Summary
एंजाइम गतिविधि के थर्मल स्थिरता आसानी से समतापी अनुमापन कैलोरीमिति (आईटीसी) द्वारा मापा जाता है । अधिकांश प्रोटीन स्थिरता assays वर्तमान में इस्तेमाल किया माप प्रोटीन का खुलासा है, लेकिन एंजाइमी गतिविधि के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करते । आईटीसी एंजाइम गतिविधि की स्थिरता पर एंजाइम संशोधनों के प्रभाव के प्रत्यक्ष निर्धारण में सक्षम बनाता है ।
Abstract
यह काम समतापी अनुमापन कैलोरीमिति (आईटीसी) द्वारा एंजाइम गतिविधि की स्थिरता को मापने के लिए एक नई विधि को दर्शाता है । एक एंजाइम समाधान में सब्सट्रेट समाधान के एक इंजेक्शन के बाद देखा पीक हीट दर एंजाइम गतिविधि के साथ सहसंबद्ध है । समय के साथ एक ही एंजाइम समाधान में सब्सट्रेट के एकाधिक इंजेक्शन एंजाइम गतिविधि के नुकसान को दर्शाते हैं । परख स्वायत्त है, बहुत कम कर्मियों समय की आवश्यकता होती है, और सबसे मीडिया और एंजाइमों के लिए लागू है ।
Introduction
एंजाइमों कार्बनिक प्रतिक्रियाओं की एक विस्तृत सरणी उत्प्रेरक के लिए सक्षम प्रोटीन हैं । अधिकांश एंजाइमों के पास तटस्थ पीएच पर जलीय समाधान में समारोह इस प्रकार कठोर सॉल्वैंट्स के उपयोग से परहेज । क्योंकि उनके उच्च चयनशीलता, एंजाइम उत्प्रेरक प्रतिक्रियाओं कम उत्पादन (कुछ मामलों में कोई byproducts) गैर से byproducts-ऐसे एसिड और कुर्सियां1के रूप में चयनात्मक उत्प्रेरक । यह खाद्य निर्माण में विशेष रूप से प्रासंगिक है जहां सभी रासायनिक प्रतिक्रियाओं किया जाना चाहिए ताकि अंतिम उत्पाद मानव उपभोग के लिए सुरक्षित है । वर्तमान में, एंजाइमों उच्च फ्रुक्टोज कॉर्न सिरप2, पनीर3, बियर4, लैक्टोज मुक्त दूध5, और अन्य महत्वपूर्ण खाद्य उत्पादों का उत्पादन करने के लिए उपयोग किया जाता है । हालांकि इस पत्र में खाद्य उद्योग में एंजाइम के उपयोग पर ध्यान केंद्रित है, वहां कई अंय एंजाइम के लिए उपयोग करता है सहित हरी रसायन विज्ञान और दवा संश्लेषण में ।
एंजाइमों की उपयोगिता एंजाइम गतिविधि की स्थिरता द्वारा सीमित है, जो एंजाइम की त्रि-आयामी संरचना को बनाए रखने पर निर्भर करता है । एंजाइम संरचना ऐसे PEGylation6के रूप में संशोधनों से स्थिर किया जा सकता है, एक ठोस समर्थन7पर स्थिरीकरण, आनुवंशिक संशोधनों8, और योगों । वर्तमान में, एंजाइम स्थिरता आम तौर पर अंतर स्कैनिंग कैलोरीमिति (DSC) और समापन बिंदु एंजाइम गतिविधि9assays द्वारा मापा जाता है । DSC तापमान जिस पर एक एंजाइम करेंगी उपाय; उच्च तापमान, और अधिक स्थिर संरचना । हालांकि, गतिविधि की हानि अक्सर एंजाइम के भीतर एंजाइम या डोमेन को प्रकट करने के लिए आवश्यकता से कम तापमान पर होता है10. इसलिए, DSC एक एंजाइम संशोधन एंजाइम गतिविधि की स्थिरता बढ़ जाती है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए पर्याप्त नहीं है । समापन बिंदु एंजाइम assays आमतौर पर समय गहन हैं, कई नमूनों की आवश्यकता होती है, और अक्सर एक युग्मित वर्णमिति प्रतिक्रिया है कि उच्च रंग या अपारदर्शी समाधान या निलंबन के लिए लागू नहीं है शामिल हैं ।
यह काम समतापी अनुमापन कैलोरीमिति (आईटीसी) द्वारा एंजाइम गतिविधि की स्थिरता के प्रत्यक्ष माप के लिए एक विधि को दर्शाता है । आईटीसी अभिक्रिया के दौरान जारी या अवशोषित ऊष्मा की दर का मापन करती है । चूंकि लगभग सभी प्रतिक्रियाओं का उत्पादन या गर्मी को अवशोषित, आईटीसी सबसे एंजाइम उत्प्रेरक प्रतिक्रियाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रतिक्रियाओं है कि एक युग्मित प्रतिक्रिया नहीं है या ऐसे दूध के रूप में अपारदर्शी मीडिया में होते हैं, सहित । आईटीसी कई दशकों के लिए इस्तेमाल किया गया है प्रतिक्रियाओं के कई प्रकार के लिए रासायनिक गतिज मापदंडों को मापने के लिए, लेकिन यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल आईटीसी का उपयोग करने के लिए एंजाइम उत्प्रेरक प्रतिक्रियाओं की पीक गर्मी की दर को मापने पर केंद्रित है और यह दर्शाता है कि एंजाइम गतिविधि linearly है शिखर गर्मी की दर के साथ सहसंबद्ध । पीक हीट दरों की आईटीसी माप ज्यादातर स्वायत्त है और सेटअप और विश्लेषण करने के लिए बहुत कम कर्मियों समय की आवश्यकता है ।
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Protocol
1. नमूनों की तैयारी
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०.१ एम सोडियम एसीटेट बफर के १,००० एमएल में पीएच ४.६
- एक १,००० मिलीलीटर स्नातक बीकर में आसुत जल के ८०० मिलीलीटर उपाय ।
- वजन ८.२ जी के एनहाइड्रोस सोडियम एसीटेट और इसे बीकर में जोड़ें ।
- एक हलचल थाली पर बीकर प्लेस, बीकर में एक हलचल छड़ी प्लेस, हलचल थाली पर बारी और पूरी तरह से भंग जब तक हलचल ।
- जब निर्जल सोडियम एसीटेट पूरी तरह से भंग हो जाता है, एक calibrated पीएच मीटर के साथ समाधान के पीएच उपाय ।
- वांछित पीएच ४.६ प्राप्त करने के लिए तदनुसार 1 एम एचसीएल या NaOH जोड़ें ।
- डिस्टिल्ड पानी जोड़ें जब तक कि कुल मात्रा १,००० मिलीलीटर है ।
- उपयोग जब तक कमरे के तापमान पर स्टोर ।
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एंजाइम विलयन
- 10-30 मिलीग्राम/एमएल रेंज के भीतर एंजाइम समाधान के 10 मिलीलीटर पहले एक 15 मिलीलीटर एेसे सिलेंडर में ०.१ मीटर सोडियम एसीटेट बफर पीएच ४.६ के 8 मिलीलीटर को मापने के द्वारा तैयार करें ।
- एंजाइम के साथ एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में बफर समाधान जोड़ें और एंजाइम भंग हो गया है जब तक जोरदार हिला ।
- कुल वॉल्यूम 10 mL है जब तक अधिक बफ़र समाधान जोड़ें ।
- उपयोग करने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर एंजाइम समाधान स्टोर ।
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सब्सट्रेट विलयन
- 300-600 मिमी रेंज के भीतर एक सब्सट्रेट समाधान तैयार करने के लिए, वांछित एकाग्रता बनाने के लिए ग्राम में जरूरत सब्सट्रेट की राशि की गणना.
- सब्सट्रेट और एक १०० मिलीलीटर ग्लास बीकर में जगह तौलना
- एक 25 मिलीलीटर एेसे सिलेंडर का उपयोग कर बफर सॉल्यूशन की 20 मिलीलीटर नाप कर उसे कांच के बीकर में डालें ।
- एक हलचल थाली पर बीकर प्लेस और बीकर में एक चुंबकीय हलचल छड़ी जगह । गर्मी पर बारी और तदनुसार सरगर्मी गति समायोजित करें ।
- जब तक सब्सट्रेट भंग कर दिया है जारी रखने के लिए सरगर्मी की अनुमति दें ।
- एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में सब्सट्रेट समाधान डालो और कुल मात्रा ४५ मिलीलीटर जब तक ०.१ एम सोडियम एसीटेट बफर पीएच ४.६ जोड़ें । मिलाते हुए मिक्स ।
- उपयोग करने तक कमरे के तापमान पर सब्सट्रेट समाधान स्टोर.
2. प्रयोग प्रदर्शन
- आईटीसी का इंस्ट्रूमेंट तैयार
- सुनिश्चित करें कि संदर्भ सेल आसुत जल के ३५० μL के साथ भरी हुई है । एंजाइम को नमूना कक्ष में लोड करने से पहले, सत्यापित करें कि नमूना कक्ष साफ़ किया गया है ।
- सफाई प्रोटोकॉल-2% की सफाई समाधान (सामग्री की मेज) के ५०० μl के साथ लोडिंग सिरिंज भरें, ध्यान से नमूना सेल में सुई डालने के लिए, सेल को भरने और धीरे से एक ही सिरिंज का उपयोग कर तरल हटा दें । तरल को बीकर में निपटाएं । दो बार इस कदम को दोहराएं 2% सफाई समाधान के साथ (सामग्री की मेज), ७०% इथेनॉल के साथ तीन बार और फिर आसुत पानी के साथ दस बार धो लें ।
- एंजाइम समाधान के ४५० μL के साथ लदान सिरिंज भरें, ध्यान से नमूना सेल के नीचे करने के लिए सुई सभी तरह डालने और हवा के बुलबुले के गठन को रोकने के लिए धीरे से १०० μL लाइन करने के लिए नीचे डुबकी दबाएँ.
- पानी में सुई टिप रखकर तीन बार आसुत पानी के साथ ५० μL टाइट्रेट सिरिंज धो लें, फिर धीरे से सिरिंज में पानी ले रही है, तो एक अपशिष्ट कंटेनर में पानी वितरण ।
- सब्सट्रेट समाधान के साथ rinsing द्वारा अवशिष्ट पानी निकालें तीन बार.
- सिरिंज किसी भी हवा के बुलबुले के बिना भरा है जब तक समाधान ड्राइंग द्वारा सब्सट्रेट समाधान के साथ अनुमापन सिरिंज भरें ।
- अभी भी सब्सट्रेट समाधान में सिरिंज के साथ, डुबकी लगाने और हवा के लगभग 2 μL सिरिंज के शीर्ष में प्रवेश और डुबकी फिर से डालने के लिए अनुमति देते हैं ।
- आईटीसी के ब्रेट हैंडल को निकालें, सिरिंज को ब्रेट हैंडल के अंदर लगाएं और टाइट होने तक स्क्रू करें ।
- एक lint मुक्त ऊतक के साथ विलोडक की नोक पोंछ, तो ध्यान से आईटीसी उपकरण में ब्यूरेट संभाल जगह और यह जगह में ताला ।
3. ITCrun की स्थापना
- कंप्यूटर पर, Itcrun खोलें और सेटकरेंक्लिक करें ।
- सरगर्मी दर पर क्लिक करें और ३५० RPM के लिए निर्धारित किया है । सिरिंज आकार (μL) की जांच करें और सुनिश्चित करें कि यह ५० μL पर है ।
- तापमान और प्रेस अद्यतनसेट करें । यह अनुशंसा की जाती है कि इस चरण को आईटीसी तैयार करने से पहले कम से 1 h किया जाए । इस उपकरण के लिए पर्याप्त समय की अनुमति देता है गर्मी या शांत नीचे के रूप में की जरूरत है ।
- प्रयोग सेटअप के लिए, वृद्धिशील टाइट्रेट करें चुनें.
- इंजेक्शन सेटअप करने के लिए सम्मिलित करेंक्लिक करें । 4 के लिए इंजेक्शन अंतराल को समायोजित करें ५,४०० s, इंजेक्शन मात्रा (μL) करने के लिए 4 और इंजेक्शन की संख्या । सेटिंग्स की पुष्टि करने के लिए ठीक दबाएं ।
- equilibration बॉक्समें, ऑटो-equilibrate और बड़ी उम्मीदतपता का चयन करें । (यदि अपेक्षित तपता छोटे हैं, तो एक की उंमीद तपता के तहत छोटे का चयन कर सकते हैं; हालांकि, यह संतुलन समय में वृद्धि होगी.)
- प्रारंभिक आधार रेखा ३०० s करने के लिए सेट करें ।
- चलाएँ प्रारंभ करने के लिए, भावप्रवण दर के आगे प्रारंभ प्रतीक पर क्लिक करें और फिर प्रारंभ करें जो रिंच प्रतीक के बगल में स्थित है.
- फ़ाइल सहेजें और साधन चलाने के लिए अनुमति देते हैं ।
4. डेटा का विश्लेषण
- फ़ाइल को नैनोविश्लेषण में खोलें । डेटा क्लिक करें और डेटा स्तंभचुनें ।
- सभी डेटा का चयन करें, प्रतिलिपि बनाएं और फिर डेटा को Microsoft Excel में चिपकाएं ।
- शून्य आधार रेखा को शून्य बनाने के लिए ३०० s पर आवश्यक मान जोड़कर समायोजित करें. इस सुधार को गर्मी दर मानों के पूरे स्तंभ पर लागू करें ।
- समीकरण का उपयोग करके प्रत्येक इंजेक्शन के लिए ऊष्मा दर का ंयूनतम या अधिकतम मान ढूंढें: = MIN (कक्ष: कक्ष) या अधिकतम (कक्ष: कक्ष) । प्रत्येक डेटा बिंदु प्रत्येक इंजेक्शन पर एंजाइम की चोटी एंजाइमी गतिविधि का प्रतिनिधित्व करता है ।
- टाइट्रेट करने के दौरान मान के समय के विरुद्ध ंयूनतम या अधिकतम मानों का प्लॉट ग्राफ़ ।
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Representative Results
प्रतिनिधि चित्रा 1 में परिणाम और चित्रा 5 दो एंजाइमों, लैक्टेज और invertase से डेटा दिखाते हैं । लैक्टेस और इनपर्टेस एक डिसएकैराइड के हाइड्रोलिसिस को दो मोनोसैकैराइड में उत्प्रेरित करता है, जो क्रमशः अंतःतापीय और ऊष्मातापी होता है । दोनों एंजाइमी प्रतिक्रियाओं सांद्रता कि एंजाइम की संतृप्ति precluded पर चला रहे थे ।
लैक्टेज डेटा प्रदर्शित करता है कि कैसे आईटीसी डेटा का उपयोग एंजाइम स्थिरता का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है । चार अनुक्रमिक 4 μL इंजेक्शन ६०० मिमी लैक्टोज (चित्रा 1) 20 मिलीग्राम/मिलीलीटर lactase में titrated थे । प्रत्येक इंजेक्शन के बीच ५,४०० s का अंतराल लागू किया गया था, और यह प्रत्येक इंजेक्शन से पहले प्रारंभिक आधार रेखा पर लौटने के लिए पर्याप्त समय की अनुमति देता है । ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल 25 ° c, ३५ ° c, ४५ ° c, और ५५ ° c पर किया गया था । इसके अतिरिक्त, ६०० मिमी लैक्टोज मिश्रण की गर्मी के लिए एक नियंत्रण के रूप में केवल ५५ डिग्री सेल्सियस पर १०० मिमी सोडियम एसीटेट बफर में titrated किया गया था । सब्सट्रेट में एंजाइम के प्रत्येक इंजेक्शन के लिए, वहाँ मिश्रण की एक प्रारंभिक ऊष्माक्षेपी गर्मी है, और बाद में लैक्टेज उत्प्रेरक ऊष्माशोषी hydrolysis लैक्टोज की प्रतिक्रिया पूरा हो गया है जब तक होता है और गर्मी की दर बेसलाइन के लिए रिटर्न. लैक्टेज समाधान में लैक्टोज का इंजेक्शन तो प्रत्येक बाद इंजेक्शन से एक थोड़ा कम एंजाइमी गतिविधि की कमी के कारण पूर्ववर्ती इंजेक्शन से ऊष्माशोषी प्रतिक्रिया की चोटी ऊंचाई के साथ तीन बार दोहराया है । कच्चे डेटा तो समय के सापेक्ष पीक गर्मी दिखाने के लिए परिवर्तित किया जा सकता है (चित्रा 2A-D) । प्रत्येक इंजेक्शन के लिए पीक ऊंचाई तो एक रैखिक प्रतीपगमन करने के लिए फिट हो सकता है और ढलान चुना तापमान पर एंजाइम स्थिरता को इंगित करता है । अधिक नकारात्मक ढलान, कम स्थिर एंजाइम । उंमीद के रूप में, एंजाइम स्थिरता तापमान में वृद्धि के साथ कम हो जाती है (चित्रा 2E) ।
लैक्टोस के प्रत्येक इंजेक्शन को चित्र 1 में वर्णित लैक्टोज के तनुकरण में परिणाम है । यह प्रदर्शित करने के लिए कि इस कमजोर करना एंजाइमी गतिविधि में कमी का कारण नहीं है, आईटीसी लैक्टेज गतिविधि परख भी 25 डिग्री सेल्सियस पर किया गया था, पहले इंजेक्शन में लैक्टेज एकाग्रता और अंतिम इंजेक्शन पर (चित्रा 3) । यह एक 8% एंजाइम गतिविधि में कमी के परिणाम में कमजोर पड़ने, जबकि परख में चौथे इंजेक्शन गतिविधि में एक ७३% कमी से पता चलता है । इस प्रकार चार-इंजेक्शन प्रयोग के दौरान लैक्टेस के कमजोर पड़ने का एक अपेक्षाकृत छोटा प्रभाव (यानी, 11%) एंजाइम गतिविधि पर । गतिविधि की वास्तविक हानि इसलिए 73-8 = ६५% था ।
जैसा कि शुरूआत में बताया गया है कि आईटीसी का उपयोग करने के फायदों में से एक यह है कि इन प्रतिक्रियाओं को अपारदर्शी मीडिया, जैसे दूध में किया जा सकता है । आईटीसी की इस क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए, दूध को सीधे लैक्टेस में इंजेक्ट किया गया (चित्र 4) । क्योंकि दूध के पीएच सोडियम एसीटेट बफर करने के लिए मिलान नहीं है, वहां तुरंत इंजेक्शन के बाद मिश्रण की एक बड़ी ऊष्माक्षेपी गर्मी है । मिश्रण पीक की ऊष्माक्षेपी गर्मी नियंत्रण में देखा जाता है कि लैक्टेज (चित्रा 4, ग्रे लाइन) और दूध के साथ दो इंजेक्शन में (चित्रा 4, काले और बिंदीदार लाइनें) मिश्रण पीक की गर्मी के बाद का अभाव है । लैक्टेस गतिविधि का संकेत करने वाली एंडोथर्मिक अभिक्रिया होती है । दूध प्रोटीन, विटामिन, खनिज, और लैक्टोज का एक जटिल मिश्रण होता है । दूध की जटिलता के कारण, यह संभव है कि अन्य प्रतिक्रियाओं हमारी प्रतिक्रिया के दौरान हो. यह प्रदर्शित करने के लिए कि ऊष्माशोषी चोटी लैक्टेज गतिविधि के कारण है, दूध १४६ मिमी लैक्टोज के साथ नुकीला था । लैक्टोज नुकीला दूध (चित्रा 4, बिंदीदार रेखा) के साथ प्रतिक्रिया में, ऊष्माशोषी चोटी और वक्र के तहत क्षेत्र अकेले दूध की तुलना में बड़ा है (चित्रा 4, काली रेखा), यह दर्शाता है कि ऊष्माशोषी चोटी वास्तव में लैक्टेज गतिविधि के कारण है । आधार रेखा ऑफ़सेट इंगित करता है कि लैक्टोज प्रतिक्रिया समाप्त होने के बाद एक धीमा प्रतिक्रिया जारी रहती है ।
प्रदर्शित करने के लिए कैसे इस परख दो अलग एंजाइम की तैयारी के एंजाइमी गतिविधि की स्थिरता की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, मुक्त invertase की स्थिरता और एक नायलॉन-6 नैनोफाइबर झिल्ली पर invertase मैटीरियल की तुलना कर रहे हैं चित्रा 5 में ३५ डिग्री सेल्सियस पर11 . लैक्टेज परख के रूप में, सुक्रोज के चार 4 μl इंजेक्शन क्रमिक रूप से और अधिकतम गर्मी प्रत्येक इंजेक्शन के लिए पीक ऊंचाई से निर्धारित की दर से बना रहे थे । के रूप में चित्र 6में दिखाया गया है, चोटी ऊंचाई कम एंजाइम गतिविधि का संकेत समय के साथ linearly कम ।
चित्रा 1 : लैक्टेज गतिविधि के आईटीसी डेटा निशान । प्रत्येक ट्रेस चार अनुक्रमिक 4 μl इंजेक्शन ६०० mM लैक्टोज के पीएच ४.६ बफर में एक लैक्टेज समाधान में दिखाता है । ५५ डिग्री सेल्सियस (ब्लैक), ४५ डिग्री सेल्सियस (डार्क ग्रे), ३५ डिग्री सेल्सियस (डैश्ड), 25 डिग्री सेल्सियस (लाइट ग्रे), और ५५ डिग्री सेल्सियस पर कोई एंजाइम नियंत्रण (चिन्हांकित) पर निशान किया गया । सीधे लाइनों प्रत्येक इंजेक्शन के बाद ऊष्माशोषी पीक ंयूनतम करने के लिए फिट प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2 : शिखर गतिविधि में परिवर्तन की दर के आधार पर एंजाइम गतिविधि की स्थिरता । 25 ° c (A), ३५ ° c (B), ४५ ° c (c), और ५५ ° c (D) पर समय के सापेक्ष चार इंजेक्शन के प्रत्येक के लिए पीक एंजाइमी गतिविधि । डेटा के रेखीय फ़िट को ठोस रेखा द्वारा दर्शाया जाता है । ए -डी भागों में सज्जित रेखाओं की ढलानों को ईमें तापमान के विरुद्ध प्लॉट किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3 : 25 डिग्री सेल्सियस पर पीक ऊंचाई पर एंजाइम कमजोर पड़ने का प्रभाव । लैक्टेस गतिविधि को क्रमशः 20 मिग्रा/एमएल (ब्लैक) और १८.६२ मिलीग्राम/एमएल (ग्रे) के पहले और चौथे इंजेक्शन में एंजाइम सांद्रण पर मापा जाता है । इनसेट एक चोटी एंजाइम गतिविधि को देखने में तेजी से बढ़ी है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4 : दूध में लैक्टेस गतिविधि को मापने. बफर (ग्रे) में byu creamery वसा मुक्त दूध के एक इंजेक्शन के आईटीसी ट्रेस, दूध 20 मिलीग्राम/मिलीलीटर लैक्टेज (काला) में, और दूध 5% अतिरिक्त लैक्टोज के साथ 20 मिलीग्राम/मिलीलीटर (बिंदीदार) में नुकीला । y अक्ष को एंडोथर्मिक एंजाइम अभिक्रिया और मिश्रण की ऊष्माक्षेपी ऊष्मा को दिखाना असंतत है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5 : कैसे ३५ डिग्री सेल्सियस पर आईटीसी एंजाइम स्थिरता परख का एक प्रतिनिधि उदाहरण invertase के दो अलग तैयारी की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक नैनोफाइबर झिल्ली और मुक्त एंजाइम पर invertase मैटीरियल की गतिविधियों क्रमशः बिंदीदार और अंधेरे ग्रे लाइनों द्वारा दिखाए जाते हैं । काली रेखा नहीं invertase के साथ नियंत्रण है सिर्फ उचित तराजू पर मिश्रण की गर्मी दिखा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 6 : ६०० मिमी sucrose के एक 4 μl इंजेक्शन के बाद चोटी ऊष्माक्षेपी गर्मी दर और invertase एकाग्रता के बीच रेखीय संबंध । यह मानक वक्र एक अज्ञात नमूने में invertase की एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
आईटीसी एंजाइम स्थिरता परख का एक प्रमुख लाभ यहां वर्णित स्वचालन है । एक बार सभी उपयुक्त बफ़र्स और समाधान बना रहे हैं, प्रत्येक परख के लिए सेट अप समय परख कर व्यक्ति के लिए लगभग 15 मिनट है । इसके विपरीत, invertase और लैक्टेज गतिविधि के लिए पारंपरिक assays परख कर व्यक्ति की निरंतर भागीदारी और कई एंजाइमी गतिविधि assays काफी अधिक व्यक्ति घंटे लेने के साथ के बारे में 2 एच की आवश्यकता है । पिछले प्रकाशन में, हम प्रदर्शन किया है कि कैसे आईटीसी विधि से डेटा invertase गतिविधि11के लिए एक और अधिक पारंपरिक स्पेक्ट्रोफोट्रामितीय विधि की तुलना करता है ।
आईटीसी परख का एक और लाभ लगभग किसी भी12एंजाइम के लिए अपनी प्रयोज्यता है । इस प्रकार, शर्तों के एक विशेष सेट के तहत विभिंन एंजाइमों की स्थिरता का परीक्षण कई विभिंन assays स्थापित करने की आवश्यकता नहीं है । इसके अतिरिक्त, आईटीसी परख एक उपंयास एंजाइम या एक एंजाइम है कि एक उपयुक्त वर्णमिति परख नहीं है की गतिविधि की स्थिरता का निर्धारण करने के लिए उपयोगी है । आईटीसी परख भी अपारदर्शी मीडिया में किया जा सकता है जो खाद्य विज्ञान में एक प्रमुख लाभ है । एंजाइम गतिविधि के सबसे पिछले assays के बाद से, वे अपारदर्शी या अत्यधिक रंगीन मीडिया के साथ संगत नहीं कर रहे हैं स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री, प्रतिदीप्ति, या एंजाइम गतिविधि को मापने के लिए संदीप्ति का उपयोग करें. हालांकि यह काम केवल एंजाइम गतिविधि की स्थिरता पर तापमान के प्रभाव को दर्शाता है, आईटीसी विधि ज्यादातर अंय स्थितियों है कि एंजाइम स्थिरता को प्रभावित करने के लिए लागू होता है (जैसे, पीएच, लवण, गैर जलीय सॉल्वैंट्स, और denaturing एजेंटों) ।
सभी आईटीसी प्रयोगों के साथ के रूप में एंजाइम और सब्सट्रेट समाधान के लिए इस्तेमाल बफर के रूप में संभव के रूप में बारीकी से मेल खाना चाहिए. एकाग्रता या पीएच के बेमेल बड़ी गर्मी प्रभाव है कि कैलोरीमीटर की गतिशील रेंज से अधिक हो सकती है । दोनों एंजाइम और सब्सट्रेट समाधान तैयार करने के लिए एक ही स्टॉक बफर का उपयोग आमतौर पर पर्याप्त है. लेकिन यदि नहीं, तो समाधान एक ही बफर समाधान के खिलाफ दोनों समाधान dialyzing द्वारा मिलान किया जा सकता है ।
एक और शर्त यह है कि एंजाइम सब्सट्रेट संतृप्त नहीं होना चाहिए, जिस स्थिति में, पीक ऊंचाई सब्सट्रेट एकाग्रता से स्वतंत्र हो जाता है. इसके अलावा, पूरा करने के लिए जाने के लिए या इंजेक्शन के बीच संतुलन के लिए प्रतिक्रिया के लिए समय अत्यधिक हो सकता है और/या संकेत कैलोरीमीटर की गतिशील रेंज से अधिक कर सकते हैं । हालांकि, सब्सट्रेट एकाग्रता एक मजबूत गर्मी संकेत प्रदान करने के लिए काफी बड़ा होना चाहिए. यदि एंजाइम संतृप्त सब्सट्रेट है, सब्सट्रेट एकाग्रता कम किया जा सकता है, या एंजाइम एकाग्रता में वृद्धि हुई. जब कैलोरीमीटर सेल और सिरिंज लोड हो रहा है, एक सुनिश्चित करना चाहिए कि कोई बुलबुले मौजूद हैं । यदि एक बुलबुला एक प्रयोग के दौरान सेल से इंजेक्शन या जारी किया जाता है, यह गर्मी दर संकेत में एक असंगत घटना का कारण होगा ।
आईटीसी पद्धति उत्प्रेरक अभिक्रिया की एन्थैल्पी परिवर्तन तथा अभिक्रिया की दर तथा मात्रा पर निर्भर करती है । यदि प्रतिक्रिया के लिए एन्थैल्पी परिवर्तन बहुत छोटा है, सब्सट्रेट भी अघुलनशील है, या एंजाइम पर्याप्त गतिविधि नहीं है, गर्मी की दर भी पर्याप्त संकेत प्राप्त करने के लिए बहुत छोटा हो सकता है. इसके अतिरिक्त, यदि एंजाइम उत्पादों की कम सांद्रता द्वारा हिचकते हैं, तो प्रयोग के दौरान देखी गई एंजाइमेटिक गतिविधि में कमी उत्पाद संदमन के साथ-साथ समय के साथ गतिविधि की हानि के कारण होगी । उदाहरण के लिए, लैक्टेस टाइट्रेट में, ५४ मिमी ग्लूकोज और गैलेक्टोज की अंतिम एकाग्रता 55 डिग्री सेल्सियस (नहीं दिखाया डेटा) में एंजाइम गतिविधि की चोटी ऊंचाई में 27% कमी का कारण बनता है । यह 1 से इंजेक्शन 4 में इंजेक्शन 1 से पीक ऊंचाई में ७८% की कमी से काफी कम है । हालांकि, यह परख के दौरान पहुंच उत्पाद एकाग्रता की उपस्थिति में एंजाइम गतिविधि को मापने के द्वारा सही किया जा सकता है । इसके अलावा, कम सब्सट्रेट के साथ एंजाइम titrating उत्पाद निषेध की राशि को कम कर सकते हैं ।
अन्य सीमाएं एंजाइम के कारण हो सकती हैं । उदाहरण के लिए, प्रत्येक इंजेक्शन के साथ एंजाइम पतला हो जाएगा । क्योंकि यह आईटीसी एक अतिप्रवाह प्रतिक्रिया पोत का उपयोग करता है, प्रयोग के दौरान इंजेक्शन के आकार के बराबर समाधान की मात्रा प्रत्येक इंजेक्शन के साथ हटा दिया जाता है । इस प्रकार, एंजाइम की एक छोटी राशि निकाल दिया जाता है, और प्रत्येक इंजेक्शन के साथ प्रतिक्रिया वृद्धि के उत्पादों । कमजोर पड़ने का प्रभाव और हटा एंजाइम की मात्रा छोटे रखा जा सकता है अगर इंजेक्शन का आकार छोटा रखा जाता है, और इसलिए सब्सट्रेट की एक बड़ी एकाग्रता अक्सर आवश्यक है. क्योंकि प्रतिक्रिया पोत मात्रा के लिए इंजेक्शन की मात्रा का अनुपात बड़ी प्रतिक्रिया जहाजों के साथ ITCs में छोटे है कमजोर पड़ने प्रभाव कम मात्रा में इस काम में इस्तेमाल किया आईटीसी की तुलना में छोटा है । इसके अतिरिक्त, कई एंजाइमों के लिए प्रत्येक प्रतिक्रिया माइक्रोग्राम कम मिलीग्राम मात्रा के लिए की आवश्यकता होगी, इसलिए यदि आप एक एंजाइम है कि महंगा है या शुद्ध करने के लिए मुश्किल है, यह इस परख के उपयोग को प्रतिबंधित कर सकता है ।
इस परख के दौरान पैदा कर सकते है कि मुद्दों के अधिकांश उचित रखरखाव और आईटीसी रिएक्शन पोत की सफाई से संबंधित हैं । यदि आईटीसी एक स्थिर बेसलाइन तक नहीं पहुंचती है, तो यह अक्सर रिएक्शन पोत के पर्याप्त साफ न होने के कारण होता है । हम प्रत्येक प्रयोग के बाद एक मजबूत डिटर्जेंट का उपयोग करने की सलाह देते हैं जब आईटीसी में प्रोटीन का उपयोग करते हैं क्योंकि प्रोटीन रिएक्शन पोत से चिपके रहते हैं और गर्मी दर माप के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं । एक गहरी साफ करने के लिए, एक ५०% चींटी एसिड समाधान 12 के लिए ५५ डिग्री सेल्सियस पर इंसेबटेड (सामग्री की मेज), इथेनॉल, और पानी सबसे contaminants दूर होगा सफाई समाधान के साथ सफाई के बाद ।
अंत में, क्योंकि आईटीसी के बारे में ४५ मिनट लेता है के लिए समाधान लोड करने के बाद equilibrate, अपेक्षाकृत अस्थिर एंजाइमों की गतिविधि या सीमांत स्थितियों के तहत संभव नहीं हो सकता है । एंजाइम इस समय कोई संकेत के दौरान निष्क्रिय है, तो उपलब्ध हो जाएगा या क्षय पहले इंजेक्शन के बाद स्थिरता डेटा प्राप्त करने के लिए भी तेजी से हो सकता है ।
क्योंकि आईटीसी परख सीधे एंजाइम गतिविधि उपाय, यह अंय का उपयोग करता है की एक संख्या को बढ़ाया जा सकता है । उदाहरण के लिए, इस परख एक अवरोध करनेवाला की सांद्रता में वृद्धि के साथ किया जा सकता है अवरोध स्थिरांक निर्धारित करने के लिए, की, बढ़ती अवरोध करनेवाला एकाग्रता के साथ एंजाइम गतिविधि में कमी पर आधारित है । चित्रा 5में दिखाया गया है, इस प्रोटोकॉल एक ठोस समर्थन पर मैटीरियल एंजाइम के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । एक नैनोफाइबर झिल्ली इस काम में इस्तेमाल किया गया था, लेकिन अन्य ठोस समर्थन करता है भी अगर एक विधि डालने के लिए और इसे दूर करने के लिए छोटे पहुँच ट्यूब के माध्यम से विकसित किया जा सकता इस्तेमाल किया जा सकता है. आईटीसी पद्धति भी एंजाइमों कि रासायनिक या आनुवंशिक रूप से बदल रहे है थर्मल स्थिरता में सुधार या एक अज्ञात नमूने में सक्रिय एंजाइम की राशि का निर्धारण करने के लिए बढ़ाया जा सकता है (यानी, चित्रा 6 गर्मी की दर चोटी के बीच रैखिक संबंध से पता चलता है ऊंचाई और एंजाइम एकाग्रता) ।
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Disclosures
कोई नहीं
Acknowledgments
कोई नहीं
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| a-Lactose | Fisher Scientific | unknown (too old) | 500g |
| Sodium Acetate, Anhydrous 99% min | Alfa Aesar | A13184-30 | 250g |
| Lactase | MP Bio | 100780 | 5g |
| Hydrocholric Acid Solution, 1N | Fisher Scientific | SA48-500 | 500mL |
| Benchtop Meter- pH | VWR | 89231-622 | |
| Ethanol 70% | Fisher Scientific | BP8231GAL | 1gallon |
| Micro-90 | Fisher Scientific | NC024628 | 1L (cleaning solution) |
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