Summary
Organoider som utvecklats från mus bröst körtlar bestrålades och karakteriserades för att bedöma epiteliala egenskaper och interaktioner med immun celler. Bestrålade organoider kan användas för att bättre utvärdera cell-cell interaktioner som kan leda till tumör cell rekrytering i bestrålade normal vävnad.
Abstract
Organoider som härrör från smält vävnad är flercelliga tredimensionella (3D) konstruktioner som bättre upprepa in vivo villkor än cell monolayers. Även om de inte helt kan modellera in vivo komplexitet, behåller de vissa funktioner i orginal orgeln. I cancer modeller, organoider används ofta för att studera tumör cell invasion. Detta protokoll syftar till att utveckla och karakterisera organoider från den normala och bestrålade mus bröst körtel vävnaden för att utvärdera strålnings reaktionen i normala vävnader. Dessa organoider kan tillämpas på framtida in vitro-cancer studier för att utvärdera tumör cell interaktioner med bestrålade organoider. Bröst körtlar återförvisades, bestrålades till 20 Gy och smälts i en kollagenas VIII-lösning. Epiteliala organoider separerades via centrifugaldifferentiering, och 3D organoider utvecklades i 96-brunn låg vidhäftning Mikroplattor. Organoider uttryckte den karakteristiska epiteliala markören cytokeratin 14. Macrophage interaktion med organoider observerades i Co-Culture experiment. Denna modell kan vara användbart för att studera tumör-stromal interaktioner, infiltration av immun celler, och makrofag polarisering inom en bestrålad mikromiljö.
Introduction
Cirka 60% av de trippel negativa bröst Cancer (TNBC) patienter väljer bröst-Conserving terapi (BCT) som en form av behandling1. I denna behandling modalitet, tumören som innehåller en del av bröst vävnaden avlägsnas, och omgivande normal vävnad utsätts för joniserande strålning att döda eventuella kvarvarande tumör celler. Behandling minskar recidiv i en stor del av bröst Cancer populationen; emellertid, cirka 13,5% av behandlade patienter med tnbc erfarenhet lokoregional upprepas2. Därför studerar hur strålning kan rekrytera cirkulerande tumör celler (ctcs) kommer att leda till viktiga insikter i lokal upprepning3,4.
Tidigare arbete har visat att strålning av normal vävnad ökar rekryteringen av olika cell typer5. I prekliniska modeller av TNBC, bestrålning av normal vävnad ökad makrofag och därefter tumör cell rekrytering till normala vävnader5. Immun status påverkade tumör cell rekrytering till bestrålade platser, med tumör cell migration observerades hos immunsupprimerade försöks personer. Recapitulating dessa interaktioner med organoider som härrör från bröst körtlar kommer att möjliggöra observation av cell migration och cell-stromal interaktioner i real tid med Mikroskopi och levande cell Imaging att avgöra vilken roll strålnings skador i att ändra tumör cells beteende.
Mus bröst organoider har hjälpt belysa viktiga steg i utvecklingen av bröst körtel. En bröst organoid är en multicellulär, tredimensionell konstruktion av isolerade bröst epitel som är större än 50 μm6,7,8,9,10. Med primära epiteliala organoider, Simian et al. utvärderade nödvändiga faktorer för förgrening i bröst körtel7. Shamir et al. upptäckte att spridning kan ske utan en epitelial till mesenkymala över gång, ger insikt i den metastaserade kaskad8. Metoder för att generera och karakterisera organoider från bröst körtel vävnad är väl etablerade6,11,12,13. Men, såvitt vi vet, metoder för att odla bestrålade organoider från bröst körtlar har inte rapporter ATS. Ett protokoll för att odla och karakterisera bestrålade organoider skulle vara ett kritiskt steg i rekapitulera strålnings-inducerad immun-och tumör cell rekrytering.
I detta dokument rapporterar vi en metod för att odla och karakterisera bestrålade bröst epiteliala organoider i låg vidhäftning Mikroplattor belagda med en hydrofil polymer som stöder bildandet av sfäroider. Dessa organoider var co-odlade med makro Fager att undersöka immun cell infiltration kinetik. Detta arbete kan utvidgas till att omfatta co-culturing organoider med fett celler att upprepa bröst egenskaper, Breast Cancer celler att visualisera tumör cell rekrytering, och CD8 + T-celler för att studera tumör-immun cell interaktioner. Tidigare upprättade protokoll kan användas för att utvärdera bestrålade organoider. Tidigare modeller co-culturing bröst organoider och immun celler har belysa mekanismerna för metastaser och spridning. DeNardo et al. fann att CD4 + T cell reglering av tumörassocierade makro Fager förstärkt en metastaserad fenotyp av bröst adenocarcinom14. Samkulturmodeller har också använts för att belysa mekanismerna för biologisk utveckling. Plaks et al. klargjort rollen av CD4 + T-celler som ner-regulatorer av bröst organogenesen15. Men vår grupp är den första att etablera ett förfarande för att visualisera hur normal vävnads bestrålning påverkar immun cellernas beteende. Eftersom normal vävnads bestrålning har visat sig förbättra tumör cell rekrytering5, detta protokoll kan vidareutvecklas för att analysera hur tumör cell beteende ändras genom bestrålning av normal vävnad och celler, vilket leder till en större förståelse för recidiverat cancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djur studier har utförts i enlighet med de institutionella rikt linjer och protokoll som godkänts av Vanderbilt Universitys institution för djur omsorg och-användning.
1. beredning av möss och cell förvärv (anpassad från Nguyen-Ngoc et al.11)
- Offra atymiska nu/nu möss (8-10 veckor gamla) med hjälp av co2 kvävning följt av cervikal Dislokation. Rengör huden med 70% etanol.
- Resect buk-och ljumsk bröst körtlar från möss med pre-steriliserade sax och pincett. Ta bort lymf körtlar före resektion. Skölj i steril 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (figur 1a).
- Placera den i 15 mL rör med 10 mL av Dulbecco ' s Modified Eagle Media/näringsämne blandning F12 (DMEM/F12) för transport. Proverna kan hållas över natten vid 4 ° c eller bearbetas omedelbart. Håll på isen.
- Irradiera prover vid 20 Gy med hjälp av en cesium källa (figur 1b).
- 45 min efter bestrålning, placera bröst körtlar i en 35 mm steril cell platta och finhacka med skalpeller (figur 1c, D). Finhacka med cirka 40 slag tills vävnaden slappnar av och bitar erhålls som inte är större än ca 1 mm2 i området.
- Överför till kollagenaslösningen i ett 50 mL centrifugerör. Kollagenas lösning består av 2 mg/ml kollagenas (se tabell över material), 2 mg/ml trypsin, 5% v/v Foster nötkreatur serum (FBS), 5 μg/ml insulin, och 50 μg/ml gentamicin i DMEM/F12 media. Använd 10 ml kollagenas lösning per mus.
- Placera i ett vatten bad vid 37 ° c, vortexa var 10 min för 30-60 min. mat smältningen är klar när kollagenaslösningen är grumlig (figur 1e, F).
- Snurra ner den smälta lösningen på 450 x g i 10 min vid rums temperatur (RT). Tre lager kommer att följas. Den supernatanten består av fett, är det mellersta skiktet en vatten lösning, och botten är en pellet. Pelleten kommer att synas röd eftersom det är en blandning av epitelceller, enskilda stromaceller, och röda blod kroppar (figur 1g).
- Precoat alla Pipetter, pipettspetsar och centrifugrör med bovint serumalbumin (BSA) lösning före kontakt. BSA-lösning består av 2,5 w/v% BSA i Dulbecco ' s fosfatbuffrad saltlösning (DPBS). För pre-Coating, tillsätt sedan bort BSA lösning på insidan av pipettspetsen och rören. BSA-lösning kan återanvändas, även om det bör vara sterila filtreras före varje experiment.
- För ytterligare återhämtning, överför supernatanten till en fräsch BSA-belagd 15 mL tub. Pipettera upp och ner kraftigt för att skingra fett skiktet. Centrifugera vid 450 x g i 10 min vid RT. aspirera supernatanten, lämnar en liten mängd media i röret för att undvika aspirera cellpelleten.
- Aspirera vatten skiktet från röret med den ursprungliga pelleten.
- Tillsätt 10 mL DMEM/F12 till röret med den ursprungliga pelleten och överför till det andra röret. Pipettera kraftigt för att kombinera och omsuspendera de två pellets.
- Centrifugera vid 450 x g i 10 min vid RT. aspirera supernatanten och tillsätt 4 ml DMEM/F12 till röret.
- Tillsätt 40 μL deoxyribonuclease webbplats (DNase) till SUS pensionen och skaka försiktigt för hand för 2-5 min vid RT. DNase lösning består av 4 U/mL DNase i DMEM/F12.
- Tillsätt 6 mL DMEM/F12 och Pipettera noggrant. Centrifugera röret vid 450 x g i 10 min vid RT.
- Aspirera supernatanten till 0,5 mL-märket. Omsuspendera i 10 mL DMEM/F12 och Pipettera noggrant.
- Puls till 450 x g och stoppa 4 s efter att ha nått den hastigheten.
- Upprepa steg 1.16-1.17 tre gånger för att rena organoider via centrifugaldifferentiering. Pelleten ska nu vara en benvit färg som består av endast epiteliala organoider (figur 1H).
Obs: Organoider kan också filtreras med hjälp av sterila mesh 40 μm filter. Efter steg 1,16, Pipettera media som innehåller organoider genom ett filter i ett centrifugerör och skölj sedan med 5 till 10 mL DMEM/F12-medium. Vänd filtret över ett nytt 50 mL centrifugerör. Passera 10 mL DMEM/F12 Media genom, går det motsatta sättet att skölja bort eventuella retentate. Retentat bör bestå av organoider, och filtratet bör huvudsakligen bestå av stromaceller, som kan kasseras eller behållas om så önskas.
2. bestämning av densitet och plätering organoider
- Omsuspendera pelleten i 10 mL DMEM/F12. Pipettera noggrant för att skapa en homogen lösning.
- Överför 50 μL till en 30 mm petriskål och se under ett fas kontrast Mikroskop vid 20x. Räkna antalet organoider med en räknare.
Anmärkning: här har pipettspetsar genomgående använts med en minimal diameter på 457 μm, vilket är 5-10 gånger diametern på de organoider som är seedade. För överföring av volymer på 2 mL eller större (t. ex. steg 1,16 och 2,1), Använd serologiska pipetter med spets dia metrar som överstiger 1 500 μm. - Beräkna organoid densitet med hjälp av följande ekvation:
Den önskade densiteten är 1 000 organoider/mL för att förenkla ytterligare spädning. Om densiteten är för låg Centrifugera vid 450 x g i 5 min och aspirera media. Tillsätt material som behövs för att nå 1 000 organoider/mL och Pipettera noggrant för att skapa en homogen blandning.- Att odla organoider i en protein mat ris, frö organoider vid en koncentration av 1 organoid/L i kollagen typ 1 utspädd till 87% eller i källaren membran extraheras från Engelbreth-Holm-svärm mus sarkom. Medan du arbetar med prover, hålla på is.
- För att frysa organoider, överför önskad volym till ett separat centrifugeringsrör. Snurra på 450 x g i 5 min. aspirera media, och sedan lägga till samma volym 90% FBS/10% DMSO. Omsuspendera organoider, och sedan alikvot i kryorör. Överför till-80 ° c och sedan till flytande kväve inom en vecka.
- För att Tina, värm i en 37 ° c vatten bad för en min. Centrifugera vid 450 x g i 5 min, och sedan aspirera frys medier. Skölj med steril DPBS och centrifugera sedan igen. Aspirera DPBS och lägga organoid media.
- Pipettera 50 μL (50 organoider) i varje brunn på den låga adhesionsplattan (figur 1I).
- Tillsätt 150 μL organoid media för att få den totala arbets volymen till 200 μL. organoid Media består av 1% penicillin-streptomycin och 1% insulin-transferrin-selen (ITS) i DMEM/F12 media.
- Varje 2 dagar ersätta Media noggrant.
Obs: låg vidhäftning plattor är inte vävnad kultur behandlas; Därför kan cellerna enkelt lossas. Aspirera mediet långsamt genom att luta plattan och sätta pipettspetsen i kanten av varje brunn. Lämna en liten mängd media i botten av brunnen. Lägg till nya medier långsamt för att undvika att tillämpa onödiga skjuvkrafter till organoider.
3. co-culturing med makro Fager
- Upprätthålla GFP eller dTomato-märkta rå 264,7 makro Fager i DMEM Media kompletteras med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin. Frö 1 x 104, 5 x 104, eller 1 x 105 celler/ml till organoid-media.
- Använd levande cell fas kontrast och fluorescerande Imaging för att övervaka makro Fager infiltration över tiden.
4. immunofluorescens färgning av organoider
Obs: Organoider kan färgas i brunnar med låg friktion eller kan överföras till kammar bilder. För att överföra, Pipettera försiktigt upp och ner tills organoider har lossnat från plattorna. Överför till kammar glas och inkubera för 4-8 h så att organoider kan fästa vid plattytan.
- Ta bort organoid medium från brunnarna genom att försiktigt aspirera. Fix prover med 10% neutral buffrad formalin för 15 min vid RT.
- Tvätta 3x 5 min i 1x PBS. Om så önskas kan fasta prover förvaras vid 4 ° c i en vecka för vidare färgning.
- Permeabilize med 0,1% 4-(1, 1, 3, 3-tetrametylbutyl) fenyl-polyetylenglykol för 5 min.
Anmärkning: för att färga för F-aktin, Inkubera prover med phalloidin utspädd 1:1000 och 1,67 nM bisbenzimide kärn ämne i 1% PBS/BSA för 1 h vid RT. Fortsätt sedan till steg 4,8. - Bermeabilize med 0.5 PBS. Proverna kan förvaras på 4opy bilder och Immunofluorescerande bilder. mekanismer som bidrar till CTC-rlock med 5% normalt get serum i 0,1% PBS/polyetylenglykolsorbitanmonolaurat (PBST) för 1 h vid RT. tvätta 3x 5 min med PBS.
- Inkubera med anti-Cytokeratin 14 utspädd 1:1000, E-cadherin utspädd 1:200, eller tight Junction protein One utspädd 1:100 i 1% NGS i PBST för 1 h vid RT. tvätta 3x 5 min i PBST.
- Inkubera med Getantikanin sekundärt utspätt 1:200 med 1% NGS/PBST för 1 h vid RT. Täck med folie för att undvika ljus exponering.
- Tvätta 3x 5 min i PBS. Använd den nukleära färgen (se tabell över material) för att färga kärnor.
- Tvätta 3x 5 min i PBS. Om du använder kammar bild, montera med ett täckglas. Förvaras insvept i folie vid 4 ° c i upp till 2 veckor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bestrålade epiteliala bröst organoider framgångs rikt erhållits från mus bröst körtlar, bearbetas, och odlade på låg friktion plattor (figur 1). Organoid avkastning testades genom sådd i olika tillväxt miljöer (figur 2A-G). Seedning celler direkt på vävnad kultur behandlas 10 cm cell plattor gav en överväxt av fibroblast celler. Fibroblaster identifierades under fas kontrast mikroskopi i eller nära samma plan av fokus som organoider, och de växte snabbt ut från pläterade organoider inom några dagar. En utväxt av fibroblaster observerades också när organoider var seedade i källaren membran och kollagen proteinmatriser (figur 2e, F).
En mängd olika tillstånd testades för att optimera bestrålad organoid tillväxt (figur 2H). Kollagenas typ I och VIII från Clostridium histolyticum användes som enzym i organoid-rötnings steget12,16,17. Organoid avkastning var signifikant högre efter mat smältningen med kollagenas VIII. Detta kan bero på de renings processer som används för att framställa enzymet: kollagenastyp I är delvis renad och kan orsaka onödig skada på membran proteiner och receptorer, vilket leder till dålig organoid bildning, cell Lys, eller över-nedbrytning16 , 17 i den , 18. Inga signifikanta skillnader i avkastningen mellan bestrålade och kontrollorganoider observerades.
Bestrålade organoider kan odlas i låg adhesionsplattor (figur 3a-C) eller i Källar membran (figur 3D-G), men den snabbaste tillväxten inträffade i låg vidhäftnings plattor (figur 3H). Organoider redovisas bröst körtel egenskaper. Vita pilspetsar anger konstruktioner morfologiskt liknar kanaler och lober19, 20,21 (figur 3c), som är avgörande för produktion och transport av mjölk i bröst körtel21. Emellertid, ytterligare karakterisering krävs för att bekräfta denna observation. Tillväxt trender indikerade att icke-bestrålade organoider växte snabbare än bestrålade organoider (figur 3H), troligen på grund av cell tillväxt arrest till följd av mekanismer för reparation av DNA-skador; trenden var dock inte statistiskt signifikant22. Enstaka klumpar av låg vidhäftning organoider observerades, och organoider kan odlas upp till två veckor innan dissociera.
Organoider uttryckte epiteliala egenskaper, som utvärderades genom immunofluorescens färgning av cytokeratin 14 (k14), e-cadherin (e-CAD), och tight Junction protein 1 (zo-1)23,24,25 ( Figur 4). Bestrålade organoider uttryckte epiteliala markörer. K14, en markör för myoepitel23, uttryck tes starkt på ytan av bestrålade organoider (figur 4a). Dessutom uttryck tes E-CAD och ZO-1 inom cellulära korsningar av organoider (figur 4b, C). Dessa proteiner är nödvändiga för korrekt celladhesion24. Efter bestrålning fortsatte organoider att behålla sina epiteliala egenskaper.
Fluorescerande färgning av organoider kan visualiseras inom låg adhesionsplattor med fluorescensmikroskopi (figur 5a-D); den tydligaste visualiseringen erhölls dock via konfokalmikroskopi (figur 5E-F). Korrigerad total fluorescensintensiteten beräknades genom att man subtraherade bakgrunden och normaliserades av organoid-området (figur 5G). Växande organoider i 96-brunn låg vidhäftning plattor också förenklat co-Culture experiment. När det seedade vid koncentrationer typiska i bröst körtel, makrofagco-lokaliserad med kontroll och bestrålade organoider (figur 6)24,26.
I figur 1. Metod arbets flöde. (A) bröst körtlar återfördes från möss. Buk-och ljumsk bröst körtlar användes. Bbröst körtlar bestrålades i 50 ml centrifugrör som innehöll DMEM/F12-medier. Cbröst körtlar överfördes till sterila sex-well-plattor och kapades med kirurgiska skalpeller till malet (D). Ebröst körtlar överfördes till 50 ml centrifugrör med 5 ml steril DMEM/F12-Media per körtel och smälts i en kollagenas VIII-lösning (F). (G) efter att ha överförts till en 15 ml tub, var centrifugaldifferentiering utnyttjas för att avlägsna stromaceller, enstaka celler, och röda blod kroppar, observerades i en röd pellet (vit pil-huvud) tills endast vita epiteliala organoider erhölls (H ). (I). 50 organoider var pläterade i 200 μl av media i 96-väl låg vidhäftning plattor och avbildas med fas kontrast mikroskopi skalbar representerar 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
I figur 2. Organoid plätering i 3D-protein matriser och på vävnad kultur behandlad plast. Organoider seedade i kollagen (A) och källaren membran (B), avbildas efter 84 timmar av tillväxt. Utväxt av fibroblaster inträffade i matrixpläterade organoider (C, D). Fas kontrast bilder av organoider sorteras genom filtrering erhölls 192 timmar efter sådd. Inga större skillnader observerades mellan filtratet (E) och Retentat (F), och båda resulterade i konflytande fibroblasttillväxt. Celler i E och F var seedade på vävnad kultur behandlad plast. Efter trypsinizing för 5 min vid RT, fibroblaster togs bort via aspiration; kvarvarande epitelceller bildade dock en enskiktslager kultur istället för tredimensionella organoider (G). Skal streck för A-G representerar 100 μm.h) olika kollagenastyper (I (CI) och VIII (CVIII)) och cell bearbetnings metoder (filtrering och Centrifugaldifferentiering (cent diff)) testades och organoid avkastning per bröst körtel kvantifierade (n = 2 körtlar för CI, filter; 2 körtlar för CVIII, filter; 4 körtlar för CI, cent diff och 12 körtlar för CVIII, cent diff). Statistisk signifikans bestämdes med hjälp av en tvåstjärtad, oparade t-test, * * * p < 0,0001. Felstaplar representerar standard fel. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
I figur 3. Representativ organoid tillväxt. Fas kontrast bilder av bestrålad organoid tillväxt i låg adhesionsplattor erhållna 20 (a), 44 (B) och 106 (C) timmar efter sådd. Vita pilspetsar visar strukturer som har liknande morfologi för kanaler och lober. Fas kontrast bilder av bestrålad organoid tillväxt i källaren membran erhålls 42 (D), 66 (E), 60 (F), och 114 (G) timmar efter seedning. Skal streck representerar 50 μm. H. Area mätningar erhölls i olika odlings förhållanden: organoider omedelbart seedade efter mat smältning och sortering (bestrålade (●), kontroll (▪)), och organoider seedade i källaren membran (bestrålade (○), kontroll (□)) (n = 3 körtlar vardera). Områdes beräkningar gjordes med hjälp av ImageJ-programvaran. Felstaplar representerar standard fel. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
I figur 4. Epitelial markör uttryck på bestrålade Organoider. Cytokeratin 14 (k14, grön), en markör för det basala skiktet av skivepitelcancer och icke-skivepitelcancer epitel, uttryck tes på bestrålade organoider (a). E-cadherin (E-CAD), ett protein som är nödvändigt för vidhäftning, uttryck tes i korsningar mellan celler i bestrålade organoider (B). Tätt kopplings protein ett (ZO-1) uttryck tes också inom cell korsningar av bestrålade organoider (C). Bilder erhölls i kammar bilder via konfokalmikroskopi. En nukleinsyra fläcken användes för att visualisera kärnor (blå). Alla organoider fixerades och avbildades efter en veckas tillväxt. Skal streck är 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
I figur 5. F-aktin uttryck i organoider. F-Actin (röd), en mikrofilament i epitelceller, uttryck tes med lägre intensitet i icke-bestrålade organoider (a, C, E) än i bestrålat (B, D, F) organoider. En nukleinsyra fläcken användes för att visualisera kärnor (blå). Bilder togs på låg vidhäftning 96-well tallrikar (a, B) och 16-well kammar bilder (C, D). Bilder togs också med hjälp av konfokalmikroskopi (E, F). Alla organoider fixerades och avbildades efter en veckas tillväxt. Skal streck är 50 μm. G. Phalloidinfluorescensdata från bilder med låg adhesionsplattan kvantifierades i ImageJ (n = 3 körtlar). Felstaplar anger standard fel. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
I figur 6. Utvärdering cell-cell interaktioner genom macrophage-organoid co-Culture. Makro Fager (röd) infiltrerad kontroll (a) och bestrålade (B) organoider. Skal streck representerar 50 μm. Genomsnittligt procent område av makro Fager i bild fältet (C) rapporterades vid 24 timmars samodling för kontroll (gul) och bestrålade (orangefärgade) organoider (n = 3 körtlar för varje prov). Makro Fager var seedade vid koncentrationer av 10 000 celler/ml, 50 000 celler/ml, och 100 000 celler/ml, och deras infiltration fångades var 30 minuter via levande cell fluorescens Imaging. Alla samkulturer experiment inleddes 7 dagar efter initial organoid sådd. Statistisk signifikans bestämdes med hjälp av en tvåstjärtad, oparade t-test, * p < 0.05, * * * p < 0,0001. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll har vi utvecklat en metod för reproducerbar tillväxt och karakterisering av bestrålade bröstorganoider (figur 1). En bestrålning dos av 20 Gy tillämpades för att spegla tidigare in vivo modeller av tumör cell rekrytering5. Bestrålning av bröst körtlar ex vivo före organoid bildning tillåtet för isolering av strålning skador effekter utan en motsvarande infiltration av immun celler. Utvecklingen av en in vitro bestrålad normal vävnads modell möjliggör real tids visning av cellulära interaktioner som kan bidra till strålning inducerad CTC rekrytering11,12.
Noga efter steg 1.5-1,18 var kritisk för att maximera organoid avkastning. Vi har lagt tinade Ali kvoter av koncentrerade kollagenas till matsmältnings systemet lösningen. På grund av den mycket trög flytande arten av den koncentrerade kollagenasen Ali kvoten, kan det finnas vissa variationer i mängden och därför i enzymatisk aktivitet, så organoid mat smältning måste övervakas noga för att undvika över-nedbrytning. Det är också viktigt att smälta organoider i en 50 mL tub eftersom detta möjliggör en jämn yta för mat smältningen. Andra studier har använt filtrering för rening av organoider19,23; men vi fick en mycket högre avkastning rening med centrifugaldifferentiering (figur 2H). Pre-Coating Pipetter, pipettspetsar och centrifugrör med BSA-lösningen är avgörande för att maximera avkastningen. Organoider fästa märkbart på obestruket plast när lösningen ansökan för summas.
Stor försiktighet måste iakttas för att undvika aspirera organoider. Detta är en risk som uppstår vid rening, byte av media, och färgning för fluorescerande markörer. Med hjälp av låg vidhäftning plattor för tillväxt möjliggör enkel överföring av organoider och tar bort behovet av organoider som skall sektioneras i ULT för ytterligare färgning, ett förfarande som krävs för källaren membran inbäddade organoider11. Förutom fördelar från överlägsen tillväxt, sådd bestrålade organoider i låg vidhäftning plåtar krävde färre steg och var mindre tekniskt utmanande än odling av organoider i källaren membran eller kollagen. Men när färgning för markörer, kan det vara bra att Visa organoider under ett Mikroskop för att säkerställa att oavsiktlig aspiration inte inträffar.
Dessutom finns det många överväganden som måste redovisas när Imaging organoider. Inom basal membran inbäddade organoider, enstaka fibroblasttillväxt kan observeras (figur 2C, D). Fibroblast utväxt i 3D odlade organoider kan orsakas av organoider att ta kontakt med vävnad kultur behandlad yta som adhesion leder till uppreglerad fibroblast tillväxtfaktor produktion i anhängare celler27. Intressant, morfologi av dessa fibroblaster är slående liknar pre-adipocyter som båda cell typer uppvisar spindly, långsträckt former28. Vid ytterligare undersökning kan exponering för insulin, dexametason och 3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX) ge celler med en adipogen härstamning, Sporring en över gång mot en mer sfärisk cellulär form associerad med adipocyter28, 29. vi fick tydliga bilder med fas kontrast mikroskopi av fritt växande låg vidhäftning (figur 3a-C) och källare membran inbäddade (figur 3D-G) organoider. Spårning individuell organoid tillväxt i låg vidhäftning plattor var dock svårt på grund av minimala fokala sammanväxningar mellan cellerna och väl yta, vilket resulterar i organoid rörelse och tillfällig aspiration.
När färgade för ytmarkörer, konfokalmikroskopi återges tydligare markör lokalisering (figur 5E, F) än widefield mikroskopi (figur 5a-D). Från fluorescenskvantifiering tyder trender i phalloidinuttrycket på att bestrålade organoider uttryckte ökad F-aktin i förhållande till kontrollen (figur 5G). Actin cytoskelettet om organisation har observerats i dermal mikrovaskulära endotelceller bestrålas vid liknande doser30.
För utökade bildsekvenser, som tid förflutit co-Culture med immun celler (figur 6), en levande cell Imaging kammare med fukt och co2 kontroll krävs31. Levande cell bilder tagna var 30: e minut avslöjade att makro Fager är samlokaliserade med organoider efter 24 timmar (figur 6a, B), som företrädes vis migrerar mot bestrålade Organoider (figur 6c). Makrofaginfiltration i bestrålad normal vävnad har observerats in vivo, tillskrivs chemokine och cytokin gradienter, och vanligt vis föregår CTC rekrytering5. Framtida studier kommer att utvärdera klassiskt och alternativt aktiverade makrofaginteraktioner med organoider som polariserad makrofag dynamik kan spela en viktig roll för att fastställa svar på strålning32,33. Ytterligare analyser kommer att utvärdera konsekvensen av serum svält och tillväxt effekterna av odling av organoider i kompletta medier eftersom dessa variabler kan ha betydande effekter på organoid-immuna cellinteraktioner. Detta system kan ytterligare anpassas för samodling med andra cell typer, inklusive CD8 + T-celler, stromaceller, adipocyter, och bröst cancer celler. Observation i real tid med tekniker som levande cell avbildning kommer att under lätta klargörande av potentiella mekanismer som bidrar till CTC-rekrytering till bestrålad normal vävnad, vilket kan få betydande konsekvenser för patienter som lider av återkommande Och TNBC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Laura L. Bronsart för att ge GFP och dTomato-märkta RAW 264,7 makro Fager. Denna forskning stöddes ekonomiskt av NIH Grant #R00CA201304.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| Anti-cytokeratin 14 | abcam | ab181595 | Lot: GR3200524-3 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1933-25G | |
| Collagen Type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII | Sigma | C2139 | |
| Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 11320-033 | |
| DNAse | Roche | 10104159001 | |
| DPBS | Fisher | 14190250 | |
| E-Cadherin | Cell Signaling | 24E10 | Lot: 13 |
| FBS | Sigma | F0926 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750 | |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150077 | green Lot: GR3203000-1 |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150080 | red Lot: GR3192711-1 |
| Hoechst 33342 | Fisher | 62249 | Lot: TG2611041 |
| Insulin (10 mg/mL) | Sigma | I9278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium, 100x | Gibco | 51500-056 | |
| Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma) | Corning | 356237 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Nuclon Sphera 96 well plates | Thermo | 174927 | |
| PBS | VWR | 10128-856 | |
| Pen/strep | Fisher | 15140122 | |
| Phalloidin | abcam | ab176757 | Lot: GR3214582-16 |
| Tight Junction Protein 1 | Novus | NBP1-85047 | Lot: C115428 |
| Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol) | Sigma | X100-100ML | |
| Trypsin | Gibco | 27250-018 | |
| Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate) | Sigma | P1379-100ML |
References
- Lautner, M., et al. Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer. Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).
- Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).
- Kim, M. Y., et al. Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
- Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
- Rafat, M., et al. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients. Cancer Research. 78 (15), 4241-4252 (2018).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells. Development. 128, Cambridge, England. 3117-3131 (2001).
- Shamir, E. R., et al. Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin. Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).
- Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis. Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).
- Nguyen-Ngoc, K. -V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).
- Nguyen-Ngoc, K. -V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. 3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion. Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).
- Ewald, A. J. Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews. , (2018).
- DeNardo, D. G., et al. CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages. Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).
- Plaks, V., et al. Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis. Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).
- Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum. The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).
- Mandl, I., Zaffuto, S. F. Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase. The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Zhang, L., et al. Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells. Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).
- Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).
- Richert, M. M., et al. An atlas of mouse mammary gland development. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).
- Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
- LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
- Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution. Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).
- Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).
- Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium. Development. 137, Cambridge, England. 4229-4238 (2010).
- Ingber, D., Folkman, J. Mechanochemical switching between growth and differentiation during fibroblast growth factor-stimulated angiogenesis in vitro: role of extracellular matrix. The Journal of Cell Biology. 109 (July), Available from: http://jcb.rupress.org/content/109/1/317.abstract (1989).
- Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. Understanding Adipocyte Differentiation. Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Gabryś, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).
- Ewald, A. J. Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).
- Zhang, M., et al. A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients. Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).
- Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time. BioMed Central Cancer. 10, 112 (2010).
