Summary
Термостабильность активность фермента измеряется легко изотермический титрования калориметрии (ЦМТ). Большинство анализов стабильности белка в настоящее время используется мера белка разворачивается, но не предоставляют информацию о ферментативной активности. ЦМТ позволяет прямое определение влияния фермента изменений на стабильность ферментативной активности.
Abstract
Эта работа демонстрирует новый метод измерения стабильности активность фермента, изотермические титрования калориметрии (ЦМТ). Пик жары скорость наблюдается после однократного введения раствора субстрата в решение фермента связан с ферментативной активности. Многократные инъекции субстрата в то же решение фермента с течением времени показывают потери активности ферментов. Автономное, требует очень мало времени, персонала и применима к большинству средств массовой информации и ферментов.
Introduction
Ферменты являются белки, способный катализировать широкий спектр органических реакций. Большинство ферментов функция в водном растворе в рядом с нейтральным pH, таким образом избегая использования суровых растворителей. Из-за их высокой селективностью, фермент катализатором реакции производят меньше (в некоторых случаях не субпродуктов) побочные продукты чем неизбирательной катализаторы например1кислот и щелочей. Это особенно актуально в производстве продовольствия, где все химические реакции должно быть сделано, чтобы конечный продукт является безопасным для потребления человеком. В настоящее время ферменты используются для производства Высокофруктозный кукурузный сироп2, сыр3, пиво4, лактозы молоко5и других важных пищевых продуктов. Хотя этот документ посвящен фермента использования в пищевой промышленности, есть много других применений для ферментов, в том числе в зеленой химии и наркотиков синтеза.
Полезность ферментов ограничен стабильности активность фермента, который зависит от поддержания трехмерной структуры фермента. Структура фермента может стабилизировать посредством модификации, такие как ПЭГилирование6, иммобилизации на прочную поддержку7, генетические модификации8и формулировок. В настоящее время фермент стабильность измеряется обычно дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) и активность фермента конечной assays9. DSC измеряет температуру, при которой разворачивается фермент; чем выше температура, тем стабильнее структуры. Однако часто происходит потеря активности при более низкой температуре, чем требуется разворачиваться фермента или домены в пределах фермента10. Таким образом DSC не достаточно, чтобы определить ли модификация фермент увеличивает стабильность ферментативной активности. Assays энзима конечной точки, обычно время интенсивного, требуют несколько образцов и часто включают спаренных колориметрические реакции, которая не применима к высоко цветные или непрозрачные решения или суспензий.
Эта работа демонстрирует метод прямого измерения устойчивости активность фермента, изотермические титрования калориметрии (ЦМТ). ЦМТ измеряет скорость тепла освобождены или впитывается в ходе реакции. Поскольку почти все реакции производят или поглощать тепло, МТЦ может использоваться для большинства катализируемой ферментных реакций, включая реакции, которые не имеют спаренные реакции или происходят в непрозрачных носителей, таких как молоко. ЦМТ был использован на протяжении многих десятилетий для измерения химического кинетические параметры для многих видов реакций, но протокол, представленные здесь сосредоточена на использовании ЦМТ для измерения расхода тепла пик катализируемой ферментных реакций и демонстрирует, что активность фермента линейно коррелирует с расхода тепла пик. ЦМТ измерения пиковых ставок тепла в основном автономных и требуют очень мало времени персонала для установки и анализировать.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка образцов
-
1000 мл 0,1 М натрия ацетата буфера при pH 4,6
- Мера 800 мл дистиллированной воды в стакан 1000 мл закончил.
- Весят 8.2 г безводного натрия ацетата и добавить его в стакан.
- Поместите стакан на тарелку, перемешать, поместить перемешать стержня в стакан, включите пластину перемешать и размешайте до полного растворения.
- Когда натрия безводный ацетат полностью не растворится, измеряют рН раствора с калиброванной рН метр.
- Добавьте 1 М HCl или NaOH соответственно для получения желаемого pH 4,6.
- Долейте дестилированную воду до тех пор, пока общий объем составляет 1000 мл.
- Хранить при комнатной температуре до использования.
-
Фермент решение
- Подготовка 10 мл раствора в диапазоне 10-30 мг/мл, первые измерения 8 мл 0,1 М натрия ацетата буфер рН 4,6 в 15 мл окончил цилиндра фермента.
- Добавить буферный раствор в 15 мл Конические трубки с ферментом и встряхнуть, пока не растворится фермента.
- Добавьте больше буферного раствора, до тех пор, пока общий объем составляет 10 мл.
- Храните фермента раствор при температуре 4 ° C до использования.
-
Раствора субстрата
- Для приготовления раствора субстрата в диапазоне 300-600 мм, подсчитать количество в граммах необходимо сделать желаемой концентрации субстрата.
- Весят из субстрата и поместить в стеклянный стакан 100 мл
- Мера 20 мл буферного раствора, с использованием 25 мл закончил цилиндров и затем добавить его в стеклянный стакан.
- Поместите стакан на тарелку, перемешать и место стержень магнитной размешать в стакане. Включите тепла и соответствующим образом скорректировать скорость перемешивания.
- Позвольте, перемешивание продолжать пока субстрат не растворится.
- Налить раствора субстрата в 50 мл Конические трубки и добавить 0,1 М натрия ацетата буфер рН 4,6 до тех пор, пока общий объем составляет 45 мл. Смешайте встряхивания.
- Храните раствора субстрата при комнатной температуре до использования.
2. Выполнение эксперимента
- Подготовка документа МТЦ
- Убедитесь, что загружен ссылочной ячейки с 350 мкл дистиллированной воды. Перед загрузкой фермента в ячейки выборки, убедитесь, что ячейки выборки был очищен.
- Очистка протокол заполните шприц загрузки с 500 мкл 2% раствор для очистки (Таблица материалов), осторожно вставить иглу в ячейки выборки, заполнить ячейки и медленно удалить жидкость, используя же шприц. Утилизируйте жидкость в стакан. Повторите этот шаг два раза с 2% раствор для очистки (Таблица материалов), три раза с 70% этанола, а затем вымыть десять раз дистиллированной водой.
- Заполните шприц загрузки с 450 мкл раствора фермента, тщательно вставить иглу вплоть до нижней части ячейки выборки и нажмите поршень вниз линии 100 мкл медленно, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха.
- Вымойте шприц 50 мкл титрования с дистиллированной водой в три раза, поместив кончик иглы в воду медленно принимает воду в шприц, а затем дозирования воды в контейнер для отходов.
- Удалите остатки воды, полоскать с раствора субстрата в три раза.
- Заполните шприц титрование раствора субстрата, нарисовав решение до шприца полностью без каких-либо воздушных пузырьков.
- С шприца до сих пор в раствора субстрата удалите поршень и позволяют примерно 2 мкл воздуха войти в верхней части шприц и вставьте поршень.
- Сними ручку Бурети ЦМТ, поместите шприц внутри ручки бюретки и завинтить до жесткой.
- Протрите кончик мешалка с безворсовой ткани, а затем тщательно установите ручку Бюретки в ЦМТ инструмент и зафиксируйте ее на месте.
3. Настройка ITCrun
- На компьютере откройте ITCrun и нажмите кнопку Настройка.
- Нажмите кнопку перемешивания скорость и установите 350 об/мин. Проверьте размер шприца (мкл) и убедитесь, что он находится в 50 мкл.
- Установите температуру и нажмите Обновить. Рекомендуется выполнять этот шаг по крайней мере 1 час перед подготовкой ЦМТ. Это позволяет достаточно времени для инструмента для нагрева или охлаждения при необходимости.
- Для настройки эксперимента выберите Инкрементное титрования.
- Нажмите кнопку Вставить для установки инъекции. Настройка интервала впрыска до 5400 s, объем впрыска (мкл) 4 и количество инъекций до 4. Нажмите OK для подтверждения настроек.
- В поле уравновешиваниявыберите Auto сбалансировать и большой ожидается нагревается. (Если ожидаемый нагревает малы, можно выбрать небольшой под ожидаемое нагревается; однако, это увеличит время уравновешивания).
- Установите первоначальный базовый 300 s.
- Для начала выполнения, нажмите начать символ рядом с скорость перемешивания и затем нажмите кнопку начать находящийся рядом с символом гаечного ключа.
- Сохраните файл и разрешить инструмент для запуска.
4. анализ данных
- Откройте файл в NanoAnalyze. Щелкните данные и выберите столбцы данных.
- Выберите все данные, копировать и затем вставить данные в Microsoft Excel.
- Регулировка нулевого базового, добавив значение требуется 300 s, чтобы сделать его нулевой. Примените это исправление на весь столбец значения интенсивности тепла.
- Найти минимальное или максимальное значение расхода тепла для каждой инъекции, используя уравнение: =MIN(cell:cell) или MAX(cell:cell). Каждая точка данных представляет собой пик Ферментативная активность фермента в каждой инъекции.
- Печать диаграммы значений MIN или MAX против времени, в которой значение произошло во время титров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представитель результаты на рисунке 1 и на рисунке 5 показывают данные из двух ферментов, лактозу и инвертазы. Лактаза и инвертазы катализируют гидролиз дисахарида в два моносахариды, endothermically и exothermically, соответственно. Обе ферментативных реакций были запущены в концентрациях, которые препятствуют насыщенность фермента.
Лактаза данные показывают, как ЦМТ данные могут использоваться для оценки стабильности фермента. Четыре последовательных 4 инъекции мкл лактозы 600 мм (рис. 1) были титруют в 20 мг/мл лактазы. Интервал 5,400 применялась s между каждой инъекции, и это позволяет достаточно времени, чтобы вернуться к первоначальной базовой перед каждой инъекцией. Протокол, в описанный выше была исполнена на 25 ° C, 35 ° C, + 45 ° C и 55 ° C. Кроме того как элемент управления для тепла смешивания в 100 мм натрия ацетата буфер только при температуре 55 ° C был титруют лактозы 600 мм. Для каждой инъекции фермента в субстрат есть первоначальный экзотермические тепла смешивания, и впоследствии лактазы катализировано эндотермических гидролиз лактозы происходит до завершения реакции и расхода тепла возвращается к базовой линии. Инъекции лактозы в раствор лактазы затем повторяется еще три раза с пик высотой Эндотермические реакции от каждой последующей инъекции немного меньше, чем предыдущие впрыска из-за снижение ферментативной активности. Необработанные данные затем могут быть преобразованы Показать Пик жары относительно времени (рисунок 2A-D). Высота пика для каждой инъекции могут затем быть подходят для линейной регрессии и склона указывает фермента стабильность при выбранной температуре. Более негативный наклон, менее стабильной фермента. Как и ожидалось, фермент стабильности уменьшается с ростом температуры (рис. 2е).
Каждой инъекции лактозы, описанных в Рисунок 1 результаты в разведении лактазы. Чтобы продемонстрировать, что это раствора не является причиной снижения ферментативной активности, пробирного активности лактазы ЦМТ было также сделано при 25 ° C, концентрация лактазы в первой инъекции и в последней инъекции (рис. 3). Этот разбавления приводит 8% снижение активности фермента, тогда как четвертый инъекций в assay показывает 73% снижение активности. Разбавление лактазы в ходе эксперимента 4 инъекции таким образом была сравнительно небольшой эффект (то есть, 11%) на активность фермента. Фактические потери активности был поэтому 73-8 = 65%.
Как упоминалось в введение, одним из преимуществ использования ЦМТ является, что эти реакции может быть сделано в непрозрачных носителей, таких как молоко. Для демонстрации этой способности МТЦ, молоко непосредственно вводили лактаза (рис. 4). Потому что рН молока не соответствует в буфер ацетат натрия, существует большой экзотермические тепла смешивания сразу же после инъекции. Экзотермические тепла смешивания пик рассматривается в элементе управления, который не хватает лактаза (рис. 4, серая линия) и в двух инъекций с молоком (рис. 4, черный и пунктирные линии) после тепла смешивания пик. Происходит эндотермическая реакция, указанием активности лактазы. Молоко содержит сложную смесь протеинов, витаминов, минералов и лактозы. Из-за сложности молока вполне вероятно, что другие реакции происходят в ходе нашей реакции. Чтобы продемонстрировать, что Эндотермический пик из-за активности лактазы, молоко был шипами лактозы 146 мм. В реакции с шипами лактоза молока (рис. 4, пунктирная линия) больше, чем в молоке одиночку (рис. 4, черная линия), указав, что Эндотермический пик является действительно из-за активности лактазы Эндотермический пик и площадь под кривой. Смещение базовой линии указывает, что медленная реакция продолжается после завершения реакции лактозы.
Чтобы продемонстрировать, каким образом этот assay может использоваться для сравнения стабильность Ферментативная активность двух различных ферментных препаратов, стабильность бесплатные инвертаза и инвертаза, иммобилизованных на мембраны нейлона-6 нановолокно сравниваются на рисунке 5 на 35 ° C11 . Как и пробирного лактазы последовательно были сделаны инъекции 4 мкл сахарозы и максимальная ставка определена с высоты пика для каждой инъекции. Как показано на рисунке 6, пика высотой уменьшается линейно с времени с указанием снижение активности фермента.
Рисунок 1 : ЦМТ данных следов активности лактазы. Каждый след показывает четыре последовательных 4 инъекции мкл 600 мм лактозы в раствор лактазы в буфер рН 4,6. Следы были сделаны при температуре 55 ° C (черный), 45 ° C (темно-серый), 35 ° C (барашек), 25 ° C (светло-серый) и нет фермента элемент (пунктир) при температуре 55 ° C. Прямые линии представляют подходят к минимуму Эндотермический пик после каждой инъекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Стабильность ферментативной активности на основе скорости изменения в пик активности. Ферментативная активность пик для каждого из четырех инъекции по отношению к времени (s) при 25 ° C (A), 35 ° C (B), 45 ° C (C) и 55 ° C (D). Линейной аппроксимации данных представлен сплошной линией. Склоны оборудованы линии в частях A-D заговор против температуры в E. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Эффект фермента разрежения на пик высотой в 25 ° C. Активность лактазы измеряется в концентрации фермента в первой и четвертой инъекции 20 мг/мл (черный) и 18,62 мг/мл (серый), соответственно. Врезные является увеличено с учетом пиковой активности фермента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Измерение активности лактазы в молоке. ЦМТ след инъекции BYU Кримери жира бесплатно в буфер (серый), молока в 20 мг/мл лактаза (черный), и молока шипами с 5% дополнительных лактозы в 20 мг/мл (пунктиром). Ось y разрывными Показать эндотермические фермента реакции и экзотермические тепла смешивания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Представитель пример как assay стабильности ферментных ЦМТ на 35 ° C могут использоваться для сравнения двух различных препаратов инвертазы. Деятельность иммобилизованных на нановолокно мембраны и бесплатные фермента инвертазы показаны пунктирной и темно серый линиями, соответственно. Черная линия является элементом управления с не инвертаза, показаны только тепло смешивания в соответствующих масштабах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : Линейной зависимости между пик экзотермические тепла скорость и инвертазы концентрации после 4 мкл инъекций 600 мм сахарозы. Эта стандартная кривая может использоваться для определения концентрации инвертазы в неизвестных образцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Основным преимуществом пробирного стабильности фермента ЦМТ, описанные здесь является автоматизация. После того как сделаны все необходимые буферы и решения, время установки для каждого пробирного находится примерно 15 минут, для лица, совершающего assay. В отличие от обычных анализов для инвертаза и лактозной активности требуют около 2 ч с постоянным участием лица, совершающего assay и многие ферментативную активность анализов принимать значительно более человеко-часов. В предыдущей публикации мы продемонстрировали, как данных из метода ЦМТ сравнивает к более традиционным методом spectrophotrometric для активность инвертазы11.
Еще одним преимуществом пробирного ЦМТ является его применимость к почти любого ферментов12. Таким образом тестирование стабильности различных ферментов под конкретного набора условий не требует создания нескольких различных анализов. Кроме того ЦМТ assay полезен для определения стабильности деятельности Роман фермента или фермента, который не имеет подходящего колориметрические пробирного. Assay МТЦ также может быть сделано в непрозрачный средств массовой информации, что является основным преимуществом в пищевой науки. Поскольку большинство предыдущих анализов ферментативной активности использования спектрофотометрии, флуоресценции или свечения для измерения активности ферментов, они не совместимы с непрозрачными или высоко цветные СМИ. Хотя эта работа демонстрирует только влияние температуры на стабильность ферментативной активности, ЦМТ метод применим для большинства других условий, которые влияют на стабильность фермента (например, рН, соли, неводных растворителях и денатурируя агентов).
Как с всеми ЦМТ экспериментов, буфер, используемый для решения фермента и субстрат должен соответствовать как можно ближе. Несоответствие концентрации или рН может вызвать большие тепловые эффекты, которые превышают динамический диапазон калориметра. Использование же складе буфера для подготовки субстрата и фермента решения обычно достаточно. Но если нет, решения могут быть подкреплены dialyzing оба решения против же буферного раствора.
Еще одно условие, что фермент не должно быть насыщения субстрата, в этом случае высота пика становится независимой от концентрации субстрата. Кроме того время реакции для перехода к завершению или равновесия между инъекциями может стать чрезмерным и/или сигнал может превысить динамический диапазон калориметра. Однако концентрация субстрата должна быть достаточно большой, чтобы обеспечить сильный сигнал. Если фермент насыщения субстрата, концентрации субстрата может быть уменьшена, или увеличение концентрации фермента. При загрузке калориметра клеток и шприц, один необходимо убедиться, что не пузыри присутствуют. Если пузырь вводится или выпустили из клетки в ходе эксперимента, это вызовет аномальных событий в тепла скорость сигнала.
ЦМТ метод зависит от изменения энтальпии катализируемой реакции и скорость и количество реакции. Если изменение энтальпии реакции слишком мал, субстрат слишком нерастворимых или фермента не имеют достаточной активности, уровень тепла может быть слишком мал для получения достаточного сигнала. Кроме того если фермент препятствует низких концентрациях продукции, снижение ферментативной активности наблюдается в ходе эксперимента будет нанесен ингибитированием продукта, а также потеря активности с течением времени. Например при титровании лактазы, конечная концентрация 54 мм глюкозы и галактозы вызывает 27% снижение в высоту пик активности ферментов при 55° C (данные не показаны). Это значительно меньше, чем 78% уменьшение пик высотой от инъекций 1 до инъекции 4 на рисунке 1. Однако это можно исправить путем измерения активности ферментов при наличии концентрации продукта, достигнутым в ходе анализа. Кроме того титрования фермента с меньше субстрата может уменьшить количество продукта ингибирование.
Другие ограничения может возникнуть вследствие фермента. Например с каждой инъекции фермента будет разбавленным. Потому что этот ЦМТ использует переполнения реакции судна, в ходе эксперимента объем раствора эквивалентно размер инъекции удаляется с каждой инъекции. Таким образом небольшое количество фермента удаляется, и продукты реакции увеличивается с каждой инъекции. Эффекты разрежения и количество фермента удалены могут быть небольшими, если размер инъекции является небольшим, и поэтому часто необходима большая концентрация субстрата. Поскольку отношение объема впрыска к реакции судна тома меньше в МТК с более крупных судов реакции разрежающего эффект меньше, чем в низкой громкости ЦМТ, используемые в этой работе. Кроме того, каждой реакции для многих ферментов потребует мкг для низких миллиграмм количествах, поэтому если у вас есть фермента, который является дорогостоящим или трудно очистить, это может запретить использование этот assay.
Большинство из вопросов, которые могут возникнуть в ходе этого анализа, касающиеся надлежащего технического обслуживания и очистки ЦМТ реакции судна. Если ЦМТ не достиг стабильной базовой линии, это часто из-за реакции судна, не будучи достаточно чистый. Мы рекомендуем использовать сильные моющие средства после каждого эксперимента, при использовании белков в ЦМТ, потому что белки могут придерживаться реакционный сосуд и мешать измерение частоты тепла. Для более глубокого чистого, введение 50% раствора муравьиной кислоты, инкубировали при 55 ° C до 12 ч после уборки чистящего раствора (Таблица материалов), этанол и вода будут удалены большинство загрязнений.
Наконец поскольку ЦМТ занимает около 45 минут, чтобы сбалансировать после загрузки решения, активность ферментов, относительно нестабильной или маргинальных условиях может оказаться невозможным. Если фермент инактивированная во время этого времени нет сигнала, будет доступен или распада могут быть слишком быстро после первой инъекции для получения данных стабильности.
Потому что ЦМТ assay непосредственно измеряет активность фермента, она может распространяться на целый ряд других видов использования. Например этот assay может быть сделано с увеличением концентрации ингибитора для определения константы ингибирования, Ki, основанный на снижение активности ферментов с увеличением концентрации ингибитора. Как показано на рисунке 5, этот протокол может быть адаптирована для иммобилизованных ферментов на твердой поддержки. Нановолокно мембраны использовался в этой работе, но могут также использоваться другие твердые поддерживает если метод для вставки и удаления его через трубку, небольшой доступа могут быть разработаны. ЦМТ метод может также распространяться на ферменты, которые изменяются химически или genetically для улучшения термической стабильности или определить количество активных ферментов в неизвестный образец (то есть, на рисунке 6 показана линейная зависимость между тепла скорость пик Высота и фермента концентрация).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет
Acknowledgments
Нет
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| a-Lactose | Fisher Scientific | unknown (too old) | 500g |
| Sodium Acetate, Anhydrous 99% min | Alfa Aesar | A13184-30 | 250g |
| Lactase | MP Bio | 100780 | 5g |
| Hydrocholric Acid Solution, 1N | Fisher Scientific | SA48-500 | 500mL |
| Benchtop Meter- pH | VWR | 89231-622 | |
| Ethanol 70% | Fisher Scientific | BP8231GAL | 1gallon |
| Micro-90 | Fisher Scientific | NC024628 | 1L (cleaning solution) |
References
- Anastas, P., Eghbali, N. Green chemistry: principles and practice. Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).
- Jin, L. Q., et al. Immobilization of Recombinant Glucose Isomerase for Efficient Production of High Fructose Corn Syrup. Applied Biochemistry Biotechnoiogy. 183 (1), 293-306 (2017).
- Budak, ŞÖ, Koçak, C., Bron, P. A., de Vries, R. P. Microbial Cultures and Enzymes Dairy Technology. , 182-203 (2018).
- van Donkelaar, L. H. G., Mostert, J., Zisopoulos, F. K., Boom, R. M., van der Goot, A. J. The use of enzymes for beer brewing: Thermodynamic comparison on resource use. Energy. 115, 519-527 (2016).
- Rodriguez-Colinas, B., Fernandez-Arrojo, L., Ballesteros, A. O., Plou, F. J. Galactooligosaccharides formation during enzymatic hydrolysis of lactose: Towards a prebiotic-enriched milk. Food Chemistry. 145, 388-394 (2014).
- Lawrence, P. B., Price, J. L. How PEGylation influences protein conformational stability. Current Opinions in Chemical Biology. 34, 88-94 (2016).
- Bernal, C., Rodriguez, K., Martinez, R. Integrating enzyme immobilization and protein engineering: An alternative path for the development of novel and improved industrial biocatalysts. Biotechnology Advances. 36 (5), 1470-1480 (2018).
- Rigoldi, F., Donini, S., Redaelli, A., Parisini, E., Gautieri, A. Review: Engineering of thermostable enzymes for industrial applications. Applied Bioengeneering. 2 (1), 011501 (2018).
- Johnson, C. M. Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability. Archives of Biochemistry and Biophysics. 531 (1), 100-109 (2013).
- Chen, N. G., Gregory, K., Sun, Y., Golovlev, V. Transient model of thermal deactivation of enzymes. Biochimica et biophysica acta. 1814 (10), 1318-1324 (2011).
- Mason, M., et al. Calorimetric Methods for Measuring Stability and Reusability of Membrane Immobilized Enzymes. Jounal of Food Science. , (2017).
- Leksmono, C. S., et al. Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab. Journal of visualized experiments : Journal of Visual Experiments. (138), e54377 (2018).
