Summary
Organoids utviklet fra mus melkekjertlene var bestrålt og preget til å vurdere epitel trekk og interaksjoner med immunceller. Bestrålt organoids kan brukes til å bedre evaluere celle-celle interaksjoner som kan føre til tumor celle rekruttering i bestrålt normalt vev.
Abstract
Organoids avledet fra fordøyd vevet er flercellede tredimensjonale (3D) konstruksjoner som bedre recapitulate in vivo forhold enn celle monolagere. Selv om de ikke kan helt modell in vivo kompleksitet, beholder de noe funksjonalitet i det opprinnelige organet. I kreft modeller, organoids er ofte brukt til å studere tumor celle invasjon. Denne protokollen har som mål å utvikle og karakterisere organoids fra normal og bestrålt mus melke kjertel vev å evaluere strålingen respons i normalt vev. Disse organoids kan anvendes på fremtidige in vitro kreft studier for å evaluere tumor celle interaksjoner med bestrålt organoids. Melkekjertlene ble resected, bestrålt til 20 gy og fordøyd i en kollagenase VIII-løsning. Epitel organoids ble separert via sentrifugal differensiering, og 3D-organoids ble utviklet i 96-brønn lav vedheft mikroplater. Organoids uttrykte den karakteristiske epitel markøren cytokeratin 14. Macrophage interaksjon med organoids ble observert i co-kultur eksperimenter. Denne modellen kan være nyttig for å studere tumor-stromal interaksjoner, infiltrasjon av immunceller, og macrophage polarisering innenfor en bestrålt mikromiljøet.
Introduction
Omtrent 60% av de trippel negative brystkreft (TNBC) pasienter velger bryst-bevaring terapi (BCT) som en form for behandling1. I denne behandlingen modalitet, svulsten som inneholder en del av brystvevet er fjernet, og det omkringliggende normalt vev utsettes for ioniserende stråling å drepe noen gjenværende tumorceller. Behandling reduserer gjentakelse i store deler av brystkreft populasjonen; men ca 13,5% av behandlede pasienter med TNBC erfaring locoregional gjentakelser2. Derfor studerer hvordan stråling kan rekruttere sirkulerende tumorceller (CTC) vil føre til viktig innsikt i lokale gjentakelse3,4.
Tidligere arbeid har vist at stråling av det normale vevet øker rekrutteringen av ulike celletyper5. I pre-kliniske modeller av TNBC, bestråling av normalt vev økt macrophage og senere tumor celle rekruttering til normal vev5. Immun status påvirket tumor celle rekruttering til bestrålt områder, med tumor celle migrasjon observert i immunsupprimerte. Recapitulating disse interaksjoner bruker organoids avledet fra brystkjertler vil tillate observasjon av celle migrasjon og celle-stromal interaksjoner i sanntid med mikroskopi og live celle Imaging å bestemme rollen av stråling skade i endring tumor celle atferd.
Mus melke organoids har hjulpet belyse viktige trinn i utviklingen av melkekjertlene. En bryst organoid er en flercellede, tredimensjonal konstruksjon av isolert bryst epitel som er større enn 50 μm6,7,8,9,10. Ved bruk av primær epitel organoids, Simian et al. evaluert nødvendige faktorer for forgrening i melkekjertlene7. Shamir et al. oppdaget at formidling kan skje uten et epitel til mesenchymal overgang, gir innsikt i metastatisk Cascade8. Metoder for generering og karakteriserer organoids fra melke kjertel vevet er godt etablert6,11,12,13. Imidlertid, å våre kunnskap, metoder for voksing bestrålt organoids fra bryst kjortelen ha ikke blitt rapportere. En protokoll for dyrking og karakteriserer bestrålt organoids ville være et kritisk skritt i recapitulating stråling-indusert immun-og tumor celle rekruttering.
I denne utredningen, rapporterer vi en metode for dyrking og karakteriserer bestrålt bryst epitel organoids i lav vedheft mikroplater belagt med en hydrofile polymer som støtter dannelsen av spheroids. Disse organoids var co-kultivert med makrofager for å undersøke immun celle infiltrasjon Kinetics. Dette arbeidet kan utvides til å omfatte co-dyrking organoids med fett celler å recapitulate melke egenskaper, brystkreftceller for å visualisere tumor celle rekruttering, og CD8 + T-celler for å studere tumor-immun celle interaksjoner. Tidligere etablerte protokoller kan brukes til å evaluere bestrålt organoids. Tidligere modeller co-dyrking bryst organoids og immunceller har belyse mekanismer for metastasering og formidling. DeNardo et al. fant at CD4 + T celle regulering av tumor tilknyttede makrofager forbedret en metastatisk fenotype av bryst adenocarcinomas14. Co-kultur modeller har også blitt brukt til å belyse mekanismer for biologisk utvikling. Plaks et al. avklart rolle CD4 + T celler som ned-regulatorer av bryst organogenesen15. Men vår gruppe er den første til å etablere en prosedyre for å visualisere hvordan normal vev bestråling påvirker immun celle atferd. Fordi normal vev bestråling har vist seg å forbedre tumor celle rekruttering5, kan denne protokollen utvikles videre for å analysere hvordan tumor celle atferd er endret ved bestråling av normalt vev og celler, som fører til en større forståelse av kreft tilbakefall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrestudier ble utført i samsvar med institusjonelle retningslinjer og protokoller godkjent av Vanderbilt University institusjonelle Animal Care og use Committee.
1. utarbeidelse av mus og celle oppkjøp (tilpasset fra Nguyen-Ngoc et al.11)
- Offer athymic nu/nu mus (8-10 uker gamle) ved hjelp av CO2 kvelning etterfulgt av cervical forvridning. Rengjør huden med 70% etanol.
- Resect abdominal og lysken brystkjertler fra mus ved hjelp av pre-sterilisert saks og tang. Fjern lymfeknuter før reseksjon. Skyll i sterilt 1x fosfat bufret saltvann (PBS) (figur 1a).
- Plasser den i 15 mL rør med 10 mL Dulbecco ' s modifisert Eagle Media/næringsstoff blanding F12 (DMEM/F12) for transport. Prøvene kan oppbevares over natten ved 4 ° c eller behandles umiddelbart. Fortsett isen.
- Irradiate prøver ved 20 gy ved hjelp av en cesium kilde (figur 1B).
- 45 min etter bestråling, Legg brystkjertlene i en steril celle plate på 35 mm og hakke med skalpeller (fig. 1C, D). Hakke med ca 40 slag til vevet slapper av og brikkene er innhentet som ikke er større enn ca 1 mm2 i området.
- Overføring til den kollagenase løsningen i et 50 mL sentrifugerør. Kollagenase løsning består av 2 mg/mL kollagenase (se tabell over materialer), 2 mg/ml Trypsin, 5% v/v fosterets serum (FBS), 5 μg/ml insulin, og 50 μg/ml GENTAMICIN i DMEM/F12 medier. Bruk 10 mL kollagenase oppløsning per mus.
- Plasser i et vannbad ved 37 ° c, virvlingen hver 10 min for 30-60 min. fordøyelsen er fullført når kollagenase-oppløsningen er uklar (figur 1e, F).
- Spin ned fordøyd løsningen på 450 x g i 10 min ved romtemperatur (RT). Tre lag vil bli observert. Supernatanten består av fett, det midterste laget er en vandig løsning, og bunnen er en pellet. Pellet vises rød som det er en blanding av epitelceller, individuelle stromal celler, og røde blodlegemer (figur 1g).
- Precoat alle Pipetter, pipette spisser og sentrifugerør med blod serum albumin (BSA) løsning før kontakt. BSA-løsningen består av 2,5 w/v% BSA i Dulbecco ' s fosfat bufret Saline (DPBS). For pre-coating, bare legg deretter fjerne BSA løsning på innsiden av pipette spissen og rør. BSA-løsningen kan brukes om igjen, selv om den bør være steril filtrert før hvert eksperiment.
- For ytterligere utvinning, Overfør supernatanten til en frisk BSA belagt 15 mL tube. Pipetter opp og ned kraftig for å spre fett lag. Sentrifuger på 450 x g for 10 min ved RT. aspirer den supernatanten, etterlot en liten mengde medier i røret for å unngå aspirating cellen pellet.
- Aspirer det vandige laget fra røret med den opprinnelige pellet.
- Tilsett 10 mL DMEM/F12 til røret med den opprinnelige pellet og overføre til det andre røret. Pipetter kraftig for å kombinere og resuspend de to pellets.
- Sentrifuger på 450 x g i 10 min ved RT. aspirer supernatanten og tilsett 4 ml DMEM/F12 til røret.
- Tilsett 40 μL av deoxyribonuclease (DNase) til suspensjonen og rist forsiktig for hånd for 2-5 min ved RT. DNase løsning består av 4 U/mL DNase i DMEM/F12.
- Tilsett 6 mL DMEM/F12 og Pipetter grundig. Sentrifuger røret ved 450 x g i 10 min ved RT.
- Aspirer supernatanten til 0,5 mL-merket. Resuspend i 10 mL DMEM/F12 og Pipetter grundig.
- Pulse til 450 x g og Stop 4 s etter å ha nådd den hastigheten.
- Gjenta trinn 1.16-1.17 tre ganger for å rense organoids via sentrifugal differensiering. Pellet skal nå være en off-White farge bestående av bare epitel organoids (figur 1h).
Merk: Organoids kan også filtreres ved hjelp av sterile mesh 40 μm filtre. Etter trinn 1,16, pipette medier som inneholder organoids gjennom et filter i et sentrifugerør, og skyll med 5 til 10 mL DMEM/F12 medier. Vend filteret over et nytt 50 mL sentrifugerør. Pass 10 mL DMEM/F12 Media gjennom, går den motsatte måten å skylle av eventuelle retentate. Retentate skal bestå av organoids, og Filtrer skal hovedsakelig bestå av stromal celler, som kan kastes eller oppbevares hvis ønskelig.
2. bestemme tetthet og plating organoids
- Resuspend pellet i 10 mL DMEM/F12. Pipetter grundig for å skape en homogen løsning.
- Overfør 50 til en 30 mm Petri-rett, og se under et mikroskop med fase kontrast på 20x. Tell antall organoids med en telle teller.
Merk: her har Pipetter blitt konsekvent brukt med en minimal diameter på 457 μm, som er 5-10 ganger diameteren på organoids som er sådd. For overføring av volumer på 2 mL eller større (for eksempel trinn 1,16 og 2,1), bruk serologisk Pipetter med spissdiameter som overstiger 1 500 μm. - Beregn organoid tettheten ved hjelp av følgende ligning:
Den ønskede tettheten er 1 000 organoids/mL for å forenkle ytterligere fortynning. Hvis tettheten er for lav, sentrifuger på 450 x g for 5 min og aspirer Media. Legg til medier nødvendig for å nå 1 000 organoids/mL, og Pipetter grundig for å skape en homogen blanding.- Å vokse organoids i et protein matrise, frø organoids ved en konsentrasjon av 1 organoid/L i kollagen type 1 fortynnet til 87% eller i kjelleren membran utvunnet fra Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom. Mens du arbeider med prøver, holde på isen.
- For å fryse organoids, Overfør ønsket volum til et separat sentrifugerør. Spin ned på 450 x g for 5 min. aspirer Media, og deretter legge til samme volum på 90% FBS/10% DMSO. Resuspend organoids, og deretter alikvot i cryotubes. Overfør til-80 ° c, og deretter til flytende nitrogen i løpet av en uke.
- Å tine, varm i en 37 ° c vannbad i en min. sentrifuger ved 450 x g i 5 min, og deretter aspirer frysing Media. Skyll med steril DPBS, og deretter sentrifuger igjen. Aspirer DPBS og legge til organoid Media.
- Pipetter 50 μL (50 organoids) i hver brønn av den lave festeplaten (figur 1I).
- Tilsett 150 μL av organoid medier for å få det totale arbeids volumet til 200 μL. Organoid medium består av 1% penicillin-Streptomycin og 1% insulin-transferrin-selen (ITS) i DMEM/F12 medier.
- Hver 2 dager erstatte Media nøye.
Merk: lav vedheft platene er ikke vev kultur behandlet; cellene kan derfor enkelt kobles fra. Aspirer Media langsomt ved å vippe platen og sette inn pipette spissen på kanten av hver brønn. Legg igjen en liten mengde medier i bunnen av brønnen. Legg til nye medier langsomt for å unngå å påføre unødvendige skjærkrefter på organoids.
3. co-dyrking med makrofager
- Oppretthold GFP eller dTomato-merket RAW 264,7 makrofager i DMEM Media supplert med 10% FBS og 1% penicillin-Streptomycin. Seed 1 x 104, 5 x 104, eller 1 x 105 celler/ml i organoid Media.
- Bruk Live celle fase kontrast og fluorescerende bilder til å overvåke macrophage infiltrasjon over tid.
4. Immunofluorescence farging av organoids
Merk: Organoids kan være beiset i lav vedheft brønner eller kan overføres til kammer lysbilder. For å overføre, forsiktig pipette opp og ned til organoids har løsrevet fra platene. Overfør til kammer sklier og ruge for 4-8 h for å tillate organoids å følge plateoverflaten.
- Fjern organoid medium fra brønnene ved nøye aspirating. Fix prøver med 10% nøytral bufret formalin i 15 min ved RT.
- Vask 3x 5 min i 1x PBS. Om ønskelig kan faste prøver oppbevares ved 4 ° c i en uke for ytterligere farging.
- Permeabilize med 0,1% 4-(1, 1, 3, 3-Tetramethylbutyl) fenyl-polyetylen-glykol i 5 min.
Merk: for å farge for F-utgangen, ruge prøver med phalloidin fortynnet 1:1000 og 1,67 nM bisbenzimide kjernefysisk fargestoff i 1% PBS/BSA for 1 time ved RT. Fortsett deretter til trinn 4,8. - Bermeabilize med 0,5 PBS. Prøvene kan lagres på 4opy bilder og immunofluorescent bilder. mekanismer som bidrar til CTC rlock med 5% normal geit serum i 0,1% PBS/polyetylen glykol sorbitan sorbierittmonolaurat (PBST) for 1 h ved RT. vask 3x 5 min med PBS.
- Ruge med anti-Cytokeratin 14 utvannet 1:1000, E-Cadherin utvannet 1:200, eller tight Junction protein en fortynnet 1:100 i 1% NGS i PBST for 1 time ved RT. vask 3x 5 min i PBST.
- Ruge med Goat anti-Rabbit sekundær fortynnet 1:200 med 1% NGS/PBST for 1 time ved RT. dekk med folie for å unngå lys eksponering.
- Vask 3x 5 min i PBS. Bruk det kjernefysiske fargestoffet (se tabell over materialer) for å flekk kjerner.
- Vask 3x 5 min i PBS. Hvis du bruker kammer slide, Monter med en dekkglass. Oppbevares innpakket i folie ved 4 ° c i opptil 2 uker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bestrålt epitel bryst organoids ble vellykket innhentet fra mus melkekjertler, bearbeidet, og kultivert på lav-vedheft plater (figur 1). Organoid yield ble testet av seeding i ulike vekst miljøer (figur 2a-G). Seeding celler direkte på vev kultur behandlet 10 cm celle plater gitt en overvekst av Fibroblast celler. Fibroblaster ble identifisert under fase kontrast mikroskopi i eller i nærheten av samme planet av fokus som organoids, og de raskt vokste ut fra belagt organoids i løpet av få dager. En utvekst av fibroblaster ble også observert da organoids ble sådd i kjelleren membran og kollagen protein matriser (figur 2e, F).
En rekke forhold ble testet i optimalisering av bestrålt organoid vekst (fig. 2h). Kollagenase typer I og VIII fra histolyticum ble brukt som enzymet i organoid fordøyelsen trinn12,16,17. Organoid rentene var signifikant høyere etter fordøyelsen med kollagenase VIII. Dette kan skyldes rensing prosessene som brukes i produksjonen av enzymet: kollagenase type jeg er delvis renset og kan forårsake unødig skade på membran proteiner og reseptorer, som fører til dårlig organoid dannelse, cellelyse, eller over-fordøyelsen16 , 17 i , 18. ingen signifikante forskjeller i avkastning mellom bestrålt og kontroll organoids ble observert.
Bestrålt organoids kan være kultivert i lav vedheft plater (figur 3a-C) eller innen kjeller membran (figur 3D-G), men den mest raske veksten skjedde i lav vedheft plater (figur 3h). Organoids sammenfattet bryst kjertel egenskaper. Hvite pilspisser indikerer konstruksjoner morfologisk ligner på kanaler og fliker19, 20,21 (figur 3c), som er avgjørende for produksjon og transport av melk i melkekjertlene21. Men ytterligere karakterisering er nødvendig for å bekrefte denne observasjonen. Veksttrender indikerte at ikke-bestrålt organoids vokste raskere enn bestrålt organoids (figur 3t), mest sannsynlig på grunn av cellevekst arrest som følge av MEKANISMER av DNA skade reparasjon; trenden var imidlertid ikke statistisk signifikant22. Sporadisk klumper av lav vedheft organoids ble observert, og organoids kan være kultivert opptil to uker før dissociating.
Organoids uttrykte epitel egenskaper, som ble evaluert gjennom immunofluorescence farging av Cytokeratin 14 (K14), e-Cadherin (e-CAD), og tight Junction protein 1 (zo-1)23,24,25 ( Figur 4). Bestrålt organoids uttrykte epitel markører. K14, en markør av myoepithelium23, ble uttrykt sterkt på overflaten av bestrålt Organoids (figur 4a). I tillegg ble E-CAD og ZO-1 uttrykt i cellulære knutepunkter av organoids (figur 4b, C). Disse proteinene er avgjørende for riktig celle vedheft24. Etter bestråling fortsatte organoids å beholde sine epitel egenskaper.
Fluorescerende flekker av organoids kan være visualisere innenfor lav vedheft plater ved hjelp av fluorescens mikroskopi (figur 5a-D); Imidlertid ble den klareste visualiseringen innhentet via konfokalmikroskopi mikroskopi (figur 5e-F). Korrigert total fluorescens intensitet ble beregnet ved å trekke fra bakgrunnen og normalisering av organoid område (figur 5G). Økende organoids i 96-brønn lav vedheft plater også forenklet co-kultur eksperimenter. Når seeded ved konsentrasjoner typisk i bryst kjertel, makrofager Co-lokalisert med kontroll og bestrålt organoids (figur 6)24,26.
Figur 1. Metode arbeidsflyt. (A) melkekjertlene var resected fra mus. Abdominal og lysken brystkjertler ble brukt. (B) melkekjertlene ble bestrålt i 50 ml sentrifugerør som inneholder DMEM/F12 medier. (C) brystkjertlene ble overført til sterile seks-brønn plater og skåret med kirurgisk skalpeller til hakket (D). (E) brystkjertlene ble overført til 50 ml sentrifugerør inneholdende 5 ml sterile DMEM/F12 medier per kjertel og fordøyd i en kollagenase VIII-løsning (F). (G) etter å ha blitt overført til en 15 ml tube, sentrifugal differensiering ble benyttet for å fjerne stromal celler, enkeltceller, og røde blodlegemer, observert i en rød pellet (hvit pil-hode) til bare hvite epitel organoids ble innhentet (H ). (I). 50 organoids ble belagt i 200 μL av medier i 96-vel lav vedheft plater og avbildet ved hjelp av fase kontrast mikroskopi Scale bar representerer 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Organoid plating i 3D protein matriser og på tissue kultur behandlet plast. Organoids seeded i kollagen (A) og kjeller membran (B), avbildet etter 84 timer med vekst. Utvekst av fibroblaster oppstod i Matrix belagt organoids (C, D). Fase kontrast bilder av organoids sortert gjennom filtrering ble innhentet 192 timer etter seeding. Ingen store forskjeller mellom Filtrer (E) og Retentate (F) ble observert, med begge resulterer i confluent Fibroblast vekst. Celler i E og F ble sådd på vev kultur behandlet plast. Etter trypsinizing i 5 minutter ved RT ble fibroblaster fjernet via aspirasjon; imidlertid dannet gjenværende epitelceller en monolag kultur i stedet for tredimensjonale organoids (G). Skala stolper for A-G representerer 100 μm. (H) forskjellige kollagenase typer (I (CI) og VIII (CVIII)) og celle behandlingsmetoder (filtrering og sentrifugal differensiering (cent diff)) ble testet, og organoid yield per melke kjertel ble kvantifisert (n = 2 kjertler for CI, filter; 2 kjertler for CVIII, filter; 4 kjertler for CI, cent diff, og 12 kjertler for CVIII, cent diff). Statistisk betydning ble fastslått ved hjelp av en tosidig, ikke-sammenkoblet t-test, * * * p < 0.0001. Feilfelt representerer standard feil. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Representative Organoid vekst. Fase kontrast bilder av bestrålt organoid vekst i lav vedheft plater innhentet 20 (A), 44 (B), og 106 (C) timer etter seeding. Hvite pilspisser indikerer strukturer som har lignende morfologi til kanaler og fliker. Fase kontrast bilder av bestrålt organoid vekst i kjeller membran innhentet 42 (D), 66 (E), 60 (F), og 114 (G) timer etter seeding. Skala stolper representerer 50 μm. H. Areal målinger ble oppnådd i ulike vekstforhold: organoids umiddelbart seeded etter fordøyelsen og sortering (bestrålt (●), kontroll (▪)), og organoids seeded i kjelleren membran (bestrålt (○), kontroll (□)) (n = 3 kjertler hver). Areal beregninger ble gjort ved hjelp av ImageJ programvare. Feilfelt representerer standard feil. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Epitel markør uttrykk på bestrålt Organoids. Cytokeratin 14 (K14, grønn), en markør for basal laget av plateepitel og ikke-plateepitel prolifererende, ble uttrykt på bestrålt organoids (a). E-cadherin (E-CAD), et protein viktig for vedheft, ble uttrykt i veikryss mellom celler i bestrålt organoids (B). Tight veikryss protein en (ZO-1) ble også uttrykt i celle kryss av bestrålt organoids (C). Bilder ble innhentet i kammeret lysbilder via konfokalmikroskopi mikroskopi. En nukleinsyre syre flekken ble brukt til å visualisere kjerner (blå). Alle organoids ble fikset og avbildet etter en uke med vekst. Skala barer er 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. F-utgangen uttrykk i organoids. F-utgangen (rød), en microfilament i epitelceller, ble uttrykt med lavere intensitet i ikke-bestrålt organoids (a, C, E) enn i bestrålt (B, D, F) organoids. En nukleinsyre syre flekken ble brukt til å visualisere kjerner (blå). Bildene ble tatt på lav vedheft 96-brønn plater (A, B) og 16-brønn kammer lysbilder (C, D). Bilder ble også tatt ved hjelp konfokalmikroskopi mikroskopi (E, F). Alle organoids ble fikset og avbildet etter en uke med vekst. Skala barer er 50 μm. G. Phalloidin fluorescens data fra lav vedheft plate bilder ble kvantifisert i ImageJ (n = 3 kjertler). Feilfelt angir standard feil. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Evaluere celle-celle interaksjoner gjennom macrophage-organoid co-kultur. Makrofager (rød) infiltrere kontroll (A) og bestrålt (B) organoids. Vektstenger representerer 50 μm. Gjennomsnittlig prosent område av makrofager i bildefeltet (C) ble rapportert på 24 timer med co-kultur for kontroll (gul) og bestrålt (oransje) organoids (n = 3 kjertler for hver prøve). Makrofager ble sådd i konsentrasjoner av 10 000 celler/mL, 50 000 celler/mL, og 100 000 celler/mL, og deres infiltrasjon ble tatt hver 30 minutter via live celle fluorescens Imaging. Alle co-kultur eksperimenter startet 7 dager etter første organoid seeding. Statistisk betydning ble fastslått ved hjelp av en tosidig, ikke-sammenkoblet t-test, * p < 0,05, * * * p < 0.0001. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen har vi utviklet en metode for reproduserbar vekst og karakterisering av bestrålt melke organoids (figur 1). En bestråling dose av 20 gy ble brukt til speilet tidligere in vivo modeller av tumor celle rekruttering5. Bestråling av brystkjertler ex vivo før organoid dannelse tillatt for isolering av strålings skade effekter uten en tilsvarende infiltrasjon av immunceller. Utviklingen av en in vitro bestrålt normal vev modell muliggjør sanntids visning av mobilnettet interaksjoner som kan bidra til stråling indusert CTC rekruttering11,12.
Nøye følgende trinn 1.5-1.18 var avgjørende for å maksimere organoid yield. Vi har lagt tint alikvoter av konsentrert kollagenase til fordøyelses løsningen. På grunn av den svært viskøs natur konsentrert kollagenase alikvot, kan det være noen variasjoner i mengden og derfor i enzymatisk aktivitet, så organoid fordøyelsen må overvåkes nøye for å unngå over-fordøyelsen. Det er også viktig å fordøye organoids i et 50 mL rør, da dette gir et jevnt overflate område for fordøyelsen. Andre studier har brukt filtrering for rensing organoids19,23; Vi fikk imidlertid en mye høyere kapasitets rensing med sentrifugal differensiering (fig. 2h). Pipetter med forhånds belegg, pipette-spisser og sentrifugerør med BSA-løsningen er avgjørende for å maksimere utbyttet. Organoids merkbart holder seg til blanke plast når løsningen programmet er neglisjert.
Det må utvises stor forsiktighet for å unngå aspirating organoids. Dette er en risiko som oppstår når rensing, skiftende medier, og farging for fluorescerende markører. Ved hjelp av lav vedheft plater for vekst gjør det mulig for enkel overføring av organoids og fjerner behovet for organoids å bli delt i OCT for videre farging, en prosedyre som kreves for kjeller membran embedded organoids11. I tillegg til ytelser fra overlegen vekst, seeding bestrålt organoids i lav vedheft plater kreves færre trinn og var mindre teknisk utfordrende enn dyrking organoids i kjelleren membran eller kollagen. Men når flekker for markører, kan det være nyttig å vise organoids under et mikroskop for å sikre at utilsiktet aspirasjon ikke oppstår.
Videre er det mange hensyn som må regnskapsføres når Imaging organoids. Innenfor kjeller membran innebygd organoids, sporadisk Fibroblast vekst kan observeres (figur 2C, D). Fibroblast utvekst i 3D kultivert organoids kan være forårsaket av organoids å ta kontakt med vevet kultur behandlet overflaten som vedheft fører til upregulated Fibroblast vekstfaktor produksjon i tilhenger celler27. Interessant, er morfologi av disse fibroblaster påfallende lik pre-adipocytter som begge celletyper utstillingen spindly, langstrakte former28. I videre etterforskning, eksponering for insulin, deksametason, og 3-isobutyl-1-metylxanthin (IBMX) kan gi celler med en adipogenic avstamning, spurring en dreining mot en mer sfærisk cellulær form forbundet med adipocytter28, 29. vi fikk klare bilder ved hjelp av fase kontrast mikroskopi av fri-voksende lav vedheft (figur 3a-C) og kjeller membran embedded (figur 3D-G) organoids. Sporing individuell organoid vekst i lav vedheft plater, men var vanskelig på grunn av minimal fokal adhesjon mellom cellene og godt underlag, noe som resulterer i organoid bevegelse og sporadisk aspirasjon.
Når farget for overflate markører, konfokalmikroskopi mikroskopi gjengis klarere markør lokalisering (figur 5e, F) enn Widefield mikroskopi (figur 5a-D). Fra fluorescens kvantifisering tyder trendene i phalloidin uttrykk på at bestrålt organoids uttrykte økte F-utgangen i forhold til kontrollen (figur 5G). Utgangen cytoskeleton omorganisering er observert i dermal mikrovaskulær endothelial celler bestrålt på lignende doser30.
For utvidet bildebehandling sekvenser, som tidsforløp co-kultur med immunceller (figur 6), en levende celle Imaging kammer med fuktighet og co2 kontroll er nødvendig31. Live celle bilder tatt hvert 30 minutter avslørte at makrofager co-lokaliserte med organoids etter 24 timer (figur 6a, B), fortrinnsvis migrerer mot bestrålt organoids (figur 6C). Macrophage infiltrasjon i bestrålt normalt vev har blitt observert i Vivo, tilskrives chemokine og cytokin graderinger, og vanligvis forut for CTC rekruttering5. Fremtidige studier vil evaluere klassisk og alternativt aktivert macrophage interaksjoner med organoids som polarisert macrophage dynamikk kan spille en viktig rolle i å bestemme respons på stråling32,33. Ytterligere analyser vil evaluere konsekvensen av serum sult og vekst virkningene av dyrking organoids i komplette medier, siden disse variablene kan ha betydelige virkninger på organoid-immune celle interaksjoner. Dette systemet kan videre tilpasses for co-kultur med andre celletyper, inkludert CD8 + T-celler, stromal celler, adipocytter, og brystkreftceller. Sanntids observasjon med teknikker som live celle Imaging vil lette elucidation av potensielle mekanismer som bidrar til CTC rekruttering til bestrålt normalt vev, som kan ha betydelige implikasjoner for pasienter som lider av tilbakevendende TNBC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Laura L. Bronsart for å gi GFP og dTomato-merket RAW 264,7 makrofager. Denne forskningen ble økonomisk støttet av NIH stipend #R00CA201304.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| Anti-cytokeratin 14 | abcam | ab181595 | Lot: GR3200524-3 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1933-25G | |
| Collagen Type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII | Sigma | C2139 | |
| Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 11320-033 | |
| DNAse | Roche | 10104159001 | |
| DPBS | Fisher | 14190250 | |
| E-Cadherin | Cell Signaling | 24E10 | Lot: 13 |
| FBS | Sigma | F0926 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750 | |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150077 | green Lot: GR3203000-1 |
| Goat anti-rabbit secondary | abcam | ab150080 | red Lot: GR3192711-1 |
| Hoechst 33342 | Fisher | 62249 | Lot: TG2611041 |
| Insulin (10 mg/mL) | Sigma | I9278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium, 100x | Gibco | 51500-056 | |
| Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma) | Corning | 356237 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Nuclon Sphera 96 well plates | Thermo | 174927 | |
| PBS | VWR | 10128-856 | |
| Pen/strep | Fisher | 15140122 | |
| Phalloidin | abcam | ab176757 | Lot: GR3214582-16 |
| Tight Junction Protein 1 | Novus | NBP1-85047 | Lot: C115428 |
| Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol) | Sigma | X100-100ML | |
| Trypsin | Gibco | 27250-018 | |
| Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate) | Sigma | P1379-100ML |
References
- Lautner, M., et al. Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer. Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).
- Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).
- Kim, M. Y., et al. Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
- Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
- Rafat, M., et al. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients. Cancer Research. 78 (15), 4241-4252 (2018).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells. Development. 128, Cambridge, England. 3117-3131 (2001).
- Shamir, E. R., et al. Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin. Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).
- Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis. Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).
- Nguyen-Ngoc, K. -V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).
- Nguyen-Ngoc, K. -V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. 3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion. Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).
- Ewald, A. J. Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).
- Drost, J., Clevers, H.
- DeNardo, D. G., et al. CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages. Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).
- Plaks, V., et al. Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis. Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).
- Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum. The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).
- Mandl, I., Zaffuto, S. F. Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase. The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Zhang, L., et al. Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells. Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).
- Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).
- Richert, M. M., et al. An atlas of mouse mammary gland development. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).
- Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
- LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
- Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution. Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).
- Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).
- Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium. Development. 137, Cambridge, England. 4229-4238 (2010).
- Ingber, D., Folkman, J. Mechanochemical switching between growth and differentiation during fibroblast growth factor-stimulated angiogenesis in vitro: role of extracellular matrix. The Journal of Cell Biology. 109 (July), Available from: http://jcb.rupress.org/content/109/1/317.abstract (1989).
- Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S.
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Gabryś, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).
- Ewald, A. J. Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).
- Zhang, M., et al. A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients. Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).
- Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time. BioMed Central Cancer. 10, 112 (2010).
