Summary
De thermische stabiliteit van enzymactiviteit is gemakkelijk gemeten door isothermische titratie calorimetrie (ITC). Meeste proteïne stabiliteit testen momenteel gebruikt maatregel eiwit ontvouwen, maar geven geen informatie over enzymatische activiteit. ITC kan directe bepaling van het effect van wijzigingen van het enzym op de stabiliteit van de enzymactiviteit.
Abstract
Dit werk toont een nieuwe methode voor het meten van de stabiliteit van de enzymactiviteit door isothermische titratie calorimetrie (ITC). De piek warmteverbruik waargenomen na een enkele injectie van het substraat oplossing in een oplossing van het enzym is gecorreleerd met enzymactiviteit. Meerdere injecties van het substraat in dezelfde enzym oplossing na verloop van tijd weergeven het verlies van de enzymactiviteit De bepaling is autonoom, waarvoor weinig personeel tijd, en is van toepassing op de meeste media en enzymen.
Introduction
Enzymen zijn eiwitten staat een breed scala aan organische reacties te katalyseren. De meeste enzymen functie in waterige oplossing bij in de buurt van neutrale pH dus het vermijden van het gebruik van agressieve oplosmiddelen. Vanwege hun hoge selectiviteit, enzym-gekatalyseerde reacties produceren minder (in sommige gevallen geen bijproducten) bijproducten dan niet-selectieve katalysatoren zoals zuren en basen1. Dit is vooral relevant in de voedingsmiddelen verwerkende waar alle chemische reacties moeten gebeuren zodat het uiteindelijke product veilig voor menselijke consumptie is. Op dit moment worden enzymen gebruikt voor het produceren van hoge fructose corn siroop2, kaas3, bier4, lactose-vrij melk5en andere belangrijke voedingsmiddelen. Hoewel dit document richt zich op enzym gebruik in de voedingsindustrie, zijn er vele andere toepassingen voor enzymen waaronder in groene chemie en drug synthese.
Het nut van enzymen wordt beperkt door de stabiliteit van de enzymactiviteit, die afhangt van het behoud van de driedimensionale structuur van het enzym. De structuur van het enzym kan worden gestabiliseerd door wijzigingen zoals PEGylation6, immobilisatie op een stevige steun7, genetische modificaties8en formuleringen. Momenteel, enzym stabiliteit wordt meestal gemeten door differentiële scanning calorimetrie (DSC) en eindpunt enzymactiviteit testen9. DSC meet de temperatuur waarbij een enzym ontvouwt; Hoe hoger de temperatuur, hoe meer stabiele de structuur. Verlies van activiteit treedt echter vaak op bij een lagere temperatuur dan nodig te ontvouwen de enzym of domeinen binnen de enzym-10. DSC is daarom niet voldoende om te bepalen of een wijziging van het enzym de stabiliteit van de enzymactiviteit verhoogt. Eindpunt enzym testen zijn meestal tijd intensieve, vereisen meerdere monsters, en vaak een gekoppelde colorimetrische reactie die geldt niet voor zeer gekleurd of ondoorzichtig oplossingen of schorsingen te betrekken.
Dit werk wordt een methode voor rechtstreekse meting van de stabiliteit van de enzymactiviteit gedemonstreerd door isothermische titratie calorimetrie (ITC). ITC meet de snelheid hitte vrijgegeven of geabsorbeerd in de loop van een reactie. Aangezien bijna alle reacties produceren of warmte absorberen, kan ITC worden gebruikt voor de meeste enzym-gekatalyseerde reacties, met inbegrip van de reacties die niet over een gekoppelde reactie of optreden in ondoorzichtige media zoals melk. ITC is gebruikt voor vele decennia voor het meten van chemische kinetische parameters voor vele soorten reacties, maar het protocol hier gepresenteerd richt zich op het gebruik van ITC voor het meten van het warmteverbruik van de piek van enzym-gekatalyseerde reacties en toont aan dat de enzymactiviteit lineair is gecorreleerd met de pieksnelheid voor warmte. ITC metingen van piek warmte tarieven zijn meestal autonome en weinig personeel tijd nodig om te installeren en te analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding van de monsters
-
1000 mL 0,1 M natrium acetaat buffer met een pH van 4.6
- 800 mL gedestilleerd water in een bekerglas van 1000 mL studeerde af te meten.
- Weeg 8,2 g watervrij natriumacetaat en toe te voegen aan het bekerglas.
- Plaats het bekerglas op een bord roer, breng een roer in het bekerglas, zet op het roer plaat en roer tot het volledig is opgelost.
- Wanneer de watervrije Natriumacetaat volledig is opgelost, wordt de pH van de oplossing met een gekalibreerde pH-meter.
- Voeg 1 M HCl of NaOH dienovereenkomstig te verkrijgen van de gewenste pH 4.6.
- Voeg gedistilleerd water totdat het totale volume 1000 mL is.
- Bewaren bij kamertemperatuur tot gebruik.
-
Enzym oplossing
- 10 mL van de cilinder van de oplossing binnen het bereik van de 10-30 mg/mL door eerste meten 8 mL van de 0,1 M natrium acetaat buffer pH 4.6 in een 15 mL studeerde enzym voor te bereiden.
- Bufferoplossing toevoegen in een conische tube van 15 mL met enzym en schud krachtig totdat het enzym heeft opgelost.
- Voeg meer bufferoplossing totdat het totale volume 10 mL is.
- De enzym-oplossing bij 4 ° C bewaren tot gebruik.
-
Substraat oplossing
- Ter voorbereiding van een substraat oplossing binnen het bereik van 300-600 mM, berekent het bedrag van substraat nodig om de gewenste concentratie in gram.
- Weeg af uit het substraat en breng in een bekerglas van 100 mL glas
- Meten van 20 mL van de bufferoplossing met behulp van een 25 mL studeerde aan de cilinder en vervolgens toevoegen aan het glas bekerglas.
- Plaats het bekerglas op een roer-plaat en breng een magnetische roer af in het bekerglas. Zet de warmte en de opzwepende snelheid dienovereenkomstig aan te passen.
- Toestaan om te blijven totdat het substraat is opgelost.
- Giet de substraat oplossing in een conische tube van 50 mL en Voeg 0,1 M natrium acetaat buffer pH 4.6 totdat het totale volume 45 mL is. Meng door schudden.
- Het substraat oplossing bij kamertemperatuur bewaren tot gebruik.
2. uitvoeren van het experiment
- Voorbereiding van het ITC-instrument
- Zorg ervoor dat de referentie cel is geladen met 350 µL van gedistilleerd water. Voordat het enzym in de steekproef cel laden, controleert u of dat de steekproef-cel is schoongemaakt.
- Schoonmaak protocol-Fill de laden spuit met 500 µL van 2% reinigingsoplossing (Tabel of Materials), schuif voorzichtig de naald in de monster-cel, vult u de cel en Verwijder langzaam de vloeistof met behulp van de dezelfde spuit. Het afvoeren van de vloeistof in een bekerglas. Herhaal deze stap tweemaal met 2% reinigingsoplossing (Tabel of Materials), driemaal met 70% ethanol en vervolgens tien keer wassen met gedestilleerd water.
- Vul de spuit laden met 450 µL van enzym oplossing, zorgvuldig de naald helemaal naar de onderkant van het monster cel invoegen en druk op de zuiger naar de 100 µL regel langzaam om te voorkomen dat de vorming van luchtbellen.
- Spoel de injectiespuit 50 µL titratie met gedestilleerd water driemaal door het plaatsen van de naald-tip in water langzaam inneemt van het water in de spuit vervolgens, verstrekking van het water in een afvalcontainer.
- Verwijder Residuele water door te spoelen met substraat oplossing driemaal.
- Vul de spuit titratie met substraat oplossing door te tekenen van de oplossing tot de spuit volledig zonder eventuele luchtbellen is.
- Met de spuit nog steeds in het substraat oplossing, verwijder de zuiger en toestaan van ongeveer 2 µL van lucht voor het invoeren van de top van de spuit en opnieuw de plunjer.
- Verwijder het handvat van de buret van het ITC, plaatst u de spuit in de buret greep en schroef tot strak.
- Het puntje van de roerder met een pluisvrije weefsel, veeg dan zorgvuldig de buret greep plaats in de ITC-instrument en het vergrendelen.
3. het opzetten van ITCrun
- Open ITCrun op de computer en klikt u op instellen.
- Klik onder roeren tarief en stel tot 350 tpm. Controleer de grootte van de spuit (µL) en controleer dat het bedraagt 50 µL.
- De temperatuur en druk op Update. Het wordt aanbevolen dat deze stap worden uitgevoerd ten minste 1 uur vóór de voorbereiding van het ITC. Dit laat voldoende tijd voor het instrument opwarmen of afkoelen zo nodig.
- Voor de instellingen van het experiment, selecteert u incrementele titratie.
- Klik op Invoegen om de opstelling van de injecties. Aanpassen van de interval van de injectie tot 5.400 s, geïnjecteerde volume (µL) tot 4 en aantal injecties tot en met 4. Druk op OK om de instellingen te bevestigen.
- Selecteer in het vak van de evenwichtsinstelling, Auto-equilibreer en Large verwacht heats. (Als de verwachte voorrondes klein zijn, een kleine kunt selecteren onder verwachte heats; maar dit zal de verhoging van de equilibratietijd.)
- De eerste basislijn ingesteld op 300 s.
- Om te beginnen met de uitvoering, klik het begin symbool naast roeren tarief en klikt u op Start naast de moersleutel symbool.
- Sla het bestand op en laat het instrument uit te voeren.
4. het analyseren van gegevens
- Open het bestand in NanoAnalyze. Klik op gegevens en selecteert u gegevenskolommen.
- Selecteer alle gegevens, kopieer en plak de gegevens in Microsoft Excel.
- Nul basislijn aanpassen door de waarde bij 300 vereist s te maken nul. Deze correctie toepassen op de hele kolom met warmte tarief waarden.
- Vindt u de waarde van de minimum- of maximumwaarde van het warmteverbruik voor elke injectie met behulp van de vergelijking: =MIN(cell:cell) of MAX(cell:cell). Elk gegevenspunt vertegenwoordigt de piek enzymatische activiteit van het enzym bij elke injectie.
- Plot de grafieken van de MIN of MAX waarden tegen de tijd waarop de waarde heeft plaatsgevonden tijdens de titratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De representatieve resultaten in Figuur 1 en Figuur 5 worden gegevens uit twee enzymen, lactase en invertase verschijnen. Lactase en invertase katalyseren de hydrolyse van een disaccharide in twee monosacchariden, endothermically en exotherm, respectievelijk. Beide enzymatische reacties werden uitgevoerd bij concentraties die uitgesloten van de verzadiging van het enzym.
De lactase gegevens aantonen hoe ITC gegevens kunnen worden gebruikt om te schatten enzym stabiliteit. Vier opeenvolgende 4 µL injecties van 600 mM lactose (Figuur 1) waren getitreerd in 20 mg/mL lactase. Een interval van 5.400 s tussen elke injectie werd toegepast en hierdoor voldoende tijd om terug te keren naar de eerste basislijn vóór elke injectie. Het protocol die hierboven beschreven werd uitgevoerd bij 25 ° C, 35 ° C, 45 ° C en 55 ° C. Bovendien was 600 mM lactose getitreerd in 100 mM natrium acetaat buffer alleen bij 55 ° C als een besturingselement voor de voorronde van het mengen. Voor elke injectie van enzym in substraat, er is een eerste exothermische warmte van het mengen, en vervolgens de lactase gekatalyseerd endotherme hydrolyse van lactose kan gebeuren zolang de reactie is voltooid en het warmteverbruik keert terug naar de basislijn. De injectie van lactose in de lactase-oplossing wordt vervolgens meer driemaal herhaald met de piekhoogte van de Endotherme reactie van elke latere injectie een beetje minder dan de vorige injectie vanwege de daling van enzymatische activiteit. De onbewerkte gegevens kunnen vervolgens worden geconverteerd zodat de warmte van de piek ten opzichte van de tijd (figuur 2A-D). De piekhoogte voor elke injectie kan vervolgens worden pasvorm aan een lineaire regressie en de helling aangeeft enzym stabiliteit bij de gekozen temperatuur. De meer negatieve de helling, de minder stabiel het enzym. Zoals verwacht, afneemt enzym stabiliteit met toenemende temperatuur (figuur 2E).
Elke injectie van lactose beschreven in Figuur 1 resultaten in verdunning van lactase. Om aan te tonen dat deze verdunning niet de oorzaak van de afname van de enzymatische activiteit is, werd de ITC lactase activiteit assay ook gedaan bij 25 ° C, de lactase concentratie bij de eerste injectie en bij de laatste injectie (Figuur 3). Deze verdunning resulteert in een afname van 8% van de enzymactiviteit, terwijl de vierde injectie in de analyse een 73% afname van de activiteit toont. De verdunning van de lactase tijdens de vier-injectie experiment had dus een relatief gering effect (dat wil zeggen, 11%) op enzymactiviteit. Het werkelijke verlies van activiteit was daarom 73-8 = 65%.
Zoals vermeld is de inleiding een van de voordelen van het gebruik van ITC dat deze reacties kunnen worden gedaan in ondoorzichtige media, zoals melk. Om aan te tonen deze functionaliteit van ITC, werd melk geïnjecteerd rechtstreeks in lactase (Figuur 4). Doordat de pH van de melk is niet gekoppeld aan de natrium acetaat buffer, is er een grote exotherme warmte van het mengen direct na de injectie. De exotherme hitte van mengen piek wordt gezien in het besturingselement dat lactase (Figuur 4, grijze lijn mist) en in de twee injecties met melk (Figuur 4, zwart en stippellijnen) na de voorronde van het mengen van de piek. De Endotherme reactie die aangeeft lactase-activiteit optreedt. Melk bevat een complex mengsel van eiwitten, vitaminen, mineralen en lactose. Vanwege de complexiteit van de melk is het waarschijnlijk dat andere reacties in de loop van onze reactie optreden. Om aan te tonen dat de endotherme piek te wijten aan lactase-activiteit is, werd de melk verrijkt met 146 mM lactose. In de reactie met de lactose spiked melk (Figuur 4, gestippelde lijn) zijn de endotherme piek en oppervlak onder de kromme groter dan in de melk alleen (Figuur 4, zwarte lijn), die aangeeft dat de endotherme piek inderdaad te wijten aan de lactase-activiteit is. De verschuiving van de basislijn geeft aan dat een langzame reactie blijft na de reactie van de lactose is voltooid.
Om aan te tonen hoe deze test kan worden gebruikt voor het vergelijken van de stabiliteit van enzymatische activiteit van twee verschillende enzympreparaten, de stabiliteit van gratis invertase en invertase geïmmobiliseerd op een nylon-6 nanofiber-membraan worden vergeleken in Figuur 5 bij 35 ° C11 . Zoals in de lactase assay, vier 4 µL injecties van sacharose opeenvolgend aangebracht en de maximale warmteverbruik bepaald uit de piekhoogte voor elke injectie. Zoals aangegeven in Figuur 6, verlagen de piekhoogten lineair met de tijd die dalende enzymactiviteit aangeeft.
Figuur 1 : ITC gegevens sporen van lactase-activiteit. Elke trace toont vier opeenvolgende 4 µL injecties van 600 mM lactose in een oplossing van de lactase in 4.6 pH buffer. De sporen werden gedaan bij 55 ° C (zwart), 45 ° C (donker grijs), 35 ° C (stippellijn), 25 ° C (lichtgrijs) en een enzym oncontroleerbaar (gestippeld) bij 55 ° C. De rechte lijnen vertegenwoordigen de pasvorm tot het minimum van de endotherme piek na elke injectie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Stabiliteit van enzymactiviteit op basis van de mate van verandering in piek activiteit. De piek enzymatische activiteit voor elk van de vier injecties ten opzichte van de tijd (s) bij 25 ° C (A), 35 ° C (B), 45 ° C (C) en 55 ° C (D). De lineaire fit van de gegevens wordt vertegenwoordigd door de ononderbroken lijn. De hellingen van de ingerichte lijnen in delen A-D worden uitgezet tegen temperatuur in E. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Het effect van enzym verdunning op piekhoogte bij 25 ° C. Lactase-activiteit wordt gemeten bij het enzym concentratie op de eerste en vierde injecties van 20 mg/mL (zwart) en 18.62 mg/mL (grijs), respectievelijk. De inzet is een ingezoomd met het oog op de enzymactiviteit van de piek. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Meten van lactase-activiteit in melk. ITC trace van een injectie van BYU creamery fat free melk in buffer (grijs), melk in 20 mg/mL lactase (zwart) en melk verrijkt met 5% extra lactose in 20 mg/mL (gestippeld). De y-as is discontinue om te laten zien van de reactie van de endotherme enzym en de exotherme hitte van mengen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Een representatief voorbeeld van hoe de ITC enzym stabiliteit test bij 35 ° C kan worden gebruikt om te vergelijken twee verschillende bereidingen van invertase. De activiteiten van geïmmobiliseerd op een nanofiber membraan en gratis enzym invertase worden weergegeven door de gestippelde en donker grijze lijnen, respectievelijk. De zwarte lijn is het besturingselement met geen invertase tonen alleen de hitte van het mengen op de juiste schaal. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 : De lineaire relatie tussen piek exothermische warmte tarief en invertase concentratie na een injectie 4 µL van sacharose 600 mM. Deze standaard curve kan worden gebruikt om te bepalen van de concentratie van invertase in een onbekend monster. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een groot voordeel van de ITC enzym stabiliteit test hier beschreven is automatisering. Zodra alle passende buffers en oplossingen zijn gemaakt, is de tijd van de set-up voor elke assay ongeveer 15 min. voor de persoon die de test doet. In tegenstelling, de conventionele testen voor invertase en lactase-activiteit vereisen ongeveer 2 h met voortdurende betrokkenheid van de persoon die de test doet en veel enzymatische activiteit testen nemen aanzienlijk meer manuren. In een eerdere publicatie, hebben wij aangetoond hoe gegevens uit de ITC-methode zich verhoudt tot een meer traditionele methode van de spectrophotrometric voor invertase activiteit11.
Een ander voordeel van de ITC-test is de toepasbaarheid op bijna elk enzym12. Dus, het testen van de stabiliteit van verschillende enzymen onder een bepaalde set voorwaarden vereist geen opzetten van verscheidene verschillende testen. De ITC-bepaling is bovendien nuttig voor de bepaling van de stabiliteit van de activiteit van een nieuw enzym of van een enzym dat beschikt niet over een geschikte colorimetrische bepaling. De ITC-bepaling kan ook worden gedaan in ondoorzichtige media die een groot voordeel in voedingswetenschappen is. Aangezien de meeste eerdere analyses van de enzymactiviteit spectrofotometrie, fluorescentie of luminescentie gebruiken voor het meten van de enzymactiviteit, zijn ze niet compatibel met ondoorzichtig of zeer gekleurde media. Hoewel dit werk alleen het effect van temperatuur op de stabiliteit van de enzymactiviteit toont, is de ITC-methode toepasbaar op de meeste andere omstandigheden die invloed op enzym stabiliteit (bijvoorbeeld pH, zouten, niet-waterige oplosmiddelen en denatureren agenten).
Net als bij alle ITC experimenten, de buffer die wordt gebruikt voor het enzym en substraat oplossing moet overeenkomen met zo nauwkeurig mogelijk. Mismatch van de concentratie of de pH kan leiden tot grote warmte-effecten die verder gaan dan het dynamisch bereik van de calorimeter. Gebruik van de dezelfde voorraad buffer te bereiden van zowel het enzym en het substraat oplossingen is meestal voldoende. Maar zo niet, de oplossingen kunnen gepaard gaan met het dialyzing van beide oplossingen tegen dezelfde bufferoplossing.
Een verdere voorwaarde is dat het enzym mag geen substraat verzadigd, in welk geval de piekhoogte wordt onafhankelijk van substraat concentratie. Ook de tijd voor de reactie op het gaan naar voltooiing of naar evenwicht tussen injecties kan worden overdreven en/of het signaal kan groter zijn dan het dynamisch bereik van de calorimeter. De concentratie van het substraat moet echter groot genoeg om een sterke warmte-signaal. Het enzym substraat verzadigd, de concentratie van het substraat kan worden verlaagd, of is de concentratie van enzym verhoogd. Bij het laden van de calorimeter cel en spuit, een moet ervoor zorgen dat geen luchtbellen aanwezig. Als een zeepbel wordt geïnjecteerd of uit de cel in de loop van een experiment losgelaten, zal veroorzaken een abnormale gebeurtenis in de warmte tarief signaal.
De ITC-methode is afhankelijk van de enthalpie verandering van de gekatalyseerde reactie en van het tarief en het bedrag van de reactie. Als de enthalpie verandering voor de reactie te klein is, het substraat ook slecht oplosbaar is of het enzym beschikt niet over voldoende activiteit, is mogelijk het warmteverbruik te klein om het verkrijgen van voldoende signaal. Bovendien, als het enzym wordt geremd door de lage concentraties van de producten, zal de afname van de enzymatische activiteit waargenomen in de loop van het experiment worden veroorzaakt door remming van het product maar ook door verlies van activiteit na verloop van tijd. Bijvoorbeeld in de lactase titratie wordt de uiteindelijke concentratie van 54 mM glucose en galactose een 27% daling in de piekhoogte van de enzymactiviteit bij 55° C (gegevens niet worden weergegeven). Dit is aanzienlijk minder dan de afname van 78% van de piekhoogte van injectie 1 voor injectie 4 in afbeelding 1. Echter, dit kan worden gecorrigeerd door het meten van de enzymactiviteit in aanwezigheid van de product-concentratie bereikt in de loop van de test. Verder, titrating van het enzym met minder substraat kan verminderen de hoeveelheid product remming.
Andere beperkingen kunnen optreden als gevolg van het enzym. Met elke injectie zullen het enzym bijvoorbeeld de verdunde. Omdat deze ITC een reactievat overloop gebruikt, wordt een volume van de oplossing gelijk aan de grootte van de injectie in de loop van het experiment met elke injectie verwijderd. Dus, een kleine hoeveelheid enzym wordt verwijderd, en de producten van de reactie toenemen met elke injectie. De gevolgen van de verdunnings- en de hoeveelheid enzym verwijderd kunnen kleine worden gehouden als de grootte van de injectie is klein gehouden, en daarom een grote concentratie van substraat vaak noodzakelijk is. Omdat de verhouding van de geïnjecteerde volume aan reactie vaartuig volume kleiner in ITCs met grotere reactie schepen is het verwateringseffect kleiner dan in het lage volume ITC gebruikt in dit werk. Bovendien vereist elke reactie voor vele enzymen microgram lage milligram hoeveelheden, zodat hebt u een enzym dat duur of moeilijk om te zuiveren, dit het gebruik van deze test verbieden kon.
De meeste van de problemen die zich tijdens deze test voordoen kunnen zijn gerelateerd aan goed onderhoud en reiniging van het reactievat ITC. Als het ITC een stabiele basislijn niet bereiken, is dit vaak te wijten aan het reactievat wordt niet voldoende schoon. Het is raadzaam een sterke afwasmiddel te gebruiken na elk experiment bij het gebruik van eiwitten in de ITC, omdat eiwitten kunnen aan het reactievat vasthouden en met de warmte Rudern interfereren. Voor een diepere schoon, een oplossing van 50% mierenzuur geïncubeerd bij 55 ° C gedurende maximaal 12 uur gevolgd door reiniging met reinigingsoplossing (Tabel of Materials), ethanol en water verwijdert de meeste verontreinigingen.
Ten slotte, omdat de ITC ongeveer 45 min duurt naar equilibreer na het laden van oplossingen, de activiteit van relatief unstable enzymen of in marginale omstandigheden niet mogelijk. Als het enzym wordt geïnactiveerd tijdens deze tijd geen signaal, zal beschikbaar zijn of het verval mogelijk te snel na de eerste injectie om stabiliteitsgegevens te verkrijgen.
Omdat de ITC-test direct enzymactiviteit meet, kan zij worden uitgebreid tot een aantal andere toepassingen. Deze test kan bijvoorbeeld gebeuren met toenemende concentraties van een inhibitor van de omwenteling om dat de remming constante, Ki, gebaseerd op de afname van de enzymactiviteit met toenemende concentratie van de Inhibitor van de omwenteling. Zoals afgebeeld in Figuur 5, kan dit protocol worden aangepast voor geïmmobiliseerdet enzymen op een stevige drager. Een nanofiber membraan werd gebruikt in dit werk, maar andere solide ondersteunt kunnen ook worden gebruikt als een methode voor het invoegen en verwijderen door de kleine toegang buis kan worden ontwikkeld. De ITC-methode kan ook worden uitgebreid tot enzymen die chemisch of genetisch worden gewijzigd ter verbetering van de thermische stabiliteit of om te bepalen van de hoeveelheid actief enzym in een onbekend monster (dat wil zeggen, Figuur 6 toont de lineaire relatie tussen warmte tarief piek hoogte en enzym concentratie).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen
Acknowledgments
Geen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| a-Lactose | Fisher Scientific | unknown (too old) | 500g |
| Sodium Acetate, Anhydrous 99% min | Alfa Aesar | A13184-30 | 250g |
| Lactase | MP Bio | 100780 | 5g |
| Hydrocholric Acid Solution, 1N | Fisher Scientific | SA48-500 | 500mL |
| Benchtop Meter- pH | VWR | 89231-622 | |
| Ethanol 70% | Fisher Scientific | BP8231GAL | 1gallon |
| Micro-90 | Fisher Scientific | NC024628 | 1L (cleaning solution) |
References
- Anastas, P., Eghbali, N. Green chemistry: principles and practice. Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).
- Jin, L. Q., et al. Immobilization of Recombinant Glucose Isomerase for Efficient Production of High Fructose Corn Syrup. Applied Biochemistry Biotechnoiogy. 183 (1), 293-306 (2017).
- Budak, ŞÖ, Koçak, C., Bron, P. A., de Vries, R. P. Microbial Cultures and Enzymes Dairy Technology. , 182-203 (2018).
- van Donkelaar, L. H. G., Mostert, J., Zisopoulos, F. K., Boom, R. M., van der Goot, A. J. The use of enzymes for beer brewing: Thermodynamic comparison on resource use. Energy. 115, 519-527 (2016).
- Rodriguez-Colinas, B., Fernandez-Arrojo, L., Ballesteros, A. O., Plou, F. J. Galactooligosaccharides formation during enzymatic hydrolysis of lactose: Towards a prebiotic-enriched milk. Food Chemistry. 145, 388-394 (2014).
- Lawrence, P. B., Price, J. L. How PEGylation influences protein conformational stability. Current Opinions in Chemical Biology. 34, 88-94 (2016).
- Bernal, C., Rodriguez, K., Martinez, R. Integrating enzyme immobilization and protein engineering: An alternative path for the development of novel and improved industrial biocatalysts. Biotechnology Advances. 36 (5), 1470-1480 (2018).
- Rigoldi, F., Donini, S., Redaelli, A., Parisini, E., Gautieri, A. Review: Engineering of thermostable enzymes for industrial applications. Applied Bioengeneering. 2 (1), 011501 (2018).
- Johnson, C. M. Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability. Archives of Biochemistry and Biophysics. 531 (1), 100-109 (2013).
- Chen, N. G., Gregory, K., Sun, Y., Golovlev, V. Transient model of thermal deactivation of enzymes. Biochimica et biophysica acta. 1814 (10), 1318-1324 (2011).
- Mason, M., et al. Calorimetric Methods for Measuring Stability and Reusability of Membrane Immobilized Enzymes. Jounal of Food Science. , (2017).
- Leksmono, C. S., et al. Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab. Journal of visualized experiments : Journal of Visual Experiments. (138), e54377 (2018).
