Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Vækst og karakterisering af bestrålede Organoider fra mælkekirtler

Published: May 3, 2019 doi: 10.3791/59293
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Vanderbilt University, 2Department of Biomedical Engineering, Vanderbilt University, 3Department of Radiation Oncology, Vanderbilt University Medical Center

Summary

Organoider udviklet fra muse brystkirtler blev bestrålet og karakteriseret til at vurdere epiteliale træk og interaktioner med immunceller. Bestrålede organoider kan bruges til bedre at evaluere celle celle interaktioner, der kan føre til tumor celle rekruttering i bestrålet normalt væv.

Abstract

Organoider afledt af det fordøjet væv er fler cellulære tredimensionale (3D) konstruktioner, der bedre rekapitulere in vivo betingelser end celle monolayers. Selv om de ikke helt kan model in vivo kompleksitet, de bevarer nogle funktionalitet af det oprindelige organ. I kræft modeller, organoider er almindeligt anvendt til at studere tumor celle invasion. Denne protokol har til formål at udvikle og karakterisere organoider fra den normale og bestrålede muse brystkirtler væv til at evaluere stråling respons i normale væv. Disse organoider kan anvendes til fremtidige in vitro Cancer undersøgelser for at evaluere tumor celle interaktioner med bestrålede organoider. Mælkekirtler blev påvirket, bestrålet med 20 Gy og fordøjet i en kollagenase VIII-opløsning. Epitelial organoider blev adskilt via centrifugal differentiering, og 3D organoider blev udviklet i 96-godt lav-vedhæftning mikroplader. Organoider udtrykte den karakteristiske epitelial markør cytokeratin 14. Makrofag interaktion med organoider blev observeret i co-kultur eksperimenter. Denne model kan være nyttig til at studere tumor-stromale interaktioner, infiltration af immunceller, og makrofag polarisering inden for et bestrålet mikromiljø.

Introduction

Ca. 60% af de tredobbelte negative brystkræftpatienter (TNBC) vælger amnings behandling (BCT) som en form for behandling1. I denne behandling modalitet fjernes tumoren, der indeholder en del af brystvæv, og det omgivende normale væv udsættes for ioniserende stråling for at dræbe eventuelle resterende tumorceller. Behandling reducerer recidiv i en stor del af brystkræft populationen; Men, ca. 13,5% af behandlede patienter med TNBC erfaring lokoregional gentagelser2. Derfor, studere hvordan stråling kan rekruttere cirkulerende tumorceller (ctc'er) vil føre til vigtig indsigt i lokal gentagelse3,4.

Tidligere arbejde har vist, at stråling af det normale væv øger rekrutteringen af forskellige celletyper5. I prækliniske modeller af TNBC, bestråling af normale væv øget makrofag og efterfølgende tumor celle rekruttering til normale væv5. Immunstatus påvirkede tumor celle rekruttering til bestrålede steder, med tumor celle migration observeret hos immunkompromitterede forsøgspersoner. Rekapitulating disse interaktioner ved hjælp af organoider afledt af brystkirtler vil gøre det muligt observation af celle migration og celle-stromale interaktioner i realtid med mikroskopi og levende celle Imaging til at bestemme den rolle, stråling skader i at ændre tumor celle adfærd.

Muse bryst organoider har hjulpet med at belyse vigtige trin i udviklingen af brystkirtlen. En bryst organoid er en flercellet, tredimensionel konstruktion af isoleret bryst Epitelet, der er større end 50 μm6,7,8,9,10. Ved brug af primære epitelial organoider evaluerede Simian et al. de nødvendige faktorer for forgreningen i brystkirtlen7. Shamir et al. opdagede, at spredning kan ske uden en epitel til mesenkymale overgang, giver indsigt i den metastatiske kaskade8. Metoder til generering og karakterisering af organoider fra mælke kirtlens væv er veletablerede6,11,12,13. Men til vores viden, metoder til dyrkning af bestrålede organoider fra brystkirtler er ikke blevet rapporteret. En protokol til dyrkning og karakterisering af bestrålede organoider ville være et kritisk skridt i at rekapitulere stråling-induceret immun og tumor celle rekruttering.

I dette dokument rapporterer vi om en metode til dyrkning og karakterisering af bestrålede bryst epitelial organoider i lave vedhæftnings mikroplader belagt med en hydrofile polymer, der understøtter dannelsen af sfæroider. Disse organoider blev co-kuleret med makrofager at undersøge immuncelle infiltration kinetik. Dette arbejde kan udvides til at omfatte Co-culturing organoider med fedtvæv celler til at rekapitulere bryst egenskaber, brystkræft celler til at visualisere tumor celle rekruttering, og CD8 + T celler til at studere tumor-immuncelle interaktioner. Tidligere etablerede protokoller kan anvendes til vurdering af bestrålede organoider. Tidligere modeller, der co-kulerer mælke-organoider og immunceller har kaste lys over mekanismer af metastaser og formidling. Denardo et al. fandt, at CD4 + T-celle reguleringen af tumor associerede makrofager forstærkede en metastatisk fænotype af bryst adenocarcinomer14. Samkulturmodeller er også blevet brugt til at belyse mekanismerne for biologisk udvikling. Plaks et al. præciserede betydningen af CD4 + T-celler som ned-regulatorer af bryst organogenesen15. Men vores gruppe er den første til at etablere en procedure for at visualisere, hvordan normal vævs bestråling påvirker immuncelle adfærd. Fordi normal vævs bestråling har vist sig at forbedre tumor celle rekruttering5, denne protokol kan videreudvikles til at analysere, hvordan tumor celle adfærd er ændret ved bestråling af normale væv og celler, hvilket fører til en større forståelse af kræft.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer og protokoller godkendt af Vanderbilt University institutionelle Animal Care og use udvalget.

1. forberedelse af mus og celle erhvervelse (tilpasset fra Nguyen-Ngoc et al.11)

  1. Ofrer athymiske nu/nu-mus (8-10 uger gamle) ved hjælp af CO2 -kvælning efterfulgt af cervikal dislokation. Rengør huden med 70% ethanol.
  2. Reect mave-og lyske brystkirtler fra mus ved hjælp af præ-steriliseret saks og pincet. Fjern lymfeknuder før resektion. Skyl i steril 1x fosfat bufferet saltvand (PBS) (figur 1a).
  3. Den anbringes i 15 mL rør med 10 mL Dulbecco's modificerede Eagle Media/næringsstof blanding F12 (DMEM/F12) til transport. Prøverne kan opbevares natten over ved 4 °C eller forarbejdes med det samme. Hold på is.
  4. Der udtages prøver af irradiat ved 20 Gy ved hjælp af en cæsium kilde (figur 1b).
  5. 45 min. efter bestråling anbringes mælkekirtler i en 35 mm steril celle plade og hakkekød med skalpels (figur 1C, D). Mince med ca. 40 slag, indtil vævet slapper af og stykker opnås, der ikke er større end ca. 1 mm2 i området.
  6. Overføres til kollagenaseopløsningen i et 50 mL centrifugeglas. Collagenaseopløsning består af 2 mg/mL kollagenase (Se tabel over materialer), 2 mg/ml trypsin, 5% v/v føtalt bovint serum (FBS), 5 μg/ml insulin og 50 μg/ml gentamicin i DMEM/F12-mediet. Brug 10 mL kollagenaseopløsning pr. mus.
  7. Sted i et vandbad ved 37 °C, vortexning hver 10 min for 30-60 min. fordøjelsen er færdig, når kollagenaseopløsningen er uklar (figur 1E, F).
  8. Spin ned den fordøjet opløsning på 450 x g i 10 min ved stuetemperatur (RT). Tre lag vil blive observeret. Supernatanten består af fedt, det midterste lag er en vandig opløsning, og bunden er en pellet. Pellet vil fremstå rødt, da det er en blanding af epitelceller, individuelle stromale celler, og røde blodlegemer (figur 1G).
  9. Forcoat alle pipetter, pipettespidser og centrifugeglas med bovin serumalbumin (BSA) opløsning før kontakt. BSA-opløsning består af 2,5 w/v% BSA i Dulbecco's fosfatbuffer-bufferet saltvand (DPBS). Til forbelægning skal du blot tilføje og derefter fjerne BSA-opløsningen til indersiden af pipettespidsen og-rørene. BSA-opløsningen kan genbruges, selv om den skal være sterilfiltreret før hvert forsøg.
  10. For yderligere genvinding skal supernatanten overføres til et frisk, BSA belagt 15 mL rør. Pipette op og ned kraftigt for at sprede fedtlag. Der centrifugeres ved 450 x g i 10 min ved rt. Aspirér supernatanten, og efterlader en lille mængde medier i røret for at undgå at aspirere celle pillen.
  11. Aspirer det vandige lag fra røret med den oprindelige pellet.
  12. Der tilsættes 10 mL DMEM/F12 til røret med den oprindelige pellet og overføres til det andet rør. Pipette kraftigt for at kombinere og resuspendere de to pellets.
  13. Der centrifugeres ved 450 x g i 10 min ved rt. Aspirér supernatanten, og tilsæt 4 ml DMEM/F12 til røret.
  14. Tilsæt 40 μL deoxyribonuclease site (DNase) til suspensionen, og Ryst forsigtigt med hånden i 2-5 min ved RT. DNase-opløsning består af 4 e/mL DNase i DMEM/F12.
  15. Tilsæt 6 mL DMEM/F12 og pipetter grundigt. Der centrifugeres i røret ved 450 x g i 10 min. ved rt.
  16. Aspirer supernatanten til 0,5 mL-mærket. Opslæbtes i 10 mL DMEM/F12 og pipette grundigt.
  17. Puls til 450 x g og stop 4 s efter at have nået denne hastighed.
  18. Gentag trin 1.16-1.17 tre gange mere for at rense organoider via centrifugal differentiering. Pellet bør nu være en off-white farve bestående af kun epitelial organoider (figur 1H).
    Bemærk: Organoider kan også filtreres ved hjælp af sterile mesh 40 μm filtre. Efter trin 1,16, pipette medier indeholdende organoider gennem et filter i et centrifugeglas, og derefter skylles med 5 til 10 mL DMEM/F12-medie. Vend filteret over et nyt 50 mL centrifugeglas. Overfør 10 mL DMEM/F12-medie igennem, og gå den modsatte vej for at skylle alle retentate. Retentatet bør bestå af organoider, og filtratet bør hovedsagelig bestå af stromale celler, som kan kasseres eller opbevares, hvis det ønskes.

2. bestemmelse af tæthed og plating organoider

  1. Opslæbte pellet i 10 mL DMEM/F12. Pipette grundigt for at skabe en homogen opløsning.
  2. Overfør 50 μL til en 30 mm Petri skål, og se under et fasekontrast mikroskop ved 20x. Tæl antallet af organoider med en tælle tæller.
    Bemærk: her er pipettespidser konsekvent blevet anvendt med en minimal diameter på 457 μm, hvilket er 5-10 gange diameteren af de organoider, der er seedet. Til overførsel af volumener på 2 mL eller større (f. eks. trin 1,16 og 2,1) anvendes serologiske pipetter med spids diametre på over 1.500 μm.
  3. Beregn organoid tæthed ved hjælp af følgende ligning:
    Equation
    Den ønskede tæthed er 1.000 organoider/mL for at forenkle yderligere fortynding. Hvis densiteten er for lav, centrifugeres ved 450 x g i 5 min. og Aspirér mediet. Tilføj medier, der er nødvendige for at nå 1.000 organoider/mL, og pipette grundigt for at skabe en homogen blanding.
    1. At dyrke organoider i en protein matrix, frø organoider i en koncentration af 1 organoid/L i kollagen type 1 fortyndet til 87% eller i kælder membran ekstraheret fra Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom. Mens du arbejder med prøver, holde på is.
    2. Hvis du vil fryse organoider, skal du overføre den ønskede mængde til et separat centrifugeglas. Spin ned ved 450 x g i 5 min. Aspirate medier, og tilsæt derefter det samme volumen på 90% FBS/10% DMSO. Resuspension af organoider, og derefter alikvot i kryorør. Overfør til-80 °C og derefter til flydende nitrogen inden for en uge.
    3. At tø, varm i et 37 °C vandbad i en min. centrifuge ved 450 x g i 5 min., og derefter Aspirér fryse mediet. Skyl med sterile DPBS, og centrifuge derefter igen. Aspirer DPBS, og Tilføj organoide medier.
  4. Der afpipetteres 50 μL (50 organoider) i hver brønd af den lave vedhæftnings plade (figur 1I).
  5. Der tilsættes 150 μL organoid-medier for at bringe den totale arbejdsmængde ned på 200 μL. Organoid medier består af 1% penicillin-streptomycin og 1% insulin-transferrin-selen (ITS) i DMEM/F12 Media.
  6. Hver 2 dage erstatte medierne omhyggeligt.
    Bemærk: lave vedhæftnings plader er ikke vævskultur behandlet; Derfor kan cellerne nemt løsnes. Aspirér mediet langsomt ved at vippe pladen og indsætte pipettespidsen i kanten af hver brønd. Efterlad en lille mængde af medier i bunden af brønden. Tilføj nye medier langsomt for at undgå at anvende unødvendige forskydningskræfter på organoider.

3. co-culturing med makrofager

  1. Vedligehold GFP eller Dtomat mærkede RAW 264,7 makrofager i DMEM Media suppleret med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin. Frø 1 x 104, 5 x 104eller 1 x 105 celler/ml i organoide medier.
  2. Brug levende celle fasekontrast og fluorescerende Imaging til at overvåge makrofag infiltration over tid.

4. immunofluorescens farvning af organoider

Bemærk: Organoider kan farves i lave vedhæftning brønde eller kan overføres til kammer slides. For at overføre skal du forsigtigt pipettere op og ned, indtil organoider er løsnet fra pladerne. Overførsel til kammer glider og inkube for 4-8 h at tillade organoider til at overholde pladen overflade.

  1. Fjern organoid medium fra brøndene ved forsigtigt at aspirere. Fix prøver med 10% neutral buffer formalin i 15 min ved rt.
  2. Vask 3x 5 min i 1x PBS. Hvis det ønskes, kan faste prøver opbevares ved 4 °C i en uge for yderligere farvning.
  3. Permeabilize med 0,1% 4-(1, 1, 3, 3-tetramethylbutyl) phenyl-polyethylenglycol i 5 min.
    Bemærk: for at plette for F-actin, inkube prøver med phalloidin fortyndet 1:1000 og 1,67 nM bisbenzimid kerne farvestof i 1% PBS/BSA i 1 time ved RT. Fortsæt derefter til trin 4,8.
  4. Bermeabilize med 0,5 PBS. Prøverne kan opbevares på 4opy billeder og immuno fluorescens billeder. mekanismer, der bidrager til CTC-rlock med 5% normalt gede serum i 0,1% PBS/polyethylenglycol sorbitanmonolaurat (PBST) i 1 time ved RT. vask 3x 5 min med PBS.
  5. Inkubeter med anti-Cytokeratin 14 fortyndet 1:1000, E-Cadherin fortyndet 1:200, eller Tight Junction protein One fortyndet 1:100 i 1% NGS i PBST i 1 time ved RT. vask 3x 5 min i PBST.
  6. Inkubeter med ged anti-kanin sekundær fortyndet 1:200 med 1% NGS/PBST i 1 time ved RT. cover med folie for at undgå lyseksponering.
  7. Vask 3x 5 min i PBS. Brug det nukleare farvestof (Se tabel over materialer) til at plette kerner.
  8. Vask 3x 5 min i PBS. Hvis du bruger kammer slide, montere med en coverslip. Opbevar indpakket i folie ved 4 °C i op til 2 uger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bestrålede epitelial organoider blev med held indhentet fra muse brystkirtler, forarbejdet og dyrket på plader med lav vedhæftning (figur 1). Organoid-udbyttet blev testet ved såning i forskellige vækst miljøer (figur 2a-G). Seeding celler direkte på vævskultur behandlet 10 cm celle plader gav en overvækst af fibroblast celler. Fibroblaster blev identificeret under fasekontrast mikroskopi i eller nær samme plan af fokus som organoider, og de voksede hurtigt ud af belagte organoider inden for et par dage. En udvækst af fibroblaster blev også observeret, når organoider blev seedet i kælder membran og kollagen protein matricer (figur 2E, F).

En række betingelser blev afprøvet i optimering af bestrålet organoid vækst (figur 2H). Collagenase typerne i og VIII fra Clostridium histolyticum blev anvendt som enzymet i organoid fordøjelsestrin12,16,17. Organoid udbyttet var signifikant højere efter fordøjelsen med kollagenase VIII. Dette kan skyldes de rensningsprocesser, der anvendes til fremstilling af enzymet: kollagenase type I er delvist renset og kan forårsage unødvendig beskadigelse af membran proteiner og receptorer, hvilket fører til dårlig organoid dannelse, celle lysis eller over-fordøjelse16 , 17 ud af , 18. der blev ikke observeret signifikante forskelle i udbyttet mellem bestrålede og kontrol organoider.

Bestrålede organoider kan dyrkes i lave vedhæftnings plader (figur 3a-C) eller i kælderen membran (figur 3D-G), men den mest hurtige vækst forekom i lave vedhæftnings plader (figur 3h). Organoider rekapitulerede bryst kirtel egenskaber. Hvide pilespidser indikerer konstruktioner morfologisk ligner kanaler og lapper19, 20,21 (figur 3c), som er afgørende for produktion og transport af mælk i brystkirtlen21. Der kræves dog yderligere karakterisering for at bekræfte denne observation. Væksttendenserne tydede på, at ikke-bestrålede organoider voksede hurtigere end bestrålede organoider (figur 3H), sandsynligvis på grund af cellevækst anholdelse som følge af mekanismer til reparation af DNA-skader; tendensen var imidlertid ikke statistisk signifikant22. Lejlighedsvis sammenklumpning af lave vedhæftnings organoider blev observeret, og organoider kunne dyrkes op til to uger før dissociering.

Organoider udtrykte epitelial egenskaber, som blev evalueret gennem immunofluorescens farvning af cytokeratin 14 (K14), e-cadherin (e-CAD), og tight Junction protein 1 (zo-1)23,24,25 ( Figur 4). Bestrålede organoider udtrykte epitelial markører. K14, en markør for myoepithelium23, blev udtrykt stærkt på overfladen af bestrålede organoider (figur 4a). Desuden blev E-CAD og ZO-1 udtrykt i cellulære kryds af organoider (figur 4b, C). Disse proteiner er afgørende for korrekt celle vedhæftning24. Efter bestråling fortsatte organoider med at bevare deres epitelial egenskaber.

Fluorescerende farvning af organoider kan visualiseres inden for lave vedhæftnings plader ved hjælp af Fluorescens mikroskopi (figur 5a-D); den klareste visualisering blev dog opnået via Konfokal mikroskopi (figur 5e-F). Korrigeret total fluorescens intensitet blev beregnet ved at fratrække baggrunden og normalisere efter organoid område (figur 5g). Voksende organoider i 96-godt lav vedhæftning plader også forenklet Co-kultur eksperimenter. Når seedet ved koncentrationer typisk i brystkirtlen, makrofager Co-lokaliseret med kontrol og bestrålede organoider (figur 6)24,26.

Figure 1
Figur 1. Arbejdsgang for metode. (A) brystkirtler blev påvirket af mus. Mave-og ingakinkirtlerne i maven blev brugt. B) mælkekirtler blev bestrålet i 50 ml-centrifugeglas indeholdende DMEM/F12-mediet. C) mælkekirtler blev overført til sterile seks brønd plader og skåret med kirurgisk skalpels indtil hakket (D). E) mælkekirtler blev overført til 50 ml centrifugeglas indeholdende 5 ml sterilt DMEM/F12-medie pr. kirtel og fordøjet i en kollagenaseviii-opløsning (F). (G) efter at være blevet overført til en 15 ml tube, blev centrifugal differentiering udnyttet til at fjerne stromale celler, enkeltceller og røde blodlegemer, observeret i en rød pellet (hvide pil-hoved) indtil kun hvide epitelial organoider blev opnået (H ). (I). 50 organoider blev belagt i 200 μl af mediet i 96-godt lave vedhæftnings plader og indpakket ved hjælp af fasekontrast mikroskopi skala stang repræsenterer 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Organoid plating i 3D protein matricer og på vævskultur behandlet plastik. Organoider seedede i kollagen (a) og kælder membran (B), der er indlagret efter 84 timers vækst. Udvækst af fibroblaster forekom i matrix belagte organoider (C, D). Fasekontrast billeder af organoider sorteret gennem filtrering blev opnået 192 timer efter såning. Der blev ikke observeret større forskelle mellem filtratet (E) og Retentat (F), som begge resulterede i konflydende fibroblast vækst. Celler i E og F blev seedet på vævskultur behandlet plastik. Efter trypsinisering i 5 min ved RT blev fibroblaster fjernet via aspiration; de resterende epitelceller dannede imidlertid en monollags kultur i stedet for tredimensionale organoider (G). Skala bjælker for A-G repræsenterer 100 μm. (H) forskellige collagenasetyper (I (CI) og VIII (CVIII)) og celle behandlingsmetoder (filtrering og centrifugal differentiering (cent diff)) blev testet, og organoid udbyttet pr. bryst kirtel blev kvantificeret (n = 2 kirtler for CI, filter; 2 kirtler for CVIII, filter; 4 kirtler for CI, cent diff og 12 kirtler for CVIII, cent diff). Statistisk signifikans blev fastlagt ved hjælp af en to-sidet, ikke-parret t-test, * * * p < 0.0001. Fejllinjer repræsenterer standardfejl. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Repræsentativ Organoid vækst. Fasekontrast billeder af bestrålet organoid vækst i lave vedhæftnings plader opnået 20 (a), 44 (B) og 106 (C) timer efter såning. Hvide pilespidser indikerer strukturer, der har lignende morfologi til kanaler og lapper. Fasekontrast billeder af bestrålet organoid vækst i kælder membran opnået 42 (D), 66 (E), 60 (F), og 114 (G) timer efter såning. Skala stænger repræsenterer 50 μm. H. Areal målinger blev opnået under forskellige vækstbetingelser: organoider straks seedet efter fordøjelse og sortering (bestrålet (●), kontrol (▪)), og organoider seedet i kælderen membran (bestrålet (○), kontrol (□)) (n = 3 kirtler hver). Område beregninger blev foretaget ved hjælp af ImageJ software. Fejllinjer repræsenterer standardfejl. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Epithelial markør udtryk på bestrålede Organoider. Cytokeratin 14 (K14, grøn), en markør for det basale lag af plade og non-plade epithelia, blev udtrykt på bestrålede organoider (a). E-cadherin (E-CAD), et protein, der er vigtigt for vedhæftning, blev udtrykt i kryds mellem celler i bestrålede organoider (B). Tæt forgrenings protein 1 (ZO-1) blev også udtrykt i celle kryds af bestrålede organoider (C). Billeder blev opnået i kammer slides via confokal mikroskopi. En nukleinsyre plet blev brugt til at visualisere kerner (blå). Alle organoider blev fastgjort og indpakket efter en uges vækst. Skala stænger er 50 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5. F-actin udtryk i organoider. F-actin (rød), en mikrofilamenter i epitelial celler, blev udtrykt med lavere intensitet i ikke-bestrålede organoider (a, C, E) end i bestrålede (B, D, F) organoider. En nukleinsyre plet blev brugt til at visualisere kerner (blå). Billeder blev taget på lav vedhæftning 96-brønd plader (A, B) og 16-brøndkammer slides (C, D). Billeder blev også taget ved hjælp af confokal mikroskopi (E, F). Alle organoider blev fastgjort og indpakket efter en uges vækst. Skala stænger er 50 μm. G. Phalloidin fluorescens data fra lave vedhæftnings plade billeder blev kvantificeret i ImageJ (n = 3 kirtler). Fejllinjer angiver standardfejl. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6. Evaluering af celle celle interaktioner gennem makrofag-organoid Co-kultur. Makrofager (rød) infiltreret kontrol (a) og bestrålede (B) organoider. Skala stænger repræsenterer 50 μm. Det gennemsnitlige procent område af makrofager i billedfeltet (C) blev rapporteret ved 24 timers Co-kultur for kontrol (gul) og bestrålede (orange) organoider (n = 3 kirtler for hver prøve). Makrofager blev seedet i koncentrationer af 10.000 celler/mL, 50.000 celler/mL, og 100.000 celler/mL, og deres infiltration blev erobret hver 30 minutter via levende celle fluorescens Imaging. Alle Co-kultur eksperimenter begyndte 7 dage efter indledende organoid såning. Statistisk signifikans blev bestemt ved hjælp af en to-sidet, ikke-parret t-test, * p < 0,05, * * * p < 0.0001. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokol har vi udviklet en metode til reproducerbar vækst og karakterisering af bestrålede mælke organoider (figur 1). En bestrålingsdosis på 20 Gy blev anvendt til at spejle tidligere in vivo-modeller af tumor celle rekruttering5. Bestråling af brystkirtler ex vivo før organoid dannelse tilladt for isolering af stråling skader virkninger uden en tilsvarende infiltration af immunceller. Udviklingen af en in vitro-bestrålet normal vævs model muliggør realtidsvisning af cellulære interaktioner, der kan bidrage til den strålingsinducerede CTC-rekruttering11,12.

Nøje følge trin 1.5-1.18 var afgørende for maksimering af organoid udbytte. Vi tilføjede optøede aliquoter af koncentreret kollagenase til fordøjelsessystemet løsning. På grund af den stærkt viskøse karakter af den koncentrerede kollagenase alikvot, kan der være nogle variationer i mængde og derfor i enzymatisk aktivitet, så organoid fordøjelsen skal overvåges nøje for at undgå over-fordøjelse. Det er også vigtigt at fordøje organoider i en 50 mL tube, da dette giver mulighed for et jævnt overfladeareal til fordøjelsen. Andre undersøgelser har brugt filtrering til rensning af organoider19,23; men vi opnåede en meget højere udbytte rensning med centrifugal differentiering (figur 2H). Forbelægnings pipetter, pipettespidser og centrifugeglas med BSA-opløsningen er afgørende for maksimering af udbyttet. Organoider mærkbart overholde til ubestrøget plast, når opløsningen ansøgning er forsømt.

Der skal udvises stor omhu for at undgå at aspirere organoider. Dette er en risiko, der opstår, når rense, ændre medier, og farvning for fluorescerende markører. Ved hjælp af lav vedhæftning plader for vækst giver mulighed for nem overførsel af organoider og fjerner behovet for organoider, der skal opdeles i OLT for yderligere farvning, en procedure, der kræves for kælder membran indlejrede organoider11. Ud over fordelene ved overlegen vækst krævede såning af bestrålede organoider i lave vedhæftnings plader færre trin og var mindre teknisk udfordrende end dyrkning af organoider i kælder membran eller kollagen. Men når farvning for markører, kan det være nyttigt at se organoider under et mikroskop for at sikre, at utilsigtet aspiration ikke forekommer.

Desuden er der mange overvejelser, der skal tages højde for, når billedbehandlings organoider. I kælderen membran indlejrede organoider, lejlighedsvis fibroblast vækst kan observeres (figur 2c, D). Fibroblast udvækst i 3D kultiverede organoider kan være forårsaget af organoider, der gør kontakt med vævskultur behandlet overflade som vedhæftning fører til upreguleret fibroblast vækstfaktor produktion i vedklækkede celler27. Interessant, morfologien af disse fibroblaster er slående ligner præ-adipocytter som begge celletyper udviser spindel, aflange former28. Ved yderligere undersøgelser kan eksponering for insulin, dexamethason og 3-isobutyl-1-Methylxanthin (ibmx) give celler med en adipogent afstamning, hvilket vil anspore til et skift mod en mere sfærisk cellulær form forbundet med adipocytter28, 29. vi fik klare billeder ved hjælp af fasekontrast mikroskopi af fri-voksende lav vedhæftning (figur 3a-C) og kælder membran indlejret (figur 3D-G) organoider. Sporing individuel organoid vækst i lav vedhæftning plader, dog var vanskelig på grund af minimal fokale klæbestoffer mellem cellerne og brønd overfladen, resulterer i organoid bevægelse og lejlighedsvis aspiration.

Når plettet for overflade markører, confokal mikroskopi gjort klarere markør lokalisering (figur 5E, F) end widefield mikroskopi (figur 5a-D). Af fluorescens kvantificering tyder tendenserne i phalloidin-ekspression på, at bestrålede organoider udtrykte øget F-aktin i forhold til kontrol (figur 5g). Actin cytoskelet reorganisering er blevet observeret i dermal mikrovaskulære endotelceller bestrålet ved lignende doser30.

For udvidede billedsekvenser, såsom tidsforskydning Co-kultur med immunceller (figur 6), en levende celle Imaging kammer med fugtighed og co2 kontrol er påkrævet31. Levende celle billeder taget hver 30 minutter afslørede, at makrofager Co-lokaliseret med organoider efter 24 timer (figur 6a, B), fortrinsvis migrere mod bestrålede Organoider (figur 6c). Makrofag infiltration i bestrålet normalt væv er observeret in vivo, tilskrives chemokin og cytokin gradienter, og typisk går forud for CTC rekruttering5. Fremtidige undersøgelser vil evaluere klassisk og alternativt aktiverede makrofag interaktioner med organoider, da polariseret makrofag dynamik kan spille en vigtig rolle ved bestemmelse af respons på stråling32,33. Yderligere analyser vil evaluere konsekvensen af serum sult og vækst effekterne af dyrkning af organoider i komplette medier, da disse variabler kan have betydelige virkninger på organoid-immuncelle interaktioner. Dette system kan yderligere tilpasses til co-kultur med andre celletyper, herunder CD8 + T-celler, stromale celler, adipocytter og brystkræft celler. Realtids observation med teknikker som levende celle billeder vil gøre det lettere at belyse potentielle mekanismer, der bidrager til CTC-rekruttering til bestrålet normalt væv, hvilket kan have betydelige konsekvenser for patienter, der lider af recidiverende Af TNBC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Laura L. Bronsart for at levere GFP og dTomato-mærkede RAW 264,7 makrofager. Denne forskning blev støttet finansielt af NIH Grant #R00CA201304.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Neutral Buffered Formalin VWR 16004-128
Anti-cytokeratin 14 abcam ab181595 Lot: GR3200524-3
Bovine Serum Albumin Sigma A1933-25G
Collagen Type I Corning 354236
Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII Sigma C2139
Collagenase I Gibco 17018029
DMEM/F12 Thermofisher 11320-033
DNAse Roche 10104159001
DPBS Fisher 14190250
E-Cadherin Cell Signaling 24E10 Lot: 13
FBS Sigma F0926
Gentamicin Gibco 15750
Goat anti-rabbit secondary abcam ab150077 green
Lot: GR3203000-1
Goat anti-rabbit secondary abcam ab150080 red
Lot: GR3192711-1
Hoechst 33342 Fisher 62249 Lot: TG2611041
Insulin (10 mg/mL) Sigma I9278
Insulin-Transferrin-Selenium, 100x Gibco 51500-056
Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma) Corning 356237
Normal Goat Serum Vector Laboratories S-1000
Nuclon Sphera 96 well plates Thermo 174927
PBS VWR 10128-856
Pen/strep Fisher 15140122
Phalloidin abcam ab176757 Lot: GR3214582-16
Tight Junction Protein 1 Novus NBP1-85047 Lot: C115428
Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol) Sigma X100-100ML
Trypsin Gibco 27250-018
Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate) Sigma P1379-100ML

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lautner, M., et al. Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer. Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).
  2. Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).
  3. Kim, M. Y., et al. Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
  4. Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
  5. Rafat, M., et al. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients. Cancer Research. 78 (15), 4241-4252 (2018).
  6. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  7. Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells. Development. 128, Cambridge, England. 3117-3131 (2001).
  8. Shamir, E. R., et al. Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin. Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).
  9. Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis. Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).
  10. Nguyen-Ngoc, K. -V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).
  11. Nguyen-Ngoc, K. -V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. 3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion. Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).
  12. Ewald, A. J. Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).
  13. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews. , (2018).
  14. DeNardo, D. G., et al. CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages. Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).
  15. Plaks, V., et al. Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis. Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).
  16. Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum. The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).
  17. Mandl, I., Zaffuto, S. F. Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase. The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).
  18. Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
  19. Zhang, L., et al. Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells. Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).
  20. Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).
  21. Richert, M. M., et al. An atlas of mouse mammary gland development. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).
  22. Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
  23. LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
  24. Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution. Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).
  25. Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).
  26. Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium. Development. 137, Cambridge, England. 4229-4238 (2010).
  27. Ingber, D., Folkman, J. Mechanochemical switching between growth and differentiation during fibroblast growth factor-stimulated angiogenesis in vitro: role of extracellular matrix. The Journal of Cell Biology. 109 (July), Available from: http://jcb.rupress.org/content/109/1/317.abstract (1989).
  28. Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. Understanding Adipocyte Differentiation. Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).
  29. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  30. Gabryś, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).
  31. Ewald, A. J. Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).
  32. Zhang, M., et al. A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients. Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).
  33. Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time. BioMed Central Cancer. 10, 112 (2010).

Tags

Bioengineering 3D organoid kultur mælke kirtel normal vævs stråling respons celle-celle interaktioner brystkræft kræft immunologi
Vækst og karakterisering af bestrålede Organoider fra mælkekirtler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hacker, B. C., Gomez, J. D.,… More

Hacker, B. C., Gomez, J. D., Batista, C. A. S., Rafat, M. Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands. J. Vis. Exp. (147), e59293, doi:10.3791/59293 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter