Summary

Måle enzymatisk stabilitet av isotermiske titrering Calorimetry

Published: March 26, 2019
doi:

Summary

Termisk stabilitet av enzym aktivitet måles lett isotermiske titrering calorimetry (ITC). De fleste protein stabilitet analyser for tiden brukt mål protein utspiller seg, men gir ikke informasjon om enzymatisk aktivitet. ITC kan direkte fastsettelse av effekten av enzymet modifikasjoner på stabiliteten av enzym aktivitet.

Abstract

Dette arbeidet demonstrerer en ny metode for å måle stabiliteten av enzym aktivitet av isotermiske titrering calorimetry (ITC). Topp varme hastigheten observert etter en enkelt injeksjon av substratløsningen i et enzym løsning er korrelert med enzym aktivitet. Flere injeksjoner av underlaget i samme enzym løsningen over tid viser tap av enzym aktivitet. Analysen er autonome, krever lite personell tid, og de fleste medier og enzymer.

Introduction

Enzymer er proteiner i stand til å utløse en rekke organiske reaksjoner. De fleste enzymer funksjon i vandig løsning på nær nøytral pH dermed unngår bruk av sterke løsemidler. På grunn av deres høye selektivitet, katalysert enzymreaksjoner produserer færre (i noen tilfeller ingen biprodukter) biprodukt enn ikke-selektive katalysatorer som syrer og baser1. Dette er spesielt relevant i mat foredling der alle kjemiske reaksjoner må gjøres så det endelige produktet er trygg for menneskelig konsum. Foreløpig brukes enzymer til å produsere høy fruktose mais sirup2, ost3, øl4, laktose-fri melk5og andre viktige matvarer. Mens dette papiret fokuserer på enzymet bruk i næringsmiddelindustrien, er det mange andre bruksområder for enzymer inkludert i grønn kjemi og narkotika syntese.

Nytten av enzymer er begrenset av stabiliteten av enzym aktivitet, som avhenger av opprettholde tredimensjonale strukturen av enzymet. Enzym strukturen kan stabiliseres av modifikasjoner som PEGylation6, immobilisering på en solid støtte7, genetiske modifikasjoner8og formuleringer. Foreløpig enzym stabilitet måles vanligvis differensial skanning calorimetry (DSC) og sluttpunktet enzym aktivitet søk9. DSC måler temperaturen som utfolder seg et enzym; det høyere temperaturen, mer stabil struktur. Imidlertid forekommer tap av aktivitet ofte ved lavere temperatur enn nødvendig å utfolde det enzym eller domener i enzym10. Derfor er DSC ikke tilstrekkelig til å fastslå om en enzym modifikasjon øker stabiliteten på enzymaktiviteten. Endepunktet enzym analyser er vanligvis tidkrevende, krever flere eksempler, og ofte innebære en kombinert kolorimetrisk reaksjon som ikke gjelder for svært farget eller ugjennomsiktig løsninger eller suspensjoner.

Dette arbeidet viser en metode for direkte måling av stabiliteten av enzym aktivitet ved isotermiske titrering calorimetry (ITC). ITC måler varme eller opptatt i løpet av en reaksjon. Siden nesten alle reaksjoner produsere eller absorberer varme, kan ITC brukes til de fleste enzym-katalysert reaksjoner, inkludert reaksjoner som ikke har en kombinert reaksjon eller oppstår i ugjennomsiktig medier som melk. ITC har vært brukt i mange tiår for å måle kjemiske kinetic parametere for mange typer reaksjoner, men protokollen presenteres her fokuserer på bruk av ITC for å måle peak varme hastigheten enzym-katalysert reaksjoner og viser at enzym aktivitet er lineært korrelert med topp varme hastighet. ITC målinger av topp varme er hovedsakelig autonome og krever lite personell tid å setup og analysere.

Protocol

1. klargjør prøver 1000 mL 0.1 M natrium acetate buffer ved pH 4.6 Måle 800 mL destillert vann i et 1000 mL uteksaminert beaker. Veie 8.2 g vannfri natrium acetate og legge den til begeret. Legg begeret på en røre tallerken, plassere rør stang i begeret, slå på rør platen og rør til fullstendig oppløst. Når vannfri natrium acetate er fullstendig oppløst, kan du måle pH av løsningen med en kalibrert pH-meter. Legg 1 M HCl elle…

Representative Results

Representant resultatene i figur 1 og figur 5 viser data fra to enzymer, laktase og invertase. Laktase og invertase katalysere hydrolyse av et smakløst i to monosaccharides, endothermically og exothermically, henholdsvis. Begge enzymatiske reaksjoner ble kjørt i konsentrasjoner som utelukket metning av enzymet. Laktase dataene viser hvordan ITC data kan brukes til å beregne enzym stabilitet. Fire sammenhengende 4 µL injeksjoner av…

Discussion

En stor fordel for ITC enzym stabilitet analysen beskrevet her er automatisering. Når alle aktuelle buffere og løsninger er gjort, er oppsett-tid for hver analysen ca 15 min for personen gjør analysen. I kontrast, de konvensjonelle analyser for invertase og laktase aktivitet krever ca 2 timer med kontinuerlig involvering av personen gjør analysen og mange enzymatisk aktivitet analyser ta betydelig konstant. I en tidligere publikasjon, har vi vist hvordan data fra metoden ITC sammenlignet med en mer tradisjonell spect…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ingen

Materials

a-Lactose Fisher Scientific  unknown (too old) 500g
Sodium Acetate, Anhydrous 99% min Alfa Aesar A13184-30 250g
Lactase  MP Bio 100780 5g
Hydrocholric Acid Solution, 1N  Fisher Scientific  SA48-500 500mL
Benchtop Meter- pH VWR 89231-622
Ethanol 70% Fisher Scientific  BP8231GAL 1gallon
Micro-90 Fisher Scientific  NC024628 1L (cleaning solution)

References

  1. Anastas, P., Eghbali, N. Green chemistry: principles and practice. Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).
  2. Jin, L. Q., et al. Immobilization of Recombinant Glucose Isomerase for Efficient Production of High Fructose Corn Syrup. Applied Biochemistry Biotechnoiogy. 183 (1), 293-306 (2017).
  3. Budak, &. #. 3. 5. 0. ;. &. #. 2. 1. 4. ;., Koçak, C., Bron, P. A., de Vries, R. P. . Microbial Cultures and Enzymes Dairy Technology. , 182-203 (2018).
  4. van Donkelaar, L. H. G., Mostert, J., Zisopoulos, F. K., Boom, R. M., van der Goot, A. J. The use of enzymes for beer brewing: Thermodynamic comparison on resource use. Energy. 115, 519-527 (2016).
  5. Rodriguez-Colinas, B., Fernandez-Arrojo, L., Ballesteros, A. O., Plou, F. J. Galactooligosaccharides formation during enzymatic hydrolysis of lactose: Towards a prebiotic-enriched milk. Food Chemistry. 145, 388-394 (2014).
  6. Lawrence, P. B., Price, J. L. How PEGylation influences protein conformational stability. Current Opinions in Chemical Biology. 34, 88-94 (2016).
  7. Bernal, C., Rodriguez, K., Martinez, R. Integrating enzyme immobilization and protein engineering: An alternative path for the development of novel and improved industrial biocatalysts. Biotechnology Advances. 36 (5), 1470-1480 (2018).
  8. Rigoldi, F., Donini, S., Redaelli, A., Parisini, E., Gautieri, A. Review: Engineering of thermostable enzymes for industrial applications. Applied Bioengeneering. 2 (1), 011501 (2018).
  9. Johnson, C. M. Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability. Archives of Biochemistry and Biophysics. 531 (1), 100-109 (2013).
  10. Chen, N. G., Gregory, K., Sun, Y., Golovlev, V. Transient model of thermal deactivation of enzymes. Biochimica et biophysica acta. 1814 (10), 1318-1324 (2011).
  11. Mason, M., et al. Calorimetric Methods for Measuring Stability and Reusability of Membrane Immobilized Enzymes. Jounal of Food Science. , (2017).
  12. Leksmono, C. S., et al. Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab. Journal of visualized experiments : Journal of Visual Experiments. (138), e54377 (2018).

Play Video

Cite This Article
Chan, W. K. D., Mason, M., Hansen, L. D., Kenealey, J. D. Measuring Enzymatic Stability by Isothermal Titration Calorimetry. J. Vis. Exp. (145), e59302, doi:10.3791/59302 (2019).

View Video