乳腺组织类器官的培养及辐照后表征

摘要

由小鼠乳腺组织开发的类器官经辐射处理后进行表征，以评估上皮特性及其与免疫细胞的相互作用。经辐射的类器官可用于更有效地评估可能引起肿瘤细胞在辐射正常组织中募集的细胞间相互作用。

摘要

由消化组织获得的类器官是多细胞三维（3D）结构，相较于单层细胞培养，能更好地模拟体内环境。尽管它们无法完全重现体内的复杂性，但保留了原始器官的部分功能。在癌症模型中，类器官常用于研究肿瘤细胞的侵袭行为。本方案旨在建立并表征来自正常及经辐照小鼠乳腺组织的类器官，以评估正常组织对辐射的响应。这些类器官可应用于未来的体外癌症研究，用以评价肿瘤细胞与经辐照类器官之间的相互作用。乳腺组织被切除后接受20 Gy辐照，并在胶原酶VIII溶液中进行消化。通过离心分离法获得上皮类器官，并在96孔低吸附微孔板中培养形成3D类器官。类器官表达特征性上皮标志物细胞角蛋白14。在共培养实验中观察到巨噬细胞与类器官之间的相互作用。该模型可能有助于研究在经辐照微环境中肿瘤与间质的相互作用、免疫细胞的浸润以及巨噬细胞的极化现象。

引言

大约60%的三阴性乳腺癌（TNBC）患者选择保乳治疗（BCT）作为治疗方式¹。在这种治疗模式中，含有肿瘤的部分乳腺组织被切除，周围正常组织则接受电离辐射，以杀灭任何残留的肿瘤细胞。该治疗可降低大多数乳腺癌患者的复发风险；然而，约13.5%的TNBC治疗患者会出现局部区域复发²。因此，研究辐射如何招募循环肿瘤细胞（CTCs），将有助于深入理解局部复发的机制^3,4。

既往研究表明，正常组织受到辐射会增加多种细胞类型的募集⁵。在三阴性乳腺癌（TNBC）的临床前模型中，正常组织的照射可促进巨噬细胞以及随后肿瘤细胞向正常组织的募集⁵。免疫状态影响肿瘤细胞向受照部位的募集，在免疫功能低下个体中可观察到肿瘤细胞的迁移。利用乳腺组织来源的类器官重现这些相互作用，将能够通过显微镜和活细胞成像实时观察细胞迁移及细胞-基质间的相互作用，从而明确辐射损伤在改变肿瘤细胞行为中的作用。

小鼠乳腺类器官有助于阐明乳腺发育过程中的关键步骤。乳腺类器官是由分离的乳腺上皮细胞构成的多细胞三维结构，其尺寸大于50 μm^....

方案

动物实验均遵循范德比尔特大学机构动物护理和使用委员会批准的机构指南和方案进行。

1. 小鼠准备与细胞获取（改编自 Nguyen-Ngoc 等人¹¹）

1. 使用 CO₂ 窒息法处死裸鼠（Nu/Nu，8-10 周龄），随后进行颈椎脱位。用 70% 乙醇清洁皮肤。
2. 使用预先灭菌的剪刀和镊子切除小鼠的腹部和腹股沟乳腺组织。在切除前去除淋巴结。用无菌的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗组织（图 1A）。
3. 将组织放入含 10 mL DMEM/F12 培养基的 15 mL 离心管中用于运输。样品可在 4 °C 保存过夜，或立即处理。处理过程中保持冰上操作。
4. 使用铯源对样品进行 20 Gy 的照射（图 1B）。
5. 照射后 45 分钟，将乳腺组织置于 35 mm 无菌细胞培养皿中，用手术刀切碎（图 1C,D）。大约切 40 次，直至组织松散，获得面积不超过约 1 mm² 的组织碎片。
6. 将组织转移至含胶原酶溶液的 50 mL 离心管中。胶原酶溶液由 2 mg/mL 胶原酶（见 材料表）、2 mg/mL 胰....

结果

通过小鼠乳腺组织成功获取了经辐照的上皮类器官，并进行了处理，随后在低黏附培养板上进行培养（图1）。通过在不同生长环境中接种，检测了类器官的得率（图2A-G）。将细胞直接接种至经组织培养处理的10 cm细胞培养板时，成纤维细胞出现过度生长。在相差显微镜下，成纤维细胞出现在类器官的同一焦平面或其附近，并在接种后数天内迅速从类器官中迁移生长出来。当将类器官接种于基底膜和胶原蛋白基质中时，也观察到成纤维细胞的过度生长现象（图2E,F）。

在优化辐照类器官生长的实验中，测试了多种条件（图2H）。在类器官消化步骤中，使用了来自clostridium histolyticum的I型和VIII型胶原酶作为消化酶^{12,16,.......}

讨论

在本实验方案中，我们建立了一种可重复地培养和表征经辐照的乳腺类器官的方法（图1）。采用20 Gy的辐照剂量，以模拟既往关于肿瘤细胞募集的体内模型⁵。在乳腺类器官形成前，对乳腺组织进行离体辐照，可单独研究辐射损伤效应，同时避免免疫细胞的继发性浸润。建立体外辐照正常组织模型，可实现实时观察可能参与辐射诱导循环肿瘤细胞（CTC）募集的细胞间相互作用^11,12。

严格遵循步骤1.5至1.18对于最大化类器官产量至关重要。我们将浓缩的胶原酶冻存分装液加入消化液中。由于浓缩胶原酶分装液具有高度黏稠性，其加入量可能存在一定差异，从而导致酶活性波动，因此必须密切监测类器官的消化过程，以避免过度消化。使用50 mL离心管进行类器官消化也十分重要，因为这可提供均匀的消化表面积。其他研究曾采用过滤法纯化类器官^19,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% 中性缓冲福尔马林	VWR	16004-128
抗细胞角蛋白 14 抗体	abcam	ab181595	批号: GR3200524-3
牛血清白蛋白	Sigma	A1933-25G
I 型胶原蛋白	Corning	354236
梭状芽孢杆菌来源的胶原酶，VIII 型	Sigma	C2139
I 型胶原酶	Gibco	17018029
DMEM/F12 培养基	Thermofisher	11320-033
脱氧核糖核酸酶（DNAse）	Roche	10104159001
DPBS 缓冲液	Fisher	14190250
E-钙黏蛋白抗体	Cell Signaling	24E10	批号: 13
胎牛血清（FBS）	Sigma	F0926
庆大霉素	Gibco	15750
山羊抗兔二抗	abcam	ab150077	绿色 批号: GR3203000-1
山羊抗兔二抗	abcam	ab150080	红色 批号: GR3192711-1
Hoechst 33342 染料	Fisher	62249	批号: TG2611041
胰岛素（10 mg/mL）	Sigma	I9278
胰岛素-转铁蛋白-硒溶液（100 倍浓缩）	Gibco	51500-056
Matrigel 基底膜（从小鼠 Engelbreth-Holm-Swarm 肉瘤中提取的基底膜）	Corning	356237
正常山羊血清	Vector Laboratories	S-1000
Nuclon Sphera 96 孔板	Thermo	174927
PBS 缓冲液	VWR	10128-856
青霉素-链霉素双抗（Pen/strep）	Fisher	15140122
鬼笔环肽（Phalloidin）	abcam	ab176757	批号: GR3214582-16
紧密连接蛋白 1 抗体	Novus	NBP1-85047	批号: C115428
Triton X-100（4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇）	Sigma	X100-100ML
胰蛋白酶（Trypsin）	Gibco	27250-018
Tween-20（聚乙二醇单月桂酸山梨醇酯）	Sigma	P1379-100ML