Måling af enzymatisk stabilitet af isotermisk titrering kalorimetri

Summary

Den termiske stabilitet af enzymaktiviteten måles let af isotermisk titrering kalorimetri (ITC). De fleste protein stabilitet assays i øjeblikket anvendes foranstaltning protein udspiller sig, men give ikke oplysninger om enzymatisk aktivitet. ITC muliggør direkte bestemmelse af effekten af enzymet ændringer på stabiliteten af enzymaktiviteten.

Abstract

Dette arbejde viser en ny metode til måling af enzymaktiviteten stabilitet af isotermisk titrering kalorimetri (ITC). Peak varme sats observeret efter en enkelt injektion substratopløsning i et enzym løsning er korreleret med enzymaktivitet. Flere injektioner af underlaget i det samme enzym løsning over tid viser tabet af enzymaktiviteten. Analysen er autonome, der kræver meget lidt personale tid, og er gældende for de fleste medier og enzymer.

Introduction

Enzymer er proteiner i stand til at katalysere en lang række organiske reaktioner. De fleste enzymer funktion i vandig opløsning på nær neutral pH dermed undgå brugen af skrappe opløsningsmidler. På grund af deres høje selektivitet, enzym katalyserede reaktioner producere færre (i nogle tilfælde ingen biprodukter) biprodukter end non-selektive katalysatorer såsom syrer og baser¹. Dette er især relevant i food manufacturing, hvor alle kemiske reaktioner skal gøres, så det endelige produkt er sikkert til konsum. I øjeblikket, bruges enzymer til at producere høj fruktose majssirup², ost³, øl⁴, Laktosefri mælk⁵og andre vigtige fødevarer. Mens dette papir fokuserer på enzymet brug inden for levnedsmiddelindustrien, er der mange andre anvendelser for enzymer herunder i grøn kemi og narkotika syntese.

Nytten af enzymer er begrænset af stabiliteten af enzymaktiviteten, som afhænger af opretholde den tre-dimensionelle struktur af enzymet. Enzymets struktur kan være stabiliseret med ændringer, såsom PEGylation⁶, immobilisering på en solid støtte⁷, genetiske modifikationer⁸og formuleringer. I øjeblikket, enzym stabiliteten måles typisk ved differential scanning kalorimetri (DSC) og slutpunktet enzymaktivitet undersøgelser vedrørende⁹. DSC måler temperaturen på som et enzym udfolder; jo højere temperatur, jo mere stabil struktur. Men tabet af aktivitet ofte opstår ved en lavere temperatur end skal udfolde enzym eller domæner inden for enzymet¹⁰. DSC er derfor ikke tilstrækkeligt til at bestemme, om en enzym ændring øger stabiliteten af enzymaktiviteten. Slutpunkt enzym-assays er normalt tid intensive, kræver flere prøver, og ofte indebærer en koblede colorimetrisk reaktion, der ikke gælder for stærkt farvede eller uigennemsigtig løsninger eller suspensioner.

Dette arbejde viser en metode til direkte måling af enzymaktiviteten stabilitet af isotermisk titrering kalorimetri (ITC). ITC måler hastigheden på varme frigivet eller absorberes i løbet af en reaktion. Da næsten alle reaktioner producere eller absorbere varme, kan ITC bruges til de fleste enzym-katalyserede reaktioner, herunder reaktioner, som ikke har en koblede reaktion eller forekomme i uigennemsigtig medier såsom mælk. ITC har været brugt i mange årtier for at måle kemiske kinetiske parametre til mange former for reaktioner, men protokollen præsenteres her fokuserer på brug af ITC skal måle peak varme sats på enzym-katalyserede reaktioner og demonstrerer, enzymaktivitet er lineært korreleret med peak varme rate. ITC målinger af peak varme priser er for det meste selvstændige og kræver meget lidt personale tid til opsætning og analysere.

Protocol

1. forberede prøverne

1. 1.000 mL af 0,1 M natrium acetat buffer pH-værdi på 4,6
   1. Måle 800 mL destilleret vand i en 1000 mL dimitterede bægerglas.
   2. Vejer 8,2 g vandfrit natriumacetat og føje det til bægerglasset.
   3. Bægerglasset anbringes på en røre plade, placere en røre stang i bægerglasset, tænde røre pladen og rør indtil opløst.
   4. Når vandfrit natriumacetat er helt opløst, måle pH i opløsningen med et kalibreret pH-meter.
   5. Tilføj 1 M HCl eller NaOH i overensstemmelse hermed for at opnå den ønskede pH 4.6.
   6. Tilsættes destilleret vand, indtil det samlede volumen er 1.000 mL.
   7. Opbevares ved stuetemperatur indtil brug.
2. Enzym løsning
   1. Forberede 10 mL af enzymet løsning inden for området 10-30 mg/mL ved første måling 8 mL af 0,1 M natrium acetat buffer pH 4.6 i en 15 mL dimitterede cylinder.
   2. Tilføje bufferopløsning i en 15 mL konisk slange med enzym og rystes kraftigt indtil enzymet er opløst.
   3. Tilføje flere stødpudeopløsning, indtil det samlede volumen er 10 mL.
   4. Gemme enzym løsning ved 4 ° C indtil brug.
3. Substratopløsning
   1. For at forberede en substratopløsning inden for 300-600 mM interval, beregnes mængden af substrat behov i gram til at foretage den ønskede koncentration.
   2. Afvejes substratet og placere i en 100 mL glas bægerglas
   3. Mål 20 mL stødpudeopløsning ved hjælp af en 25 mL dimitterede cylinder og derefter føje det til glas bægerglas.
   4. Bægerglasset anbringes på en røre pladen og placere en magnetisk røre stang i bægerglasset. Tænd for varmen og Juster hastigheden på omrøring i overensstemmelse hermed.
   5. Tillad omrøring at fortsætte, indtil substratet er opløst.
   6. Hæld substratopløsningen i en 50 mL konisk slange og tilsættes 0,1 M natrium acetat buffer pH 4.6, indtil det samlede volumen er 45 mL. Blandes ved omrystning.
   7. Gemme substratopløsning ved stuetemperatur indtil brug.

2. udføre eksperimentet

1. Forberede ITC instrument
   1. Sikre, at cellen reference er fyldt med 350 µL destilleret vand. Før pålæsning kontrollere enzym i cellen prøve at prøve cellen er blevet renset.
   2. Rengøring protokol-Fill ladning sprøjte med 500 µL af 2% rengøring løsning (Table of Materials), omhyggeligt indsætte nålen ind i cellen, prøve, udfylde cellen og langsomt Fjern væsken ved hjælp af den samme sprøjte. Bortskaf væsken i et bægerglas. Gentag dette trin to gange med 2% rengøring løsning (Table of Materials), tre gange med 70% ethanol og derefter vaske ti gange med destilleret vand.
   3. Fyld ladning sprøjte med 450 µL af enzymet løsning, omhyggeligt indsætte nålen hele vejen til bunden af cellen prøve og tryk stemplet ned linjen 100 µL langsomt at forhindre dannelsen af luftbobler.
   4. Vask 50 µL titrering sprøjte med destilleret vand tre gange ved at placere nål-spidsen i vandet så langsomt at tage vand ind i sprøjten, så udlevering af vand i en spildbakken.
   5. Fjerne resterende vand ved at skylle med substratopløsning tre gange.
   6. Fyld titrering sprøjte med substratopløsning ved at trække løsningen, indtil sprøjten er fuld uden eventuelle luftbobler.
   7. Med sprøjten stadig i substratopløsningen, Fjern stemplet og lad ca 2 µL af luft at komme ind i toppen af sprøjten og genindsætte stemplet.
   8. Fjern buret håndtaget af ITC, placere sprøjte inde i buret håndtaget og skrue indtil stram.
   9. Udslette spidsen af omrører med en fnugfri serviet, så omhyggeligt placere buret håndtag i ITC instrument og låse det på plads.

3. opsætning af ITCrun

1. På computeren, åbne ITCrun og klik på Opret.
2. Klik på omrøring sats og indstillet til 350 RPM. Kontroller sprøjte størrelse (µL) og sikre, at det er på 50 µL.
3. Temperatur og tryk på Opdater. Det anbefales, at dette trin udføres mindst 1 time før forberede ITC. Dette giver mulighed for tilstrækkelig tid til instrument til at varme op eller køle ned efter behov.
4. Opsætningen af eksperimentet, Vælg incremental titrering.
5. Klik på Indsæt for at setup injektioner. Justere injektion interval til 5,400 s, injektionsvolumen (µL) 4 og antal injektioner til 4. Tryk på OK for at bekræfte indstillingerne.
6. Vælg Auto-reagensglasset og stor forventet varmer ækvilibrering boks. (Hvis den forventede opvarmer er små, man kan vælge lille under forventede heats, men dette vil øge ekvilibreringstid.)
7. Sæt den første grundlinje til 300 s.
8. For at begynde at køre, Klik Start symbol ved siden af omrøring sats og klik derefter på Start som ligger ved siden af symbolet skruenøgle.
9. Gem filen og tillade instrument til at køre.

4. analysere data

1. Åbn filen i NanoAnalyze. Klik på Data og vælge datakolonner.
2. Vælg alle data, kopiere og derefter indsætte dataene i Microsoft Excel.
3. Justere nul baseline ved at tilføje den værdi på 300 s for at gøre det nul. Anvende denne korrektion til hele kolonnen af varme sats værdier.
4. Finde minimums- eller værdien af de varme for hver injektion ved hjælp af ligningen: =MIN(cell:cell) eller MAX(cell:cell). Hvert datapunkt repræsenterer peak enzymatisk aktivitet af enzymet på hver injektion.
5. Plotte grafer over MIN eller MAX-værdier mod tid hvor værdien opstod under titreringen.

Representative Results

De repræsentative resultater i figur 1 og figur 5 viser data fra to enzymer, laktase og invertase. Laktase og invertase katalyserer hydrolyse af en disaccharid i to monosaccharider, endothermically og exotermt, henholdsvis. Begge enzymatiske reaktioner blev kørt i koncentrationer, der udelukker mætning af enzymet.

Laktase data viser, hvordan ITC data kan anvendes til at vurdere enzym stabilitet. Fire sekventielle 4 µL injektioner af 600 mM laktose (figur 1) blev titreret til 20 mg/mL laktase. Et interval på 5.400 s mellem hver indsprøjtning blev anvendt, og dette giver tilstrækkelig tid til at vende tilbage til den oprindelige baseline før hver injektion. Protokollen beskrevet ovenfor blev udført ved 25 ° C, 35 ° C, 45 ° C og 55 ° C. Derudover var 600 mM laktose titreres i 100 mM natrium acetat buffer kun på 55 ° C som en kontrol for varmen blanding. For hver injektion af enzymet i substrat, der er en indledende eksoterme varme blanding, og efterfølgende laktase katalyseret endoterm hydrolysen af laktose sker før reaktionen er færdig og den varme sats vender tilbage til den oprindelige plan. Indsprøjtning af laktose i laktase løsning gentages derefter tre gange med tophøjde endoterm reaktion fra hver efterfølgende injektion lidt mindre end den foregående injektion på grund af faldet i enzymatisk aktivitet. De rå data kan så konverteres til at vise den højeste varme i forhold til tid (figur 2A-D). Tophøjde for hver injektion kan derefter være egnet til en lineær regression og hældningen angiver enzym stabilitet på den valgte temperatur. Jo mere negativ hældning, mindre stabile enzymet. Som forventet, aftager enzym stabilitet med stigende temperatur (figur 2E).

Hver injektion af laktose beskrevet i figur 1 resulterer i en udvanding af laktase. For at vise, at denne fortynding ikke er årsag til faldet i enzymatisk aktivitet, blev ITC lactase aktivitet assay også gjort ved 25 ° C, laktase koncentration på den første injektion og på den sidste injektion (figur 3). Denne fortynding resultater i en 8% reduktion af enzymaktiviteten, mens den fjerde injektion i analysen viser en 73% nedgang i aktivitet. Fortynding af laktase under fire-injektion eksperimentet således havde en relativt lille effekt (dvs. 11%) på enzymaktiviteten. Det faktiske tab af aktivitet var derfor 73-8 = 65%.

Som nævnt i er Introduktion en af fordelene ved at bruge ITC, at disse reaktioner kan gøres i uigennemsigtig medier, såsom mælk. For at demonstrere denne evne af ITC, var mælk injiceres direkte i laktase (figur 4). Fordi pH af mælken ikke er afstemt til natrium acetat buffer, er der en stor eksoterme varme blanding umiddelbart efter injektion. Eksoterme varmen i blanding peak ses i den kontrol, der mangler laktase (figur 4, grå linje) og i de to injektioner med mælk (figur 4, sort og stiplede linjer) efter varmen blanding peak. Endoterm reaktion med angivelse af lactase aktivitet forekommer. Mælk indeholder en kompleks blanding af proteiner, vitaminer, mineraler og laktose. På grund af kompleksiteten af mælk er det sandsynligt, at andre reaktioner opstår i løbet af vores reaktion. For at vise, at den endoterm peak på grund af lactase aktivitet, blev mælken tilsat 146 mM laktose. I reaktionen med laktose tilsat mælk (figur 4, stiplede linje) er endoterm peak og arealet under kurven større end i den mælk alene (figur 4, sort linje), der angiver, den endoterm peak er faktisk på grund af lactase aktivitet. Forskydningen af baseline angiver, at en langsom reaktion fortsætter efter laktose reaktion er færdig.

For at demonstrere, hvordan dette assay kan bruges til at sammenligne stabiliteten af enzymatisk aktivitet af to forskellige enzympræparater, gratis invertase og invertase immobiliseret på en nylon-6 nanofiber membran stabilitet er sammenlignet i figur 5 ved 35 ° C¹¹ . Laktase assay, fire 4 µL injektioner af saccharose blev foretaget sekventielt og maksimal varme sats bestemmes fra tophøjde for hver injektion. Som vist i figur 6, falder tophøjder lineært med tid med angivelse af faldende enzymaktiviteten.

Figur 1 : ITC data spor af lactase aktivitet. Hvert spor viser fire sekventielle 4 µL injektioner af 600 mM laktose i en laktase løsning i pH 4.6 buffer. Sporene blev gjort ved 55 ° C (sort), 45 ° C (mørk grå), 35 ° C (knust), 25 ° C (lys grå) og en ingen enzym kontrol (prikket) ved 55 ° C. De lige linjer repræsenterer fit til endoterm peak minimum efter hver injektion.  Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2 : Stabilitet af enzymaktivitet baseret på antallet af ændring i peak aktivitet. Peak enzymatisk aktivitet for hver af fire injektioner i forhold til tid (s) på 25 ° C (A), 35 ° C (B), 45 ° C (C) og 55 ° C (D). Den lineære fit af data er repræsenteret ved den faste linje. Skråningerne af linjerne monteret i dele A-D plottes mod temperatur i E.  Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 : Effekten af enzymet fortynding på peak højde på 25 ° C. Lactase aktivitet måles ved enzymet koncentration på de første og fjerde injektioner på 20 mg/mL (sort) og 18.62 mg/mL (grå), henholdsvis. Indsatsen er en zoomet på grund af peak enzymaktivitet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4 : Måling af lactase aktivitet i mælk. ITC spor af en indsprøjtning af BYU creamery fedt gratis mælk til buffer (grå), mælk til 20 mg/mL laktase (sort) og mælk tilsat 5% ekstra laktose til 20 mg/mL (prikket). Y-aksen er diskontinuert vise endoterm enzym reaktion og den eksoterme varme blanding. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5 : Et repræsentativt eksempel på hvordan ITC enzym stabilitet analysen ved 35 ° C kan bruges til at sammenligne to forskellige præparater af invertase. Invertase immobiliseret på en nanofiber membran og frie enzym aktiviteter er vist ved de stiplede og mørk grå linjer, henholdsvis. Den sorte linje er kontrol med ingen invertase viser bare varmen blanding på passende skalaer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6 : Den lineær sammenhæng mellem peak eksoterme varme sats og invertase koncentration efter en 4 µL injektion af 600 mM saccharose. Denne standard kurve kan bruges til at bestemme koncentrationen af invertase i en ukendt prøve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

En stor fordel af ITC enzym stabilitet analysen beskrevet her er automatisering. Når alle de relevante buffere og løsninger er lavet, er set-up tid hvert assay ca. 15 min. til den person, der udfører analysen. I modsætning, de konventionelle assays til invertase og lactase aktivitet kræver ca 2 h med løbende inddragelse af den person, der udfører analysen og mange enzymaktivitet assays tage betydeligt flere mandetimer. I en tidligere publikation, har vi vist, hvordan data fra ITC metode sammenlignes med en mere traditionel spectrophotrometric metode for invertase aktivitet¹¹.

En anden fordel ved ITC assay er dens anvendelighed til næsten enhver enzym¹². Således kræver test stabilitet af forskellige enzymer under et bestemt sæt betingelser ikke opsætning af flere forskellige assays. Derudover er ITC assay nyttig til bestemmelse af stabiliteten af aktiviteten af et nyt enzym eller af et enzym, der ikke har en egnet kolorimetriske assay.  ITC analysen kan også gøres i uigennemsigtig medier, som er en stor fordel i fødevarevidenskab. Da de fleste tidligere assays af enzymaktivitet bruge spektrofotometri, fluorescens eller luminescence for at måle enzymaktivitet, er de ikke kompatible med uigennemsigtig eller stærkt farvet medier. Selv om dette arbejde viser kun effekt af temperatur på stabiliteten af enzymaktiviteten, kan ITC metoden anvendes til de fleste andre forhold, der påvirker enzym stabilitet (fx pH, salte, ikke-vandopløselige opløsningsmidler og denaturering agenter).

Som med alle ITC eksperimenter, bør den buffer, der bruges til enzym og substrat løsningen matcher så tæt som muligt. Misforhold af koncentration eller pH kan forårsage store varme effekter, der overstiger det dynamiske område af NA48. Brug af den samme bestandene buffer til at forberede både enzym og substrat løsninger er normalt tilstrækkeligt. Men hvis ikke, løsningerne, der kan matches af dialyzing begge løsninger mod den samme stødpudeopløsning.

En yderligere betingelse er at enzymet ikke bør substrat mættet, i hvilket tilfælde tophøjde bliver uafhængig af substratkoncentrationen. Også tid for reaktion til at gå til færdiggørelse eller ligevægt mellem injektioner kan blive for store og/eller signalet kan overstige den dynamiske række NA48. Men substratkoncentrationen skal være stor nok til at give et signal om stærk varme. Hvis enzymet er substrat mættet, substratkoncentrationen kan være nedsat, eller enzym koncentrationen øges. Når lastning NA48-celle og sprøjte, skal man sikre, at ingen bobler er til stede. Hvis en boble er indsprøjtet eller frigivet fra cellen i løbet af et eksperiment, vil det forårsage en unormal hændelse i varme sats signal.

ITC metode er afhængig af enthalpi ændringen af den katalyserede reaktion og på den procentsatsen og reaktion. Hvis enthalpi ændringen for reaktionen er for lille, underlaget er også uopløselige eller enzymet ikke har tilstrækkelig aktivitet, kan den varme sats være for lille til at opnå tilstrækkelig signal. Derudover hvis enzymet er hæmmet af lave koncentrationer af produkterne, vil faldet i enzymatisk aktivitet observeret i løbet af eksperimentet være forårsaget af produktet hæmning samt tab af aktivitet over tid. For eksempel i laktase titrering forårsager den endelige koncentration af 54 mM glucose og galactose en 27% reduktion af tophøjde af enzymaktivitet ved 55° C (data ikke vist). Dette er væsentligt mindre end 78% fald i peak højde fra injektion 1 til injektion 4 i figur 1. Men dette kan korrigeres ved måling af enzymaktiviteten i overværelse af produkt koncentrationen nået i løbet af analysen. Yderligere, tilsætningen enzym med mindre substrat kan reducere mængden af produkt hæmning.

Andre begrænsninger kan opstå på grund af enzymet. For eksempel, med hver injektion bliver enzymet fortyndet. Fordi denne ITC bruger et overløb reaktion fartøj, i løbet af eksperimentet er et rumfang af opløsning svarende til injektion størrelse fjernet med hver injektion. Således, en lille mængde enzym er fjernet, og produkterne af reaktionen stige med hver injektion. Virkningerne af fortynding og mængden af enzymet fjernet kan holdes små, hvis injektion størrelse holdes små og en stor koncentration af substrat er derfor ofte nødvendigt. Fordi forholdet mellem Injektionsvolumen til reaktion fartøj volumen er mindre i ITC'er med større reaktion fartøjer er fortynding effekten mindre end i den lave volumen ITC bruges i dette arbejde. Derudover hver reaktion for mange enzymer kræver mikrogram til lav milligram mængder, så hvis du har et enzym, der er dyrt eller svært at oprense, dette kunne forbyde brugen af denne analyse.

De fleste af de problemer, der kan opstå under denne assay er knyttet til korrekt vedligeholdelse og rengøring af ITC reaktion fartøj. Hvis ITC ikke nå en stabil basislinje, er dette ofte skyldes reaktion fartøj ikke er tilstrækkeligt rene. Vi anbefaler at bruge en stærk vaskemiddel efter hvert forsøg, når du bruger proteiner i ITC, fordi proteiner kan holde sig til reaktion fartøj og forstyrrer den varme hastighed måling. For en dybere ren, en 50% myresyre løsning inkuberes ved 55 ° C i op til 12 timer efterfulgt af rengøring med rengøringsmiddel (Table of Materials), ethanol og vand vil fjerne de fleste forurenende stoffer.

Endelig fordi ITC tager ca 45 min til Reagensglasset efter lastning løsninger, kan aktivitet af relativt ustabile enzymer eller marginale betingelser ikke være muligt. Hvis enzymet er inaktiveret i løbet af denne tid intet signal, vil være tilgængeligt eller henfald kan være for hurtig efter den første injektion til at opnå stabilitetsdata.

Fordi ITC assay måler direkte enzymaktivitet, kan den udvides til at omfatte en række andre anvendelser. For eksempel, kan dette assay gøres med stigende koncentrationer af en inhibitor at bestemme konstanten hæmning, Ki, baseret på faldet i enzymaktivitet med stigende hæmmer koncentration. Som vist i figur 5, kan denne protokol tilpasses immobiliseret enzymer på en solid støtte. En nanofiber membranen blev brugt i dette arbejde, men andre solid understøtter også kunne bruges hvis der kan udvikles en metode til at indsætte og fjerne det gennem små adgang rør. Metoden ITC kunne også udvides til at omfatte enzymer, der er ændret kemisk eller genetisk at forbedre termisk stabilitet eller til at bestemme mængden af aktive enzym i en ukendt prøve (dvs. figur 6 viser det lineære forhold mellem varme sats peak højde og enzym koncentration).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
a-Lactose	Fisher Scientific	unknown (too old)	500g
Sodium Acetate, Anhydrous 99% min	Alfa Aesar	A13184-30	250g
Lactase	MP Bio	100780	5g
Hydrocholric Acid Solution, 1N	Fisher Scientific	SA48-500	500mL
Benchtop Meter- pH	VWR	89231-622
Ethanol 70%	Fisher Scientific	BP8231GAL	1gallon
Micro-90	Fisher Scientific	NC024628	1L (cleaning solution)