata sostenuta finanziariamente da NIH Grant #R00CA201304.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| Anti-cytokeratin 14 | abcam | ab181595 | Lot: GR3200524-3 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1933-25G | |
| Collagen Type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII | Sigma | C2139 | |
| Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 11320-033 | |
| DNAse | Roche | 10104159001 | |
| DPBS | Fisher | 14190250 | |
| E-Cadherin | Cell Signaling | 24E10 | Lot: 13 |
| FBS | Sigma | F0926 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750 | |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150077 | green Lot: GR3203000-1 |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150080 | red Lot: GR3192711-1 |
| Hoechst 33342 | Fisher | 62249 | Lot: TG2611041 |
| Insulin (10 mg/mL) | Sigma | I9278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium, 100x | Gibco | 51500-056 | |
| Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma) | Corning | 356237 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Nuclon Sphera 96 well plates | Thermo | 174927 | |
| PBS | VWR | 10128-856 | |
| Pen/strep | Fisher | 15140122 | |
| Phalloidin | abcam | ab176757 | Lot: GR3214582-16 |
| Tight Junction Protein 1 | Novus | NBP1-85047 | Lot: C115428 |
| Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol) | Sigma | X100-100ML | |
| Trypsin | Gibco | 27250-018 | |
| Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate) | Sigma | P1379-100ML |
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