Mesurer la stabilité enzymatique par calorimétrie isotherme de Titration

Summary

La stabilité thermique de l’activité enzymatique est facilement mesurable par calorimétrie isotherme titration (ITC). Des essais de stabilité protéique plus actuellement utilisé mesure protéine déplier, mais ne fournissent pas d’informations sur l’activité enzymatique. ITC permet la détermination directe de l’effet des modifications des enzymes sur la stabilité de l’activité enzymatique.

Abstract

Ce travail démontre une nouvelle méthode pour mesurer la stabilité de l’activité enzymatique par calorimétrie isotherme titration (ITC). Le taux de chaleur maximale observé après qu’une seule injection de la solution de substrat dans une solution d’enzyme est corrélée avec l’activité enzymatique. Des injections multiples du substrat dans la même solution d’enzyme au fil du temps montrent la perte de l’activité enzymatique. Le dosage est autonome, nécessitant très peu de temps du personnel et s’applique à la plupart des médias et des enzymes.

Introduction

Les enzymes sont des protéines capables de catalyser un large éventail de réactions organiques. La plupart fonction d’enzymes en solution aqueuse à pH neutre évitant ainsi l’utilisation de solvants agressifs. En raison de leur haute sélectivité, réactions enzymatiques catalysée produisent moins (dans certains ne cas, aucun sous-produits) sous-produits que catalyseurs non sélectifs tels que les acides et les bases¹. Ceci est particulièrement important dans la fabrication d’aliments où toutes les réactions chimiques doivent se faire si le produit final est plus sûr pour la consommation humaine. Actuellement, les enzymes sont utilisés pour produire de sirop de maïs riche en fructose², fromage³,⁴de la bière, lait sans lactose⁵et autres produits alimentaires importants. Bien que cet article se concentre sur l’utilisation des enzymes dans l’industrie alimentaire, il y a beaucoup d’autres utilisations pour les enzymes notamment dans la synthèse verte de chimie et de la drogue.

L’utilité des enzymes est limitée par la stabilité de l’activité enzymatique, qui repose sur le maintien de la structure tridimensionnelle de l’enzyme. La structure de l’enzyme peut être stabilisée par des modifications telles que PEGylation⁶, immobilisation sur un support solide⁷, modifications génétiques⁸et formulations. Actuellement, stabilité de l’enzyme est généralement mesurée par analyse calorimétrique différentielle (DSC) et des analyses de l’activité enzymatique point de terminaison⁹. DSC à mesurer la température à laquelle une enzyme se déploie ; plus la température est élevée, les plus stable de la structure. Toutefois, la perte d’activité se produit souvent à une température plus basse que celle nécessaire pour déplier l’enzyme ou les domaines au sein de l' enzyme¹⁰. Par conséquent, DSC ne suffit pas à déterminer si une modification de l’enzyme augmente la stabilité de l’activité enzymatique. Essais enzymatiques de point de terminaison sont généralement temps intensif, nécessitent plusieurs échantillons et impliquent souvent une réaction colorimétrique couplée qui n’est pas applicable aux solutions très colorées ou opaques ou de suspensions.

Ce travail démontre une méthode de mesure directe de la stabilité de l’activité enzymatique par calorimétrie isotherme titration (ITC). ITC mesure le taux de chaleur libérée ou absorbée au cours d’une réaction. Étant donné que presque toutes les réactions produisent ou absorbent la chaleur, ITC peut être utilisé pour la plupart des réactions catalysées par les enzymes, incluant des réactions qui ne pas avoir une réaction de couplage ou se produisent dans les milieux opaques tels que le lait. ITC a été utilisé pendant de nombreuses décennies pour mesurer des paramètres cinétiques chimiques pour de nombreux types de réactions, mais le protocole présenté ici se concentre sur l’utilisation de ITC pour mesurer le débit de chaleur du pic des réactions catalysées par les enzymes et démontre que l’activité enzymatique est linéairement en corrélation avec le débit de chaleur maximal. ITC mesures de taux de pic de chaleur sont le plus souvent autonomes et nécessitent très peu de temps personnel pour configurer et analyser.

Protocol

1. préparation des échantillons

1. 1 000 mL de tampon d’acétate de sodium 0,1 M à pH 4,6
   1. Mesurer 800 mL d’eau distillée dans un bécher de 1 000 mL gradué.
   2. Environ 8,2 g d’acétate de sodium anhydre et ajoutez-le dans le bécher.
   3. Placer le bécher sur une plaque de remuer, placer une tige de mélanger dans le bol, tournez sur la plaque de remuer et remuer jusqu'à dissolution complète.
   4. Lorsque l’acétate de sodium anhydre est complètement dissous, mesurer le pH de la solution avec un pH-mètre calibré.
   5. Ajouter 1 M HCl ou NaOH en conséquence pour obtenir le pH désiré 4.6.
   6. Ajouter l’eau distillée jusqu'à ce que le volume total est de 1 000 mL.
   7. Conserver à température ambiante avant utilisation.
2. Solution d’enzyme
   1. Préparer 10 mL de la bouteille de solution dans la fourchette de 10 à 30 mg/mL de première mesure 8 mL de le 0,1 M acétate de sodium tampon pH 4,6 dans un 15 mL graduée enzyme.
   2. Ajouter la solution tampon dans un tube conique de 15 mL avec de l’enzyme et agiter vigoureusement jusqu'à ce que l’enzyme soit dissout.
   3. Ajouter plus de solution tampon jusqu'à ce que le volume total est de 10 mL.
   4. Conserver la solution d’enzyme à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.
3. Solution de substrat
   1. Pour préparer une solution de substrat dans la fourchette de 300 à 600 mM, calculer la quantité de substrat nécessaire en grammes pour rendre la concentration désirée.
   2. Peser le substrat et les placer dans un bécher de verre de 100 mL
   3. 20 ml de la solution tampon à l’aide d’un cylindre jaugée de 25 mL et puis ajoutez-le à la carafe en verre.
   4. Placer le bécher sur une plaque de remuer et placer une tige d’agitation magnétique dans le bécher. Sur la chaleur et régler la vitesse d’agitation en conséquence.
   5. Laisser en remuant pour continuer jusqu'à ce que le substrat soit dissout.
   6. Verser la solution de substrat dans un tube conique de 50 mL et ajouter 0,1 M de sodium acétate tampon pH 4,6, jusqu'à ce que le volume total est de 45 mL. Mélanger en agitant.
   7. Stocker la solution de substrat à la température ambiante jusqu'à utilisation.

2. effectuer l’expérience

1. Préparation de l’instrument de l’ITC
   1. Veiller à ce que la cellule de référence est chargée avec 350 µL d’eau distillée. Avant de charger l’enzyme dans la cellule, vérifier que la cellule a été nettoyée.
   2. Nettoyage de protocole-remplir la seringue de chargement avec 500 µL de solution de nettoyage de 2 % (Table des matières), insérer l’aiguille dans la cellule, remplir la cellule et retirer lentement le liquide à l’aide de la même seringue. Jeter le liquide dans un bécher. Répétez cette étape deux fois avec la solution de nettoyage de 2 % (Table des matières), trois fois avec l’éthanol à 70 % et laver ensuite dix fois avec de l’eau distillée.
   3. Remplir la seringue de chargement de 450 µL de solution d’enzyme, soigneusement insérer l’aiguille tout le chemin vers le bas de la cellule et appuyez sur le piston jusqu'à la ligne de 100 µL lentement pour éviter la formation de bulles d’air.
   4. Laver la seringue de titrage de 50 µL d’eau distillée trois fois en plaçant la pointe de l’aiguille dans l’eau puis lentement prenant l’eau dans la seringue, puis distribution de l’eau dans un conteneur à déchets.
   5. Enlever l’eau résiduelle en rinçant avec une solution de substrat trois fois.
   6. Remplir la seringue de titrage de la solution de substrat en dessinant la solution jusqu'à ce que la seringue est pleine sans bulles d’air.
   7. Avec la seringue encore dans la solution de substrat, retirer le piston et laisser environ 2 µL de l’air d’entrer dans la partie supérieure de la seringue et réinsérez le piston.
   8. Retirer la poignée de buret du CTI, placez la seringue à l’intérieur de la poignée de buret et visser jusqu’au serrage.
   9. Essuyez l’embout de l’agitateur avec un tissu non pelucheux, puis, avec précaution, placez la poignée de buret dans l’instrument de l’ITC et verrouiller en place.

3. mise en place ITCrun

1. Sur l’ordinateur, ouvrez ITCrun et cliquez sur configurer.
2. Cliquez sur en remuant le taux et la valeur 350 tr/min. Vérifiez la taille de la seringue (µL) et que c’est à 50 µL.
3. Régler la température, puis appuyez sur mise à jour. Il est recommandé d’effectuer cette étape au moins 1 h avant de préparer l’ITC. Cela permet de suffisamment de temps pour l’instrument chauffer ou refroidir selon les besoins.
4. Pour le montage, sélectionnez titration progressive.
5. Cliquez sur insérer pour configurer les injections. Régler l’intervalle d’injection de 5 400 s, volume (µL) d’injection à 4 et le nombre d’injections à 4. Appuyez sur OK pour confirmer les paramètres.
6. Dans la boîte de l’équilibration, sélectionnez Auto-équilibrer , prévu de gros manches. (Si les chaleurs attendues sont faibles, on peut choisir petit sous les chaleurs attendues ; cependant, cela augmentera le temps d’équilibrage).
7. Définir la planification initiale de 300 s.
8. Démarre l’exécution, cliquez le démarrage symbole à côté du taux de brassage , puis cliquez sur Start qui se trouve à côté du symbole de clé.
9. Enregistrez le fichier et laissez l’instrument s’exécuter.

4. analyse des données

1. Ouvrez le fichier dans NanoAnalyze. Cliquez sur données , puis sélectionnez les colonnes de données.
2. Sélectionnez toutes les données, copiez et puis coller les données dans Microsoft Excel.
3. Régler le zéro ligne de base en ajoutant la valeur désirée à 300 s faire zéro. Appliquer cette correction à la colonne entière des valeurs de taux de chaleur.
4. Trouver la valeur minimale ou maximale du taux de chaleur pour chaque injection en utilisant l’équation : =MIN(cell:cell) ou MAX(cell:cell). Chaque point de données représente le pic de l’activité enzymatique de l’enzyme à chaque injection.
5. Tracer les graphiques des valeurs MIN ou MAX contre le temps auquel la valeur s’est produite lors de la titration.

Representative Results

Les résultats représentatifs dans la Figure 1 et Figure 5 affichent des données de deux enzymes, la lactase et invertase. La lactase et invertase catalysent l’hydrolyse d’un disaccharide en deux monosaccharides, endothermique et exothermique, respectivement. Les deux réactions enzymatiques ont été exécutées à des concentrations qui empêchaient la saturation de l’enzyme.

Les données de la lactase démontrent comment les données de l’ITC peuvent être utilisées pour estimer la stabilité enzymatique. Quatre des séquentielle 4 injections µL de 600 mM de lactose (Figure 1) ont été titrées en lactase 20 mg/mL. Un intervalle de 5 400 s entre chaque injection a été appliquée, et cela permet de suffisamment de temps revenir à la ligne de base initial avant chaque injection. Le protocole décrit ci-dessus a été réalisé à 25 ° C, 35 ° C, 45 ° C et 55 ° C. En outre, 600 mM de lactose a été titré en tampon d’acétate de sodium 100 mM seulement à 55 ° C, comme un contrôle pour la chaleur de mélange. Pour chaque injection d’enzyme dans le substrat, il y a une chaleur exothermique initiale de mélange, et par la suite l’hydrolyse endothermique de lactase catalysée par du lactose se produit jusqu'à ce que la réaction est terminée et le taux de chaleur revient à la ligne de base. L’injection du lactose dans la solution de la lactase est ensuite répétée trois fois avec la hauteur du pic de la réaction endothermique de chaque injection ultérieure un peu moins de l’injection précédente en raison de la diminution de l’activité enzymatique. Les données brutes peuvent ensuite être converties pour montrer la chaleur maximale par rapport au temps (Figure 2 a-D). La hauteur du pic pour chaque injection peut ensuite être adaptée à une régression linéaire et la pente indique la stabilité enzymatique à la température choisie. Les plus négatif de la pente, la moins stable l’enzyme. Comme prévu, stabilité enzymatique diminue avec l’augmentation de la température (Figure 2E).

Chaque injection de lactose décrit dans la Figure 1 résultats en dilution de lactase. Afin de démontrer que cette dilution n’est pas la cause de la diminution de l’activité enzymatique, l’analyse d’activité de la lactase ITC a été également fait à 25 ° C, la concentration de lactase à la première injection et à la dernière injection (Figure 3). Cette dilution se traduit par une diminution de 8 % de l’activité enzymatique, tandis que la quatrième injection dans le test fait apparaître une diminution de 73 % en activité. La dilution de la lactase durant l’expérience de quatre-injection a donc eu un effet relativement faible (11 %) sur l’activité enzymatique. La perte réelle de l’activité était donc 73-8 = 65 %.

Tel que mentionné dans l’introduction, l’un des avantages de l’utilisation de ITC est que ces réactions peuvent être faites dans des milieux opaques, tels que le lait. Pour illustrer cette fonctionnalité du CCI, lait a été injecté directement dans la lactase (Figure 4). Parce que le pH du lait ne correspond pas à la mémoire tampon acétate de sodium, il y a une grande chaleur exothermique de mélange immédiatement après l’injection. La chaleur exothermique du mélange pic est vu dans le contrôle qui manque de lactase (Figure 4, ligne grise) et dans les deux injections avec du lait (Figure 4, noir et en pointillés) à la suite de la chaleur de mélange de pointe. La réaction endothermique indiquant l’activité lactasique survient. Le lait contient un mélange complexe de protéines, de vitamines, de minéraux et de lactose. En raison de la complexité du lait, il est probable que les autres réactions se produisent au cours de notre réaction. Afin de démontrer que le pic endothermique est en raison de l’activité lactasique, le lait a été additionné de 146 mM de lactose. Dans la réaction avec le lait de lactose dopé (Figure 4, en pointillé), les pics endothermiques et l’aire sous la courbe sont plus grandes que dans le lait seul (Figure 4, noir ligne), indiquant que le pic endothermique est en effet en raison de l’activité lactasique. L’offset de base indique qu’une réaction lente se poursuit après que la réaction de lactose est terminée.

Pour démontrer comment ce test peut être utilisé pour comparer la stabilité de l’activité enzymatique des deux préparations d’enzymes différentes, la stabilité de l’invertase libre et l’invertase immobilisés sur une membrane de nylon-6 nanofibres sont comparés à la Figure 5 à 35 ° C¹¹ . Comme dans l’essai de la lactase, injections de quatre 4 µL de saccharose ont été faites dans l’ordre et le taux de chaleur maximale déterminée à partir de la hauteur du pic pour chaque injection. Tel qu’illustré à la Figure 6, les hauteurs des pics diminuent linéairement avec le temps, indiquant l’activité enzymatique décroissante.

Figure 1 : Traces de données CTI de l’activité lactasique. Chaque trace indique quatre injections de µL 4 séquentielle de 600 mM au lactose dans une solution de lactase dans tampon pH 4,6. Les traces ont été faites à 55 ° C (noir), 45 ° C (gris foncé), 35 ° C (anéantis), 25 ° C (gris clair) et un aucun contrôle enzymatique (en pointillé) à 55 ° C. Les lignes droites représentent l’ajustement au minimum pics endothermiques après chaque injection.  S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Stabilité de l’activité enzymatique basée sur le taux de variation en période d’activité maximale. Le pic d’activité enzymatique pour chacun des quatre injections par rapport au temps (s) à 25 ° C (A), 35 ° C (B), 45 ° C (C) et 55 ° C (D). L’ajustement linéaire des données est représentée par la ligne continue. Les pentes des lignes ajustées dans les parties A à D sont tracées contre température dans E.  S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : L’effet de dilution des enzymes sur la hauteur des pics à 25 ° C. Activité de la lactase est mesurée à la concentration de l’enzyme dans les premiers et quatrième injections de 20 mg/mL (noir) et 18,62 mg/mL (gris), respectivement. L’encart est un zoom compte tenu de l’activité enzymatique de la crête. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Mesurer l’activité de la lactase dans le lait. Trace de CCI d’une injection du lait sans gras dans buffer (gris) de BYU creamery, lait en lactase 20 mg/mL (noir) et le lait additionné de 5 % de lactose supplémentaires à 20 mg/mL (en pointillé). L’axe des y est discontinue pour montrer la réaction endothermique enzymatique et la chaleur exothermique de mélange. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Un exemple représentatif de comment l’essai de stabilité enzymatique ITC à 35 ° C pourrait être utilisé pour comparer deux préparations différentes d’invertase. L’activité de l’invertase immobilisés sur une membrane de nanofibres et l’enzyme libre est représentées par les lignes gris sombres et en pointillés, respectivement. La ligne noire est le contrôle avec aucun invertase montre juste la chaleur de mélange à des échelles appropriées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : La relation linéaire entre la chaleur exothermique taux et invertase concentration maximale après une injection de 4 µL de saccharose de 600 mM. Cette courbe d’étalonnage peut être utilisée pour déterminer la concentration de l’invertase dans un échantillon inconnu. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Un avantage majeur de l’ITC stabilité enzymatique décrite ici est automation. Une fois que toutes les zones tampons appropriées et les solutions sont apportées, le temps d’installation pour chaque dosage est environ 15 min pour la personne qui effectue l’essai. En revanche, les tests classiques pour l’activité de l’invertase et la lactase nécessitent environ 2 h avec la participation continue de la personne qui effectue l’essai et de nombreux tests d’activité enzymatique prennent beaucoup plus d’heures de travail. Dans une publication précédente, nous avons démontré comment les données de la méthode de la CCI se comparant à une méthode plus traditionnelle de spectrophotrometric pour l’activité de l’invertase¹¹.

Un autre avantage du test de l’ITC est son applicabilité à presque n’importe quelle enzyme¹². Ainsi, le test de stabilité des différentes enzymes sous un ensemble particulier de conditions n’exige pas mise en place de plusieurs essais différents. En outre, l’essai de l’ITC est utile pour déterminer la stabilité de l’activité d’une nouvelle enzyme ou d’une enzyme qui n’est pas un test colorimétrique adéquat.  Le dosage de la CCI est aussi possible en milieu opaque qui est un avantage majeur en sciences alimentaires. Puisque la plupart essais précédents de l’activité enzymatique utilisent luminescence, fluorescence ou spectrophotométrie pour mesurer l’activité enzymatique, ils ne sont pas compatibles avec support opaque ou fortement colorés. Bien que ce travail ne démontre que l’effet de la température sur la stabilité de l’activité enzymatique, la méthode ITC s’applique à la plupart des autres conditions qui affectent la stabilité de l’enzyme (par exemple, pH, sels, solvants non aqueux et agents de dénaturation).

Comme avec toutes les expériences de l’ITC, la mémoire tampon utilisée pour la solution de l’enzyme et le substrat doit correspondre aussi étroitement que possible. Incompatibilité de la concentration ou le pH peut provoquer des effets de grande chaleur qui dépassent la plage dynamique du calorimètre. Utilisation du même stock tampon pour préparer les solutions de l’enzyme et le substrat est généralement suffisante. Mais si non, les solutions peuvent être associées par dialyse les deux solutions contre la même solution tampon.

Une autre condition est que l’enzyme ne doit pas être saturée de substrat, dans ce cas, la hauteur du pic devient indépendante de la concentration du substrat. En outre, le temps de la réaction d’aller jusqu'à la fin ou à l’équilibre entre les injections peuvent devenir excessif et/ou le signal peut dépasser la plage dynamique du calorimètre. Toutefois, la concentration du substrat doit être assez grande pour fournir un signal de forte chaleur. Si l’enzyme est saturée de substrat, la concentration du substrat peut être diminuée ou augmenté la concentration de l’enzyme. Lors du chargement de la cellule de calorimètre et la seringue, il faut s’assurer qu’aucune bulle n’est présents. Si une bulle est injectée ou libérée de la cellule au cours d’une expérience, il provoquera un événement anormal dans le signal de taux de chaleur.

La méthode CCI dépend le changement d’enthalpie de la réaction catalysée et sur le taux et le montant de la réaction. Si le changement d’enthalpie de la réaction est trop petit, le substrat est trop insoluble ou l’enzyme n’a pas suffisamment d’activité, le taux de chaleur peut être trop petit pour obtenir le signal suffisant. En outre, si l’enzyme est inhibée par de faibles concentrations des produits, la diminution de l’activité enzymatique observée au cours de l’expérience engendrera par inhibition du produit ainsi que par la perte d’activité au fil du temps. Par exemple, dans le titrage de la lactase, la concentration finale de 54 mM de glucose et de galactose provoque une diminution de 27 % de la hauteur du pic de l’activité enzymatique à 55° C (données non présentées). Ceci est nettement inférieur à la baisse de 78 % à hauteur de pic d’injection 1 à injection 4 dans la Figure 1. Cependant, ceci peut être corrigé en mesurant l’activité enzymatique en présence de la concentration de produit atteinte au cours de l’essai. En outre, le fait de titrage de l’enzyme avec moins substrat peut réduire la quantité d’inhibition de produit.

Autres limitations peuvent survenir en raison de l’enzyme. Par exemple, avec chaque injection l’enzyme sera le dilué. Car ce CTI utilise un réacteur de débordement, un volume de solution équivalente à la taille de l’injection est supprimé au cours de l’expérience avec chaque injection. Ainsi, une petite quantité d’enzyme est supprimée, et les produits de la réaction augmentent avec chaque injection. Les effets de la dilution et la quantité d’enzyme supprimé peuvent être maintenus petits si la taille de l’injection est conservée petite, et donc une grande concentration de substrat est souvent nécessaire. Parce que le ratio du volume d’injection au volume de navire de réaction est moins CTI avec cuves de réaction plus grande et l’effet de dilution est plus petit que le faible volume ITC utilisée dans ce travail. En outre, chaque réaction de nombreuses enzymes exigera microgramme milligramme de faibles quantités, donc si vous avez une enzyme qui est coûteux ou difficiles à purifier, cela pourrait interdire l’utilisation de ce test.

La plupart des problèmes qui peuvent survenir au cours de cet essai sont liés à l’entretien et le nettoyage de la cuve de réaction d’ITC. Si l’ITC n’atteint pas un niveau de référence stable, c’est souvent à cause de la cuve de réaction n’est ne pas suffisamment propre. Nous vous recommandons d’utiliser un détergent fort après chaque expérience lors de l’utilisation des protéines de l’ITC, parce que les protéines peuvent rester dans la cuve de réaction et interférer avec la mesure de taux de chaleur. Pour une plus profonde propre, une solution d’acide formique 50 % incubée à 55 ° C pendant 12 h puis nettoyer avec une solution nettoyante (Table des matières), l’éthanol et l’eau va supprimer la plupart des contaminants.

Enfin, parce que la CCI prend environ 45 min s’équilibrer après le chargement des solutions, l’activité des enzymes relativement instables ou dans des conditions marginales ne serait pas possible. Si l’enzyme est inactivée au cours de cette heure aucun signal, sera disponible ou la décroissance peut être trop rapide après la première injection pour obtenir des données sur la stabilité.

Parce que l’essai ITC mesure directement l’activité enzymatique, il peut être étendu à un certain nombre d’autres utilisations. Par exemple, cet essai pourrait être fait avec l’augmentation des concentrations d’un inhibiteur pour déterminer que la constante d’inhibition, Ki, basée sur la diminution de l’activité enzymatique avec la concentration de l’inhibiteur. Tel qu’illustré à la Figure 5, le présent protocole peut être adapté pour des enzymes immobilisées sur un support solide. Une membrane de nanofibres a été utilisée dans ce travail, mais les autres supports solides pourraient également être utilisés si une méthode pour insérer et retirer à travers le tube petit accès peut être développée. La méthode ITC pourrait également être étendue aux enzymes qui sont modifiés chimiquement ou génétiquement pour améliorer la stabilité thermique ou pour déterminer la quantité d’enzyme active dans un échantillon inconnu (par exemple, la Figure 6 illustre la relation linéaire entre la vitesse maximale de chaleur concentration de hauteur et de l’enzyme).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
a-Lactose	Fisher Scientific	unknown (too old)	500g
Sodium Acetate, Anhydrous 99% min	Alfa Aesar	A13184-30	250g
Lactase	MP Bio	100780	5g
Hydrocholric Acid Solution, 1N	Fisher Scientific	SA48-500	500mL
Benchtop Meter- pH	VWR	89231-622
Ethanol 70%	Fisher Scientific	BP8231GAL	1gallon
Micro-90	Fisher Scientific	NC024628	1L (cleaning solution)