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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Wachstum und Charakterisierung der bestrahlten Organoide aus den Brustdrüsen

Published: May 3, 2019 doi: 10.3791/59293
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Vanderbilt University, 2Department of Biomedical Engineering, Vanderbilt University, 3Department of Radiation Oncology, Vanderbilt University Medical Center

Summary

Organoide, die sich aus den Meeressammrissen entwickelten, wurden bestrahlt und charakterisiert, um epitheliale Merkmale und Wechselwirkungen mit Immunzellen zu beurteilen. Bestrahlte Organoide können verwendet werden, um Wechselwirkungen mit Zellen besser zu bewerten, die zu der Rekrutierung von Tumorzellen in bestrahltem normalem Gewebe führen können.

Abstract

Organoide, die aus dem verdauten Gewebe gewonnen werden, sind mehrstufige dreidimensionale (3D) Konstrukte, die in vivo-Bedingungen besser rekapitulieren als Zellmonolayers. Obwohl sie nicht vollständig in vivo-Komplexität modellieren können, behalten sie eine gewisse Funktionalität der ursprünglichen Orgel. Bei Krebsmodellen werden Organoide häufig verwendet, um Tumorzelleinfälle zu untersuchen. Dieses Protokoll zielt darauf ab, Organoide aus dem normalen und bestrahlten Maus-Mammargewebe zu entwickeln und zu charakterisieren, um die Strahlenreaktion in normalen Geweben zu bewerten. Diese Organoide können in zukünftigen In-vitro-Krebs-Studien eingesetzt werden, um Tumorzellinteraktionen mit bestrahlten Organoiden zu bewerten. Die Brustdrüsen wurden resutiert, auf 20 Gy bestrahlt und in einer Kollagenase VIII Lösung verdaut. Epitheliale Organoide wurden durch Zentrifugaldifferenzierung getrennt, und 3D-Organoide wurden in 96-gut niedrig haftenden Mikroplatten entwickelt. Organoide drückten das charakteristische epitheliale Marker Cytokeratin 14 aus. Die Makrophage-Interaktion mit den Organoiden wurde in Ko-Kultur-Experimenten beobachtet. Dieses Modell kann nützlich sein, um Tumorstrominteraktionen, Infiltration von Immunzellen und Makrophage-Polarisation in einer bestrahlten Mikroumgebung zu untersuchen.

Introduction

Etwa 60% der dreifachen negativen Brustkrebspatientinnen (TNBC) wählendieBrustkonservierungstherapie (BCT) als Behandlungsform 1. Bei dieser Behandlungsmodalität wird der Tumor, der einen Teil des Brustgewebes enthält, entfernt, und das umgebende normale Gewebe ist ionisierender Strahlung ausgesetzt, um alle verbleibenden Tumorzellen abzutöten. Die Behandlung reduziert die Wiederholung in weiten Teilen der Brustkrebspopulation; Allerdings sind etwa 13,5% der behandelten Patienten mit TNBCErfahrunglocoregional Wiederholungen 2. Daher wird die Untersuchung, wie Strahlung zirkulierende Tumorzellen rekrutieren kann (CTCs), zu wichtigen Einsichten in die lokale Wiederholung 3,4führen.

Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die Strahlung des normalen Gewebes die Rekrutierung verschiedenerZelltypen 5 erhöht. In präklinischen Modellen von TNBC erhöhte die Bestrahlung des normalen Gewebes die Makrophage und in der Folge dieRekrutierung von Tumorzellen auf das normale Gewebe 5. Der Immunstatus beeinflusste die Rekrutierung von Tumorzellen an bestrahlten Standorten, wobei die Tumorzellwanderung bei immunkompromitierten Probanden beobachtet wurde. Die Rekapitulation dieser Wechselwirkungen mit Organoiden aus Brustdrüsen wird die Beobachtung von Zellmigration und zellstromalen Wechselwirkungen in Echtzeit mit Mikroskopie und Live-Zell-Bildgebung ermöglichen, um die Rolle der Strahlenschäden bei der Veränderung zu bestimmen. Tumorzellverhalten.

Maus-Mammarorganoide haben dabei geholfen, wichtige Schritte in der Entwicklung der Brustdrüse aufzuklären. Ein Säugetierorganoid ist ein mehrstufiges, dreidimensionales Konstrukt des isolierten Säugetierepithels, das größer als50 μm6,7,8,9,10ist. Mit Hilfe von primären epithelialen Organoiden bewertete Simian et al.die notwendigen Faktoren für die Verzweigung in der Brustdrüse 7. Shamir et al. entdeckte, dass die Verbreitung ohne einen epithelialen zu mesenchymalen Übergang erfolgen kann, was Einblick in die metastasierende Kaskade8gewährt. Die Methoden zur Erzeugung und Charakterisierung von Organoiden aus Brustdrüsengewebe sind6,11,12, 13gutetabliert. Unseres Wissens wurden jedoch keine Methoden für den Anbau von bestrahlten Organoiden aus Brustdrüsen gemeldet. Ein Protokoll zum Anbauen und Charakterisieren von bestrahlten Organoiden wäre ein entscheidender Schritt bei der Rekapitulation von strahleninduzierten Immun-und Tumorzellrekrutierungen.

In diesem Papier berichten wir über eine Methode zum Anbauen und Charakterisieren von bestrahlten Säugetierarchivorganoiden in Mikroplatten mit niedrigem Klebstoff-Polymer, das die Bildung von Spheroiden unterstützt. Diese Organoide wurden mit Makrophagen kokultiviert, um die Infiltrationskinetik der Immunzellen zu untersuchen. Diese Arbeit kann erweitert werden, um die Ko-Kulturierung von Organoiden mit Fettzellen zu umfassen, um Säugetiereigenschaften zu rekapitulieren, Brustkrebszellen zur Visualisierung von Tumorzellrekrutierungen und CD8+ T-Zellen, um Wechselwirkungen zwischen Tumorimmel zu untersuchen. Bereits etablierte Protokolle können zur Auswertung von bestrahlten Organoiden verwendet werden. Frühere Modelle, die Säugetierorganoide und Immunzellen mitkultivieren, haben Licht auf Mechanismen der Metastasen und der Verbreitung geworfen. DeNardo et al. fand heraus, dass die CD4+ T-Zellregulierung von tumorassoziierten Makrophagen einen metastasierenden PhenotypvonSäugetieren von Adenokarzinomen 14 verstärkte. Die Modelle der Ko-Kultur-Kultur wurden auch verwendet, um Mechanismen der biologischen Entwicklung zu erklären. Plaks et al. klärte die Rolle der CD4+ T-Zellen als Down-Regulatoren der Säugetierorganogenese15auf. Unsere Gruppe ist jedoch die erste, die ein Verfahren etabliert hat, um zu visualisieren, wie normale Gewebebestrahlung das Immunzellverhalten beeinflusst. Da sich gezeigt hat, dass normale Gewebebestrahlung dieRekrutierung von Tumorzellen verbessert hat. [5] Dieses Protokoll kann weiterentwickelt werden, um zu analysieren, wie das Verhalten der Tumorzellen durch die Bestrahlung von normalem Gewebe und Zellen verändert wird, was zu einem besseren Verständnis von Krebserkrankung wiederholt.

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Protocol

Tierstudien wurden in Übereinstimmung mit den vom Vanderbilt der Institutional Animal Care and Use Committee der Vanderbilt Universität genehmigten Tierstudien durchgeführt.

1. Vorbereitung von Mäusen und Zellaufnahme (angepasst von Nguyen-Ngoc et al.11)

  1. Opfere athymische Nu/Nu-Mäuse (8-10 Wochen alt) mit CO2 Erstickung, gefolgt von Gebärmutterhalskrebs. Reinigen Sie die Haut mit 70% Ethanol.
  2. Mit vorsterilisierter Schere und Zangen werden Bauch-und Leistenmischdrüsen von Mäusen entfernt. Lymphknoten vor dem Resektion entfernen. Spülen Sie in sterilen 1x Phosphat-gepufferten Salinen (PBS) (Abbildung 1A).
  3. Platzieren Sie es in 15 ML-Rohren mit 10 ml von Dulbecco es Modified Eagle Media/Nutrient Mixtur F12 (DMEM/F12) für den Transport. Proben können über Nacht bei 4 ° C aufbewahrt oder sofort verarbeitet werden. Auf Eis halten.
  4. Bestrahlung von Proben bei 20 Gy mit einer Cäsiumquelle (Abbildung 1B).
  5. 45 Minuten nach der Bestrahlung die Brustdrüsen in eine 35 mm sterile Zellplatte legen und mit Skalpellen absetzen (Abbildung 1c,D). Mit etwa 40 Schlägen abnehmen, bis sich das Gewebe entspannt und Stücke gewonnen werden, die nicht größer als ca. 1 mm 2 im Bereich sind.
  6. Überführung auf die Kollagenase-Lösung in einem 50 mL Zentrifugenrohr. Collagenase-Lösung besteht aus 2 mg/mL Collagenase (siehe Materialtabelle), 2 mg/mL Trypsin, 5% v/v/fetales Rinderserum (FBS), 5 μg/mL Insulin und 50 μg/mL gentamicin in DMEM/F12-Medien. Verwenden Sie 10 mL Collagenase-Lösung pro Maus.
  7. Legen Sie in ein Wasserbad bei 37 ° C und verhalen Sie alle 10 Minuten für 30-60 min. Verdauung ist abgeschlossen, wenn die Kollagenase-Lösung bewölkt ist (Abbildung 1E,F).
  8. Die verdaute Lösung bei 450 x g für 10 min bei Raumtemperatur (RT) untergeben. Drei Schichten werden beobachtet. Das Supernatant besteht aus Fett, die mittlere Schicht ist eine wässrige Lösung, und der Boden ist ein Pellet. Das Pellet erscheint rot, da es sich um eine Mischung aus Epithelzellen, einzelnen Stromalzellen und roten Blutkörperchen handelt (Abbildung 1G).
  9. Vor dem Kontakt werden alle Pipetten, Pipette-Spitzen und Zentrifugenröhren mit Rinder-Serum Albumin (BSA) gelöst. Die BSA-Lösung besteht aus 2,5 w/v% BSA in Dulbecco es Phosphate Buffered Saline (DPBS). Für die Vorbeschichtung einfach die BSA-Lösung in die Innenseite der Pipette-Spitze und der Rohre entfernen. Die BSA-Lösung kann wiederverwendet werden, obwohl sie vor jedem Experiment steril gefiltert werden sollte.
  10. Für die zusätzliche Erholung, übertragen Sie das Supernatant auf ein frisches BSA-beschichtetes 15-ML-Rohr. Pipette auf und ab kräftig auf-und ablegen, um Fettschicht zu zerstreuen. Zentrifuge bei 450 x g für 10 min bei RT. Aspirieren Sie den Supernatant, so dass eine kleine Menge von Medien in der Röhre, um zu vermeiden, das Zellpellet zu saugen.
  11. Die wässrige Schicht aus dem Rohr mit dem originalen Pellet aufsaugen.
  12. Mit dem Original-Pellet 10 mL DMEM/F12 in die Röhre geben und auf das zweite Rohr übertragen. Pipette kräftig kombinieren und die beiden Pellets wieder aufspielen.
  13. Zentrifuge bei 450 x g für 10 min bei RT. Aspirieren Sie den Supernatant und fügen Sie 4 ml DMEM/F12 in die Röhre.
  14. Fügen Sie 40 μL Deoxyribonuclease (DNase) in die Aufhängung ein und schütteln Sie bei RT ca. 5 Minuten von Hand. DNase-Lösung besteht aus 4 U/mL DNase in DMEM/F12.
  15. 6 mL DMEM/F12 und Pipette gründlich hinzufügen. Zentrifuge das Rohr bei 450 x g für 10 min bei RT.
  16. Aspirate supernatant auf die 0,5-ML-Marke. Resuspend in 10 mL von DMEM/F12 und Pipette gründlich.
  17. Pulsieren Sie auf 450 x g und stoppen Sie 4 s, nachdem Sie diese Geschwindigkeit erreicht haben.
  18. Wiederholen Sie die Schritte 1,16-1,17 dreimal mehr, um die Organoide durch die Zentrifugaldifferenzierung zu reinigen. Das Pellet sollte nun eine Off-White-Farbe sein, die nur aus epithelialen Organoiden besteht (Abbildung 1H).
    Achtung: Organoide können auch mit sterilen Netz-40 μm-Filtern gefiltert werden. Nach Schritt 1.16 werden Pipette-Medien mit Organoiden durch einen Filter in ein Zentrifugenrohr gespült und dann mit 5 bis 10 ml DMEM/F12-Medien abgespült. Drehen Sie den Filter über ein neues 50 mL-Zentrifugenrohr. Pass 10 mL von DMEM/F12 Medien durch, den umgekehrten Weg, um jede Retentate abzuspülen. Das Retentat sollte aus Organoiden bestehen, und das Filtrat sollte hauptsächlich aus strotzenden Zellen bestehen, die auf Wunsch weggeworfen oder aufbewahrt werden können.

2. Bestimmung der Dichte und Beschichtung von Organoiden

  1. Wiederbelebungs-Pellets in 10 mL von DMEM/F12. Pipette gründlich, um eine homogene Lösung zu schaffen.
  2. 50 μL auf eine 30 mm Petrischale übertragen und unter einem Phasenkontrastmikroskop bei 20x anzeigen. Zählen Sie die Anzahl der Organoide mit einem Zählmesser.
    Hinweis: Hier wurden Pipette-Spitzen mit einem minimalen Durchmesser von 457 μm konsequent verwendet, was 5-10 mal so viel wie der Durchmesser der gesäten Organoide ist. Für die Übertragung von Volumina von 2 mL oder größer (z.B. Schritte 1.16 und 2,1) verwenden Sie serologische Pipetten mit einem Spitzendurchmesser von über 1.500 μm.
  3. Berechnen Sie die Organoiddichte mit folgender Gleichung:
    Equation
    Die gewünschte Dichte beträgt 1.000 organoids/mL, um die weitere Verdünnung zu vereinfachen. Ist die Dichte zu niedrig, ist die Zentrifuge bei 450 x g für 5 min und Aspirat Medien. Fügen Sie Medien, die notwendig sind, um 1.000 organoids/mL zu erreichen, und Pipette gründlich, um eine homogene Mischung zu schaffen.
    1. Um Organoide in einer Proteinmatrix anzubauen, werden Organoide in einer Konzentration von 1 Organoid/L in Kollagen Typ 1 verdünnt auf 87% oder in Kellermembran aus Engelbreth-Holm-Swarm Maus-Sarkom gewonnen. Während der Arbeit mit Proben, halten Sie auf Eis.
    2. Um Organoide einzufrieren, übertragen Sie das gewünschte Volumen auf ein separates Zentrifugenrohr. Drehen Sie sich auf 450 x g für 5 min. Aspirate media, und dann fügen Sie das gleiche Volumen von 90% FBS/10% DMSO. Die Organoide wiederbeleben und dann in die Kryotubes. Innerhalb einer Woche auf-80 ° C und dann auf flüssigen Stickstoff.
    3. Zum Tauen in einem 37 ° C-Wasserbad für eine Minute warm. Zentrifuge bei 450 x g für 5 min, und dann Aspirat Gefriermittel. Mit sterilen DPBS abspülen und dann wieder Zentrifuge. Aspirate DPBS und fügen Sie organoide Medien.
  4. Pipette 50 μL (50 Organoide) in jeden Brunnen der niedrigen Haftplatte (Abbildung 1I).
  5. Fügen Sie 150 μL an Organoidmedien hinzu, um das gesamte Arbeitsvolumen auf 200 μL zu bringen. Organoid-Medien bestehen aus 1% Penicillin-Streptomycin und 1% Insulin-Transferrin-Selen (ITS) in DMEM/F12-Medien.
  6. Alle 2 Tage ersetzen Medien vorsichtig.
    NOTE: Niedrige Klebeplatten werden nicht Gewebekultur behandelt; So lassen sich die Zellen leicht lösen. Aspirieren Sie die Medien langsam, indem Sie die Platte kippen und die Pipette-Spitze am Rand jedes Brunnens einfügen. Lassen Sie eine kleine Menge Medien in den Boden des Brunnens. Fügen Sie langsam neue Medien hinzu, um unnötige Scherkräfte auf Organoide auftragen zu können.

3. Ko-Kultivierung mit Makrophagen

  1. Pflegen GFP oder dTomato-beschriftete RAW 264.7 Makrophagen in DMEM-Medien mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin ergänzt. Samen 1 x 10 4,5 x 104, oder1 x 105 cells/ml in Organoid Medien.
  2. Verwenden Sie Live-Zellphasenkontraste und fluoreszierende Bildgebung, um die Verunrohrompelinfiltration im Laufe der Zeit zu überwachen.

4. Immunfluoreszenzfärbung von Organoiden

NOTE: Organoide können in niedrigen Klebstoffen gebeizt oder auf Kammerrutschen übertragen werden. Zum Übertragen, sanft nach oben und unten piptieren, bis sich die Organoide von den Platten gelöst haben. Übertragen Sie Kammerrutschen und Inkubat für 4-8 h, damit Organoide an der Plattenoberfläche haften können.

  1. Entfernen Sie das organoide Medium aus den Brunnen, indem Sie vorsichtig saugen. Fixproben mit 10% neutralem Puff-Formalin für 15 Minuten bei RT.
  2. 3x 5 min in 1x PBS waschen. Auf Wunsch können feste Proben bei 4 ° C für eine Woche zur weiteren Färbung gelagert werden.
  3. Durchlässigkeit mit 0,1% 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl) Phenyl-Polyethylen-Glykol für 5 min.
    NOTE: Um für F-actin zu flecken, Inkubatproben mit Phalloidin verdünnt 1:1000 und 1,67 nM bisbenzimid nuklearen Farbstoff in 1% PBS/BSA für 1 h bei RT. Dann gehen Sie zu Schritt 4.8.
  4. Bermeabilize mit 0,5PBS. Proben können mit 4opy-Bildern und Immunfluoreszenzbildern gespeichert werden. Mechanismen, die zu CTC Rlock mit 5% normalen Ziegenserum in 0,1% PBS/Polyethylen-Glykol-Sorbitan Monolaurat (PBST) für 1 h bei RT beitragen.
  5. Inkubation mit Anti-Cytokeratin 14 verdünnt 1:1000, E-Cadherin verdünnt 1:200, oder Tight Junction Protein One verdünnt 1:100 in 1% NGS in PBST für 1 h bei RT. Wash 3x 5 min in PBST.
  6. Inkubieren Sie mit Ziege Anti-Rabbit sekundär verdünnt 1:200 mit 1% NGS/PBST für 1 h bei RT. Deckel mit Folie, um Lichteinwirkung zu vermeiden.
  7. 3x 5 min in PBS waschen. Verwenden Sie den Kernfarbstoff (siehe Materialtabelle), um die Kerne zu verfärben.
  8. 3x 5 min in PBS waschen. Bei Verwendung von Kammerrutsche mit einem Kofenlip aufhängen. In Folie bei 4 ° C bis zu 2 Wochen aufbewahren.

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Representative Results

Bestrahlte epitheliale Säugetierorganoide wurden erfolgreich aus mausischen Brustdrüsen gewonnen, verarbeitet und auf Low-adhesion-Platten kultiviert (Abbildung1). Die Organoid-Ausbeute wurde durch Aussaat in verschiedenen Wachstumsumgebungen getestet (Abbildung 2A-G). Die Nähzellen direkt auf der Gewebekultur behandelten 10 cm Zellplatten führten zu einem Überwuwachs an Fibroblastzellen. Fibroblasten wurden in Phasenkontrastmikroskopie in oder in der Nähe der gleichen Fokusebene wie Organoide identifiziert, und sie wuchsen innerhalb weniger Tage schnell aus geplatzten Organoiden heraus. Ein Auswuchs von Fibroblasten war auch zu beobachten, als Organoide in Kellermembranen und Kollagenproteinmatrizen gesät wurden (Abbildung 2E,F).

Bei der Optimierung des bestrahlten Organoidwachstums wurden verschiedene Bedingungen getestet (Abbildung 2H). Als Enzym in der organoiden Verdauungsstufe 12,16, 17 wurden die Kollagenase-Typen I und VIII aus Clostridium histolyticumverwendet. Die Organoiderträge waren nach der Verdauung mit Kollagenase VIII deutlich höher. Dies kann auf die Reinigungsverfahren zurückzuführen sein, die bei der Herstellung des Enzyms eingesetzt werden: Kollagenase Typ I wird teilweise gereinigt und kann unnötige Schäden an Membranproteinen und Rezeptoren verursachen, was zu einer schlechten Organoidbildung, Zelllyse oder Überverdauung führt 16 , 17 , 18. Es wurden keine signifikanten Ausbetragsunterschiede zwischen bestrahlten und kontrollierbaren Organoiden festgestellt.

Bestrahlte Organoide konnten in niedrigen Haftplatten (Abbildung 3A-C) oder in der Kellermembran (Abbildung 3D-G) kultiviert werden, das schnellste Wachstum trat jedoch bei niedrigen Haftplatten auf (Abbildung 3H). Organoide rekapitulierten die Eigenschaften der Brustdrüse. Weiße Pfeilspitzen zeigen Morphologisch ähnliche Konstrukte wie Kanäle und Lappen19,20, 21 (Abbildung 3C), die für die Produktion und den Transport von Milch in der Brustdrüse 21 entscheidend sind. Um diese Beobachtung zu bestätigen, ist jedoch eine weitere Charakterisierung erforderlich. Wachstumstrends deuteten darauf hin, dass nicht bestrahlte Organoide schneller wuchsen als bestrahlte Organoide (Abbildung 3H), was höchstwahrscheinlich auf die Verhaftung von Zellwachstum zurückzuführen ist, die sich aus Mechanismen der DNA-Schadensreparatur ergibt; Allerdings war der Trend statistisch nicht signifikant 22. Es wurde ein gelegentliches Klumpen von organoiden mit geringer Haftung beobachtet, und Organoide konnten bis zu zwei Wochen vor der Trennung kultiviert werden.

Organoide drückten epitheliale Eigenschaften aus, die durch die Immunfluoreszenzfärbung von Cytokeratin 14 (K14), E-Cadherin (E-cad) und Tight Junction Protein 1 (ZO-1)23,24,25 ausgewertet wurden ( Abbildung 4). Strahlenstrahlte Organoide drückten Epithelmarker aus. K14, ein Marker von Myoepithel23, wurde auf der Oberfläche der bestrahlten Organoide stark ausgedrückt (Abbildung 4A). Zusätzlich wurden E-Cad und ZO-1 in zellulären Knotenpunkten von Organoiden ausgedrückt (Abbildung 4B, C). Diese Proteine sind für die richtige Zellhaftung24 unerlässlich. Nach der Bestrahlung behielt die Organoide ihre epithelialen Eigenschaften.

Die fluoreszierende Färbung von Organoiden konnte in niedrigen Haftplatten mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie(Abbildung 5A-D) visualisiert werden; Die deutlichste Visualisierung erfolgte jedoch über die konfokale Mikroskopie(Abbildung 5E-F). Die vollständige Fluoreszenzintensität wurde berechnet, indem der Hintergrund abgezogen und durch Organoidbereich normalisiertwurde(Abbildung 5G). Der Anbau von Organoiden in den 96 gut niedrigen Klebeplatten vereinfachte auch die Co-Kultur-Experimente. Wenn man sie in den in der Brustdrüse typischen Konzentrationen setzt, haben Makrophagen mit der Kontrolle und den bestrahlten Organoiden kolokalisiert (Abbildung6) 24,26.

Figure 1
Bild 1. Methodenablauf. (A) Mammutdrüsen wurden von Mäusen zurückgesetzt. Die Bauch-und Leistendrüsen wurden verwendet. (B) Mammutdrüsen wurden in 50 mL-Zentrifugenrohren bestrahlt, die DMEM/F12-Medien enthielten. C) Mammutdrüsen wurden auf sterile Sechs-well-Platten übertragen und mit chirurgischen Skalpellen geschnitten, bis sie gehackt wurden (D). (E) Mammudrüsen wurden in 50 mL-Zentrifugenröhren mit 5 ml sterilen DMEM/F12-Medien pro Drüse übertragen und in einer Kollagenase VIII Lösung (F) verdaut. (G) Nachdem die Zentrifugaldifferenzierung auf ein 15 mL-Rohr übertragen wurde, wurde die Zentrifugaldifferenzierung eingesetzt, um Stromalzellen, einzelne Zellen und rote Blutkörperchen zu entfernen, die in einem roten Pellet (weißer Pfeilkopf) beobachtet wurden, bis nur weiße epitheliale Organoide gewonnen wurden (H ). (I) 50 Organoide wurden in 200 μL Medien in 96-gut niedrigen Haftplatten beschichtet und mit Phasenkontrastmikroskopie mit 50 μm abgebildet.

Figure 2
Bild 2. Organoid Plating in 3D Protein Matrices und auf Tissue Culture Treatated Plastic. Organoide, die in Kollagen (A) und Kellermembran (B) gesät wurden, wurden nach 84 Stunden Wachstum abgebildet. Das Auswuchs von Fibroblasten trat in Matrix-Plüten auf (C, D). 192 Stunden nach der Aussaat wurden Phasenkontrastbilder von Organoiden, die durch Filtration sortiert wurden, aufgenommen. Es wurden keine großen Unterschiede zwischen dem Filtrat (E) und dem Retentat (F) festgestellt, wobei beide zu einem zusammenfließenden Fibroblast-Wachstum führten. Zellen in E und F wurden auf Gewebekultur behandelten Kunststoff gesät. Nach dem Trypsinisieren für 5 min bei RT wurden Fibroblasten über Aspiration entfernt; Die verbliebenen Epithelzellen bildeten jedoch statt dreidimensionaler Organoide (G) eine Monolayerkultur. (H) Verschiedene Kollagenasentypen (I (CI) und VIII (CVIII)) und Zellverarbeitungsmethoden (Filtration und Zentrifugaldifferenzierung (Cent Diff)) wurden getestet, und Organoidausbeute pro Brustdrüse wurde getestet. Quantifiziert (n = 2 Drüsen für CI, Filter; 2 Drüsen für CVIII, Filter; 4 Drüsen für CI, Cent Diff, und 12 Drüsen für CVIII, Cent Diff). Die statistische Bedeutung wurde mit Hilfe eines zweigetasten, ungepaarten t-Tests, * * * p<0.0001 ermittelt. Fehlerbalken stellen Standardfehler dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figure 3
Bild 3. Vertreter Organoid Wachstum. Phasenkontrastbilder des bestrahlten Organoidwachstums in niedrigen Haftplattenerhielten 20 (A), 44 (B) und 106 (C) Stunden nach der Aussaat. Weiße Pfeilspitzen zeigen Strukturen, die eine ähnliche Morphologie wie Leitungen und Lappen haben. Phasenkontrastbilder des bestrahlten Organoidwachstums in der Kellermembran erhielten 42 (D), 66 (E), 60 (F) und 114 (G) Stunden nach der Aussaat. Die Maßangel stellen 50 μm dar . H. Flächenmessungen wurden unter unterschiedlichen Wachstumsbedingungen durchgeführt: Organoide, die sofort nach der Verdauung und Sortierung (bestrahlt (●), Kontrolle (▪)) und Organoide in der Kellermembran (bestrahlt,-, Kontrolle(")) (n= 3) gesät wurden. Drüsen jeweils). Die Flächenberechnungen wurden mit Hilfe der ImageJ-Software erstellt. Fehlerbalken stellen Standardfehler dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figure 4
Bild 4. Epithelial Marker Expression auf bestrahlten Organoiden. Cytokeratin 14 (K14, grün), ein Marker für die Basalschicht von Plattenepithelie und nicht-Plattenepithelie, wurde auf bestrahlten Organoiden (A) ausgedrückt. E-cadherin (E-Cad), ein für die Haftung essentielles Protein, wurde innerhalb der Knotenpunkte zwischen Zellen in bestrahlten Organoiden (B) ausgedrückt. Das straffe Knotenprotein 1 (ZO-1) wurde auch innerhalb von Zellknotenpunkten von bestrahlten Organoiden (C) ausgedrückt. Die Bilder wurden in Kammerdias über die konfokale Mikroskopie gewonnen. Zur Visualisierung von Kernen (blau) wurde ein Nukleinsäurefleck verwendet. Alle Organoide wurden nach einer Woche Wachstum fixiert und abgebildet. Die Skalierbalken sind 50 μm.

Figure 5
Bild 5. F-actin Ausdruck in Organoiden. F-actin (rot), ein Mikrofilament in Epithelzellen, wurde mit geringerer Intensität in nicht bestrahlten Organoiden (A, C, E)als in bestrahlten (B, D, F)Organoiden ausgedrückt. Zur Visualisierung von Kernen (blau) wurde ein Nukleinsäurefleck verwendet. Die Bilder wurden auf niedrigen Haft-96-Brunnenplatten (A, B) und 16-Brunn-Kammer-Dias (C, D) aufgenommen. Auch Bilder wurden mit konfokaler Mikroskopie (E, F) aufgenommen. Alle Organoide wurden nach einer Woche Wachstum fixiert und abgebildet. Die Skalierstangen sind 50 μm. G . Phalloidin Fluoreszenzdaten aus niedrigen Klebeplattenbildern wurden in ImageJ (n = 3 Drüsen) quantifiziert. Fehlerbalken weisen auf Standardfehler hin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figure 6
Bild 6. Bewertung von Zellzellinteraktionen durch makrophage-organoide Ko-Kultur. Makrophagen (rot) infiltrierte Steuerung (A) und bestrahlte (B) Organoide. Die Maßstangen sind 50 μm. Der durchschnittliche prozentuale Bereich der Makrophagen im Bildfeld (C) wurde bei 24 Stunden Co-Kultur zur Kontrolle (gelb) und bestrahlten (orangefarbenen) Organoide (n=3 Drüsen für jede Probe) gemeldet. Die Makrophagen wurden in Konzentrationen von 10.000 Cells/mL, 50.000 cells/mL und 100.000 cells/mL gesät, und ihre Infiltration wurde alle 30 Minuten über die Live-Zellfluoreszenz-Bildgebung erfasst. Alle Experimente der Ko-Kultur begannen 7 Tage nach der ersten Organoidsaat. Die statistische Bedeutung wurde mit Hilfe eines zweistufigen, ungepaarten t-Tests, * p<0.05, * * * p<0.0001 ermittelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

In diesem Protokoll haben wir eine Methode für reproduzierbares Wachstum und Charakterisierung von bestrahlten Säugetierorganoiden entwickelt (Abbildung1). Eine Bestrahlungsdosis von 20 Gy wurde auf Spiegel früherer in vivo-Modellen der Tumorzellrekrutierung5angewendet. Die Bestrahlung der Brustdrüsen ex vivo vor der Organoidbildung ermöglichte die Isolierung von Strahlenschädefeffekten ohne eine entsprechende Infiltration von Immunzellen. Die Entwicklung eines in vitro bestrahlten Normalgewebsmodells ermöglicht die Echtzeitbetrachtung von zellulären Interaktionen, die zur strahleninduzierten TCC-Rekrutierung11,12beitragen können.

Die eng nachfolgenden Schritte 1.5-1,18 waren entscheidend für die Maximierung der Organoidausbeute. Wir haben der Verdauungslösung aufgetaute Aliquots konzentrierter Kollagenase hinzugefügt. Aufgrund der sehr viskosen Art der konzentrierten Kollagenase Aliquot, kann es einige Schwankungen in der Menge und damit in der enzymatischen Aktivität, so dass organoide Verdauung muss genau überwacht werden, um Überverdauung zu vermeiden. Es ist auch wichtig, Organoide in einem 50 mL-Rohr zu verdauen, da dies eine gleichmäßige Oberfläche für die Verdauung ermöglicht. Andere Studien haben die Filtration zur Reinigung der Organoide 19,23verwendet; Wir haben jedoch eine deutlich höhere Ertragsreinigung mit Zentrifugaldifferenzierung erreicht (Abbildung 2H). Für die maximale Ausbeute ist das Vorbeschichtungspipetten, Pipette-Spitzen und Zentrifugenrohre mit der BSA-Lösung unerlässlich. Organoide haften spürbar an ungestrichenem Kunststoff, wenn Lösungsanwendungen vernachlässigt werden.

Es muss sehr darauf geachtet werden, dass die Organoide nicht absaugen. Dies ist ein Risiko, das bei der Reinigung, dem Medienwechsel und der Färbung von Leuchtstoffmarkern auftritt. Der Einsatz von niedrigen Klebeplatten für das Wachstum ermöglicht eine einfache Übertragung von Organoiden und entfällt die Notwendigkeit, dass Organoide im OCT für die weitere Färbung abgetrennt werden, ein Verfahren, das für die Kellermembrane eingebettete Organoide11erforderlich ist. Neben den Vorteilen des überlegenen Wachstums erforderten die Aussaat von bestrahlten Organoiden in niedrigen Haftplatten weniger Schritte und war technisch weniger anspruchsvoll als die Kultivierung von Organoiden in Kellermembranen oder Kollagen. Bei der Färbung von Markern kann es jedoch hilfreich sein, Organoide unter dem Mikroskop zu betrachten, um sicherzustellen, dass keine zufällige Aspiration auftritt.

Darüber hinaus gibt es viele Überlegungen, die bei der Bildgebung von Organoiden berücksichtigt werden müssen. In der Kellermembran eingebetteten Organoiden kann gelegentliches Faserwachstum beobachtet werden (Abbildung 2C, D). Das Auswachsen von Fibroblasten in 3D-kultivierten Organoiden kann durch Organoide verursacht werden, die mit der Gewebekultur in Berührung kommen, da die Haftung zu einer hochgeprägten Fibroblast-Wachstumsfaktorproduktion in den anhaftenden Zellen 27 führt. Interessanterweise ähnelt die Morphologie dieser Fibroblasten den Voradipozyten auffallend, da beide Zelltypen spindelförmige, längliche Formen 28 aufweisen. Bei der weiteren Untersuchung kann die Exposition gegenüber Insulin, Dexamethason und 3-Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX) Zellen mit einer adipogenen Abstammung ergeben, was zu einer Verschiebung hin zu einer sphärenderen Zellform führen kann, die mit Adipozyten28assoziiert ist, 29. Wir erhielten klare Bilder mit Phasenkontrastmikroskopie von frei wachsender niedriger Haftung (Abbildung 3A-C) und Kellermembran eingebetteten (Abbildung 3D-G) Organoiden. Die Verfolgung des individuellen Organoidwachstums in niedrigen Haftplatten war jedoch aufgrund minimaler Brennstoffhaftung zwischen den Zellen und der Brunnenoberfläche schwierig, was zu organoider Bewegung und gelegentlicher Aspiration führte.

Einmal für Oberflächenmarkierungen gebeizt, hat die konfokale Mikroskopie eine klarere Markerlokalisierung(Abbildung 5E, F)als die Großfeldmikroskopie (Abbildung 5A-D). Aus der Fluoreszenzquantifizierung deuten Trends in der Phalloidin-Expression darauf hin, dass bestrahlte Organoide im Verhältnis zur Kontrolle erhöhte F-Akoide zum Ausdruck brachten (Abbildung 5G). Die Reorganisation des Actin-Zytoskeletts wurde in dermalen mikrovaskulären Endothelzellen beobachtet, die in ähnlichenDosierungen 30 bestrahlt wurden.

Für erweiterte Bildsequenzen, wie Zeitraffer-Ko-Kultur mit Immunzellen (Abbildung6), ist eine Live-Zell-Bildgebung mit Feuchtigkeit und CO2-Kontrolle erforderlich 31. Live-Zellbilder, die alle 30 Minuten aufgenommen wurden, zeigten, dass Makrophagen nach 24 Stunden mit Organoiden kolokalisiertwurden (Abbildung 6A, B), die vorzugsweise in Richtung bestrahlter Organoide wandern (Abbildung 6C). Die Makrophage-Infiltration in bestrahlte Normalgewebe wurde in vivo beobachtet, wird chemokin-und zytokindverläufenden Steigungen zugeschrieben und geht typischerweise der CTC-Rekrutierung5voraus. Zukünftige Studien werden klassisch und alternativ aktivierte Makrophage-Interaktionen mit Organoiden als polarisierte Makrophage-Dynamik bewerten, die eine wichtige Rolle beider Bestimmung der Reaktion auf die Strahlung 32, 33 spielenkann. Zusätzliche Analysen werden die Folgen des Serumhungers und die Wachstumseffekte der Kultivierung von Organoiden in den gesamten Medien untersuchen, da diese Variablen erhebliche Auswirkungen auf die Wechselwirkungen zwischen Organoid-Immunzellen haben können. Dieses System kann weiter für die Ko-Kultur mit anderen Zelltypen angepasst werden, darunter CD8+ T-Zellen, Stromalzellen, Adipozyten und Brustkrebszellen. Echtzeitbeobachtung mit Techniken wie Live-Zell-Bildgebung wird die Aufklärung von potenziellen Mechanismen, die zur CTC-Rekrutierung in bestrahltes normales Gewebe beitragen, die erhebliche Auswirkungen auf Patienten mit wiederkehrenden TNBC.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Wir danken Dr. Laura L. Bronsart für die Bereitstellung von GFP und dTomato-Bezeichnung RAW 264.7Makrophagen. Diese Forschung wurde durch das NIH-Stipendium #R00CA201304 finanziell unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Neutral Buffered Formalin VWR 16004-128
Anti-cytokeratin 14 abcam ab181595 Lot: GR3200524-3
Bovine Serum Albumin Sigma A1933-25G
Collagen Type I Corning 354236
Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII Sigma C2139
Collagenase I Gibco 17018029
DMEM/F12 Thermofisher 11320-033
DNAse Roche 10104159001
DPBS Fisher 14190250
E-Cadherin Cell Signaling 24E10 Lot: 13
FBS Sigma F0926
Gentamicin Gibco 15750
Goat anti-rabbit secondary abcam ab150077 green
Lot: GR3203000-1
Goat anti-rabbit secondary abcam ab150080 red
Lot: GR3192711-1
Hoechst 33342 Fisher 62249 Lot: TG2611041
Insulin (10 mg/mL) Sigma I9278
Insulin-Transferrin-Selenium, 100x Gibco 51500-056
Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma) Corning 356237
Normal Goat Serum Vector Laboratories S-1000
Nuclon Sphera 96 well plates Thermo 174927
PBS VWR 10128-856
Pen/strep Fisher 15140122
Phalloidin abcam ab176757 Lot: GR3214582-16
Tight Junction Protein 1 Novus NBP1-85047 Lot: C115428
Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol) Sigma X100-100ML
Trypsin Gibco 27250-018
Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate) Sigma P1379-100ML

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References

  1. Lautner, M., et al. Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer. Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).
  2. Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).
  3. Kim, M. Y., et al. Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
  4. Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
  5. Rafat, M., et al. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients. Cancer Research. 78 (15), 4241-4252 (2018).
  6. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  7. Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells. Development. 128, Cambridge, England. 3117-3131 (2001).
  8. Shamir, E. R., et al. Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin. Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).
  9. Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis. Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).
  10. Nguyen-Ngoc, K. -V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).
  11. Nguyen-Ngoc, K. -V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. 3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion. Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).
  12. Ewald, A. J. Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).
  13. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews. , (2018).
  14. DeNardo, D. G., et al. CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages. Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).
  15. Plaks, V., et al. Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis. Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).
  16. Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum. The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).
  17. Mandl, I., Zaffuto, S. F. Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase. The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).
  18. Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
  19. Zhang, L., et al. Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells. Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).
  20. Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).
  21. Richert, M. M., et al. An atlas of mouse mammary gland development. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).
  22. Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
  23. LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
  24. Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution. Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).
  25. Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).
  26. Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium. Development. 137, Cambridge, England. 4229-4238 (2010).
  27. Ingber, D., Folkman, J. Mechanochemical switching between growth and differentiation during fibroblast growth factor-stimulated angiogenesis in vitro: role of extracellular matrix. The Journal of Cell Biology. 109 (July), Available from: http://jcb.rupress.org/content/109/1/317.abstract (1989).
  28. Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. Understanding Adipocyte Differentiation. Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).
  29. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  30. Gabryś, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).
  31. Ewald, A. J. Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).
  32. Zhang, M., et al. A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients. Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).
  33. Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time. BioMed Central Cancer. 10, 112 (2010).

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Bioengineering Ausgabe 147 3D-Organoidkultur Brustdrüse normale Gewebestrahlungsreaktion Zellzellinteraktionen Brustkrebs Krebs-Immunologie
Wachstum und Charakterisierung der bestrahlten Organoide aus den Brustdrüsen
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Hacker, B. C., Gomez, J. D., Batista, C. A. S., Rafat, M. Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands. J. Vis. Exp. (147), e59293, doi:10.3791/59293 (2019).

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