Termisk stabilitet av enzym aktivitet måles lett isotermiske titrering calorimetry (ITC). De fleste protein stabilitet analyser for tiden brukt mål protein utspiller seg, men gir ikke informasjon om enzymatisk aktivitet. ITC kan direkte fastsettelse av effekten av enzymet modifikasjoner på stabiliteten av enzym aktivitet.
Dette arbeidet demonstrerer en ny metode for å måle stabiliteten av enzym aktivitet av isotermiske titrering calorimetry (ITC). Topp varme hastigheten observert etter en enkelt injeksjon av substratløsningen i et enzym løsning er korrelert med enzym aktivitet. Flere injeksjoner av underlaget i samme enzym løsningen over tid viser tap av enzym aktivitet. Analysen er autonome, krever lite personell tid, og de fleste medier og enzymer.
Enzymer er proteiner i stand til å utløse en rekke organiske reaksjoner. De fleste enzymer funksjon i vandig løsning på nær nøytral pH dermed unngår bruk av sterke løsemidler. På grunn av deres høye selektivitet, katalysert enzymreaksjoner produserer færre (i noen tilfeller ingen biprodukter) biprodukt enn ikke-selektive katalysatorer som syrer og baser1. Dette er spesielt relevant i mat foredling der alle kjemiske reaksjoner må gjøres så det endelige produktet er trygg for menneskelig konsum. Foreløpig brukes enzymer til å produsere høy fruktose mais sirup2, ost3, øl4, laktose-fri melk5og andre viktige matvarer. Mens dette papiret fokuserer på enzymet bruk i næringsmiddelindustrien, er det mange andre bruksområder for enzymer inkludert i grønn kjemi og narkotika syntese.
Nytten av enzymer er begrenset av stabiliteten av enzym aktivitet, som avhenger av opprettholde tredimensjonale strukturen av enzymet. Enzym strukturen kan stabiliseres av modifikasjoner som PEGylation6, immobilisering på en solid støtte7, genetiske modifikasjoner8og formuleringer. Foreløpig enzym stabilitet måles vanligvis differensial skanning calorimetry (DSC) og sluttpunktet enzym aktivitet søk9. DSC måler temperaturen som utfolder seg et enzym; det høyere temperaturen, mer stabil struktur. Imidlertid forekommer tap av aktivitet ofte ved lavere temperatur enn nødvendig å utfolde det enzym eller domener i enzym10. Derfor er DSC ikke tilstrekkelig til å fastslå om en enzym modifikasjon øker stabiliteten på enzymaktiviteten. Endepunktet enzym analyser er vanligvis tidkrevende, krever flere eksempler, og ofte innebære en kombinert kolorimetrisk reaksjon som ikke gjelder for svært farget eller ugjennomsiktig løsninger eller suspensjoner.
Dette arbeidet viser en metode for direkte måling av stabiliteten av enzym aktivitet ved isotermiske titrering calorimetry (ITC). ITC måler varme eller opptatt i løpet av en reaksjon. Siden nesten alle reaksjoner produsere eller absorberer varme, kan ITC brukes til de fleste enzym-katalysert reaksjoner, inkludert reaksjoner som ikke har en kombinert reaksjon eller oppstår i ugjennomsiktig medier som melk. ITC har vært brukt i mange tiår for å måle kjemiske kinetic parametere for mange typer reaksjoner, men protokollen presenteres her fokuserer på bruk av ITC for å måle peak varme hastigheten enzym-katalysert reaksjoner og viser at enzym aktivitet er lineært korrelert med topp varme hastighet. ITC målinger av topp varme er hovedsakelig autonome og krever lite personell tid å setup og analysere.
En stor fordel for ITC enzym stabilitet analysen beskrevet her er automatisering. Når alle aktuelle buffere og løsninger er gjort, er oppsett-tid for hver analysen ca 15 min for personen gjør analysen. I kontrast, de konvensjonelle analyser for invertase og laktase aktivitet krever ca 2 timer med kontinuerlig involvering av personen gjør analysen og mange enzymatisk aktivitet analyser ta betydelig konstant. I en tidligere publikasjon, har vi vist hvordan data fra metoden ITC sammenlignet med en mer tradisjonell spect…
The authors have nothing to disclose.
Ingen
a-Lactose | Fisher Scientific | unknown (too old) | 500g |
Sodium Acetate, Anhydrous 99% min | Alfa Aesar | A13184-30 | 250g |
Lactase | MP Bio | 100780 | 5g |
Hydrocholric Acid Solution, 1N | Fisher Scientific | SA48-500 | 500mL |
Benchtop Meter- pH | VWR | 89231-622 | |
Ethanol 70% | Fisher Scientific | BP8231GAL | 1gallon |
Micro-90 | Fisher Scientific | NC024628 | 1L (cleaning solution) |