Summary
Enzim aktivitesinin termal kararlılık kolayca izotermal titrasyon Kalorimetre (ITC) tarafından ölçülür. Çoğu protein istikrar deneyleri şu anda ölçü protein unfolding kullanılan ancak enzimatik etkinliği hakkında bilgi sağlamaz. ITC enzim değişiklikleri istikrarı üzerinde enzim aktivitesinin etkisini doğrudan tayini sağlar.
Abstract
Bu eser izotermal titrasyon Kalorimetre (ITC) enzim aktivitesi kararlılığını ölçmek için yeni bir yöntem gösterir. Substrat çözeltisi tek bir enjeksiyon bir enzim çözüm içine enzim aktivitesi ile ilişkili sonra gözlenen en yüksek ısı hızı. Belgili tanımlık substrate zaman içinde birden çok enjeksiyonları aynı enzim çözüm içine kayıp enzim aktivitesinin göster. Tahlil gerektiren çok az personel zaman, özerk ve çoğu medya ve enzimler için geçerlidir.
Introduction
Proteinler organik reaksiyonlar geniş bir dizi katalizlerler yetenekli enzimlerdir. Çoğu enzim işlevinde yakınındaki nötr pH böylece sert çözücüler kullanımı kaçınarak sulu çözüm. Onların yüksek seçicilik nedeniyle daha az katalize enzim reaksiyonlar üretmek (bazı durumlarda hiçbir yan) yan asitler ve bazlar1gibi non-selektif katalizörler daha. Bu tüm kimyasal reaksiyonlar nihai ürün insan tüketimi için güvenli bu yüzden burada yapılması gereken gıda üretiminde özellikle önemlidir. Şu anda, enzimleri yüksek fruktoz mısır şurubu2, peynir3, bira4, laktozsuz süt5ve diğer önemli gıda ürünleri üretmek için kullanılır. Enzim kullanımı gıda sektöründe bu kağıt odaklanır iken enzimleri yeşil kimya ve ilaç sentezi de dahil olmak üzere çok çeşitli amaçlarla.
Belgili tanımlık yarar enzimlerin enzim üç boyutlu yapısını korumak üzerinde bağlıdır enzim aktivitesinin istikrar ile sınırlıdır. Enzim yapısı PEGylation6, immobilizasyon sağlam destek7, genetik değişiklikler8ve formülasyonları gibi değişiklikleri tarafından stabilize. Şu anda, enzim istikrar genellikle diferansiyel tarama Kalorimetre (DSC) tarafından ölçülür ve bitiş noktası enzim etkinliği9deneyleri. DSC hangi bir enzim izlerken sıcaklık ölçer; yüksek sıcaklık, daha istikrarlı bir yapı. Ancak, aktivite kaybı kez enzim veya etki alanları enzim10içinde açılmak için gerekenden daha düşük bir sıcaklıkta oluşur. Bu nedenle, DSC bir enzim değişiklik enzim aktivitesinin istikrar artıp artmadığını belirlemek için yeterli değildir. Bitiş noktası enzim deneyleri genellikle yoğun zaman, birden fazla örnekleri gerektirir ve genellikle son derece renkli veya opak çözümleri veya kullanılamaz hale için geçerli değildir eşleşmiş bir kolorimetrik reaksiyon içerir.
Bu eser bir enzim aktivitesi kararlılığını doğrudan ölçme izotermal titrasyon Kalorimetre (ITC) gösterir. ITC serbest veya bir tepki boyunca absorbe ısı hızını ölçer. Neredeyse tüm reaksiyonlar üretmek veya ısı emer, ITC eşleşmiş bir tepki veya oluşan reaksiyonlar süt gibi opak medya da dahil olmak üzere çoğu enzim katalize reaksiyonlar için kullanılabilir. ITC uzun yıllar çeşitli tepkiler için kimyasal kinetik parametreleri ölçmek için kullanılmıştır, ancak burada sunulan protokolü en yüksek ısı hızı enzim katalize reaksiyonların ölçmek için ITC kullanarak üzerinde odaklanır ve enzim aktivite doğrusal olduğunu gösterir en yüksek sıcaklık hızı ile ilişkili. En yüksek ısı hızını ITC ölçümleri çoğunlukla özerk ve kurulum ve analiz etmek için çok az personel zaman gerektirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hazırlanması örnekleri
-
1000 mL 0.1 M sodyum asetat arabelleği pH 4.6
- 800 mL distile su bir 1000 mL mezun ölçek ölçmek.
- Susuz sodyum asetat 8.2 g tartmak ve kabı için ekleyin.
- Kabı bir heyecan tabağa yerleştirin, bir heyecan çubuk ölçek kabı yerleştirin, heyecan plaka üzerinde açmak ve tamamen eriyene kadar karıştırın.
- Ne zaman susuz sodyum asetat tamamen çözülmüş, kalibre edilmiş pH metre ile pH çözüm ölçmek.
- Buna göre 1 M HCl veya NaOH istenen pH 4,6 elde etmek için ekleyin.
- Kadar toplam hacmi 1000 mL distile su ekleyin.
- Oda sıcaklığında kullanmak kadar saklamak.
-
Enzim çözüm
- Enzim mezun çözüm 15 ml 0.1 M sodyum asetat tampon pH 4,6 ilk ölçüm 8 mL tarafından 10-30 mg/mL aralığında silindir 10 mL hazırlayın.
- Arabellek çözüm 15 mL konik tüp enzim ile içine ekleyin ve enzim eriyene kadar şiddetle çalkalanır.
- Toplam hacim 10 mL olana daha fazla arabellek çözüm ekleyin.
- 4 ° C'de enzim çözüm kullanmak kadar saklamak.
-
Substrat çözeltisi
- 300-600 mM aralığında bir substrat çözeltisi hazırlamak için gram cinsinden istediğiniz toplama yapmak için gerekli substrat miktarı hesaplamak.
- Belgili tanımlık substrate tartmak ve 100 mL cam kabı yerleştirin
- 20 mL 25 mL mezun silindir kullanarak tampon çözeltisi ölçmek ve daha sonra cam kabı ekleyin.
- Kabı bir heyecan tabağa yerleştirin ve bir manyetik heyecan çubuk ölçek kabı yerleştirin. Klimayı açabilir ve karıştırma hızı buna göre ayarlayın.
- Belgili tanımlık substrate eriyene kadar devam etmek için karıştırma izin verir.
- Substrat çözeltisi 50 mL konik tüp içine dökün ve kadar Toplam hacim 45 mL 0.1 M sodyum asetat tampon pH 4,6 ekleyin. Sallayarak karıştırın.
- Substrat çözeltisi, oda sıcaklığında kullanmak kadar saklamak.
2. deneme gerçekleştirme
- ITC enstrüman hazırlanıyor
- Başvuru hücresi 350 µL distile su ile yüklü emin olun. Enzim örnek hücre yüklemeden önce örnek hücre temizledi doğrulayın.
- İletişim kuralı-dolgu yükleme şırınga 500 µL % 2 temizleme solüsyonu (Malzemeler tablo) ile Temizleme, dikkatle iğne örnek hücreye, hücreyi doldurmak ekleyip yavaş yavaş sıvı aynı Ģırınga kullanarak kaldırabilirsiniz. Sıvı kabı atın. Bu % 2 temizleme solüsyonu (Malzemeler tablo) ile iki kez üç kez % 70 etanol ile adımları yineleyin ve sonra on kere distile su ile yıkayın.
- Enzim çözüm 450 µL ile yükleme şırıngaya doldur, dikkatle sonuna kadar örnek hücrenin altına iğne yerleştirin ve yavaş yavaş hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için pompayı 100 µL satır aşağı tuşuna basın.
- İğne ucu suya koyarak sonra yavaş yavaş şırınga suya alarak sonra atık konteyner içine su dağıtımı tarafından üç kez 50 µL titrasyon şırınga distile su ile yıkayın.
- Artık su substrat çözeltisi ile üç kez durulama tarafından kaldırın.
- Titrasyon şırınga yukarıya-e kadar belgili tanımlık tenkıye herhangi bir hava kabarcığı tam çözüm çizerek substrat çözeltisi ile doldurun.
- Hala substrat çözeltisi içinde şırınga pistonu çıkarın ve yaklaşık 2 µL hava şırınga girin ve pistonu eski mevkiini geri vermek için izin.
- ITC buret kolu Kaldır, içinde buret tanıtıcı şırınga yerleştirin ve sıkı kadar canı cehenneme.
- Bir hav bırakmayan dokusu ile karıştırıcı ucu silin sonra dikkatlice buret kolu ITC araç yerleştirin ve yerine kilitlemek.
3. ITCrun ayarlama
- Bilgisayarda ITCrun açın ve ayarla' yı tıklatın.
- Oranı karıştırma tıklatın ve 350 RPM için ayarlayın. Şırınga büyüklüğü (µL) denetleyin ve 50 µL olduğundan emin olun.
- Sıcaklığı ayarlamak ve Updatetuşuna basın. Bu adım gerçekleştirilmesi önerilir ITC hazırlamadan önce en az 1 h. Bu kadar ısı veya gerektiği gibi soğuması araç için yeterli zaman sağlar.
- Deneme kurulumu için artımlı titrasyon seçin.
- Enjeksiyonlar kurulum için Ekle ' yi tıklatın. 5.400 için enjeksiyon aralığını ayarlama s, enjeksiyon hacmi (µL) 4 ve 4 iğne sayısı. Ayarlarını onaylamak için Tamam tuşuna basın.
- Denge kutusu, Otomatik equilibrate ve büyük ısıtır beklenenseçin. (Beklenen ısıtır küçük, bir küçük altında beklenen ısıtır seçebilirsiniz; ancak, bu denge süreyi uzatmış olursunuz.)
- 300'e ilk temel küme s.
- Çalışma, tıklayın başlatmak için Başlat karıştırma oranı yanındaki simge ve yanında İngiliz anahtarı simgesi bulunan Başlat ' ı tıklatın.
- Dosyayı kaydedin ve aracı çalıştırmak izin verir.
4. verilerin analizi
- Açık belgili tanımlık eğe içinde NanoAnalyze. Veri ' ı tıklatın ve veri sütunlarıseçin.
- Tüm verileri seçin, kopyalayın ve sonra verileri Microsoft Excel'e yapıştırabilirsiniz.
- 300 gerekli değeri ekleyerek sıfır temel ayarlamak yapmak için s sıfır. Bu düzeltme ısı oranı değerleri sütunun tamamına uygulanır.
- Denklemi kullanarak her enjeksiyon için ısı oranı en küçük veya en büyük değeri bulmak: =MIN(cell:cell) veya MAX(cell:cell). Her veri noktası en yüksek enzimatik aktivite her enjeksiyon adlı enzim temsil eder.
- Değeri titrasyon sırasında oluştuğu zamana karşı MIN veya MAX değerleri grafikleri çizmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 ve şekil 5 temsilcisi sonuçlarında iki enzimler, laktaz ve invertase gelen verileri göstermek. Laktaz ve invertase bir disaccharide hidroliz iki bol katalizler endothermically ve exothermically, anılan sıraya göre. Her iki enzimatik reaksiyonları doygunluk enzim durdurulmasını emretti konsantrasyonları işletilmiştir.
Laktaz veri ITC verileri enzim istikrar tahmin etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Dört sıralı 4 µL enjeksiyonlari 600 mM laktoz (şekil 1) 20 mg/mL laktaz titre. 5.400 aralığını s arasında her enjeksiyon uygulandığı ve bu ilk temel önce her iğne dönmek yeterli zaman sağlar. Yukarıda açıklanan protokol 25 ° C, 35 ° C, 45 ° C ve 55 ° c gerçekleştirildi Ayrıca, 600 mM laktoz 100 mM sodyum asetat arabellek yalnızca 55 ° C'de içine karıştırma ısı kontrol olarak titre. Her enjeksiyon enzim substrat içine için karıştırma ilk bir ekzotermik ısı ve laktoz katalize laktaz endotermik hidroliz reaksiyon tamamlandıktan ve taban çizgisine ısı oranını verir kadar daha sonra ortaya çıkar. Laktoz enjeksiyon laktaz çözüm içine sonra Isıalan reaksiyon gelen her sonraki enjeksiyon pik yüksekliği ile üç kez daha önceki enjeksiyon daha az enzimatik aktivite azalması nedeniyle tekrarlanır. Ham veri sonra en yüksek ısı Saati'ne (şekil 2A-D) göre göstermek için dönüştürülebilir. Pik yüksekliği her enjeksiyon için o zaman bir doğrusal regresyon için uygun olabilir ve yamaç enzim istikrar seçilen sıcaklığında gösterir. Daha fazla eğim, daha az istikrarlı enzimin negatif. Beklendiği gibi enzim istikrar ile artan sıcaklık (şekil 2E) azaltır.
Laktoz laktaz seyreltme sonuçları şekil 1 ' de açıklanan her enjeksiyon. ITC laktaz aktivitesi tahlil bu seyreltme enzimatik aktivite düşüş nedeninin olmadığını göstermek için aynı zamanda 25 ° c, laktaz konsantrasyon ilk enjeksiyon ve son enjeksiyon (şekil 3) yapıldı. Oysa dördüncü enjeksiyon tahlil etkinliği % 73 azalma gösterir bu seyreltme enzim etkinliği, %8 azalma olur. Laktaz seyreltme dört enjeksiyon deney sırasında böylece nispeten küçük bir etkisi (yani, %11) vardı enzim etkinliği. Etkinlik fiili kaybı, bu nedenle 73-8 oldu = %65.
Ekinde ITC kullanmanın yararlarından biri bu tepkiler süt gibi opak medyada yapılabilir giriştir. ITC bu yeteneğini göstermek için süt doğrudan laktaz (şekil 4) enjekte ettiler. Sütün pH sodyum asetat arabelleğe eşleşen not çünkü hemen ardından enjeksiyon karıştırma büyük bir ekzotermik ısı. Karıştırma en yüksek ekzotermik ısı ısı sonraki en yüksek karıştırma laktaz (şekil 4, gri çizgi) yoksun denetim ve süt (şekil 4, siyah ve noktalı çizgiler) ile iki enjeksiyonları görülür. Laktaz aktivitesi gösteren Isıalan reaksiyon oluşur. Süt proteinler, vitaminler, mineraller ve laktoz karmaşık bir karışımı içerir. Süt karmaşıklığı nedeniyle, diğer tepkiler bizim reaksiyon seyri sırasında ortaya muhtemeldir. Endotermik pik laktaz aktivitesi nedeniyle olduğunu ispat için süt ile 146 mM laktoz çivili. Çivili laktoz süt (şekil 4, noktalı çizgi) ile reaksiyon endotermik pik ve eğri altındaki alan endotermik pik gerçekten laktaz etkinliği nedeniyle olduğunu belirten süt yalnız (şekil 4, siyah çizgi), büyüktür. Satır taban çizgisi uzaklığı laktoz reaksiyon tamamlandıktan sonra yavaş reaksiyon devam ettiğini gösterir.
Bu tahlil iki farklı enzim hazırlıkları enzimatik aktivite kararlılığını karşılaştırmak için nasıl kullanılabileceğini göstermek için ücretsiz invertase ve bir naylon-6 nanofiber membran üzerinde immobilize invertase istikrarı karşılaştırılır şekil 5 ' te 35 ° C'de11 . Laktaz tahlil olduğu gibi Sükroz enjeksiyonlari dört 4 µL ardışık olarak yapılmış ve her enjeksiyon için tepe yükseklikten maksimum ısı oranı belirlenir. Şekil 6' da gösterilen, tepe yükseklikleri doğrusal olarak azalan enzim etkinliği gösteren zamanla azaltabilirsiniz.
Resim 1 : ITC verileri laktaz aktivitesi izleri. Her izleme dört sıralı 4 µL enjeksiyonları 600 mm laktaz çözüm pH 4,6 arabelleği laktoz gösterir. İzlerini 55 ° C (siyah), 45 ° C (koyu gri), 35 ° C (25 ° C (açık gri) kesik) ve (55 ° C'de noktalı) bir enzim kontrol yapılmıştır Düz çizgiler her enjeksiyon takip endotermik pik en az uygun temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : İstikrar enzim aktivitesinin temel değişim oranı en yüksek etkinlik. Tepe enzimatik aktivite her zaman (s) 25 ° C(a), 35 ° C (B), 45 ° C (C) ve 55 ° C (D) göre dört enjeksiyon için. Veri doğrusal uygun düz çizgiyle temsil edilir. A-D yerlerinde monte satırları yamaçları sıcaklık ekarşı çizilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Enzim seyreltme pik yüksekliği 25 üzerinde etkisini ° C. Laktaz aktivitesi enzim 20 mg/mL (siyah) ve konsantrasyon 18.62 mg/mL (gri) birinci ve dördüncü enjeksiyonları, anılan sıraya göre ölçülür. İlave bir Yakınlaştırılmış içinde görüş-in en yüksek enzim etkinliği olduğunu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Süt laktaz aktivitesi ölçme. ITC BYU süthane şişman ücretsiz sütüne arabellek (gri), 20 mg/mL laktaz (siyah) içine süt ve süt 20 mg/mL (noktalı) % 5 ek laktoz ile çivili bir enjeksiyon izi. Y ekseni endotermik enzim reaksiyon ve karıştırma ekzotermik ısı göstermek için kesintili olur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Nasıl ITC enzim istikrar tahlil 35 ° c invertase iki farklı ürünleri karşılaştırmak için kullanılan bir temsili örnek. Nanofiber membran ve ücretsiz enzim immobilize invertase faaliyetlerini sırasıyla noktalı ve koyu gri çizgilerle gösterilir. Siyah bir çizgi ile uygun ölçeklerde karıştırma ısı gösterilen yok invertase denetimidir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 : 600 mM Sükroz 4 µL enjeksiyon takip en yüksek ekzotermik ısı oranı ve invertase konsantrasyonu arasında doğrusal ilişki. Bu standart eğri invertase bilinmeyen bir örnek konsantrasyonu belirlemek için kullanılabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan ITC enzim istikrar tahlil önemli bir avantajı otomasyon sistemidir. Tüm uygun arabellek ve çözümleri yapıldıktan sonra her tahlil için hazırlık süresi yaklaşık 15dk için tahlil yapan biri var. Buna ek olarak, geleneksel deneyleri invertase ve laktaz aktivitesi için tahlil yapan kişinin sürekli katılımı ile yaklaşık 2 h gerektirir ve birçok enzimatik aktivite deneyleri miktardan çok daha fazla adam-saat değerlerini alır. Bir önceki yayında veri ITC yönteminden daha geleneksel bir spectrophotrometric yöntemi invertase etkinliği11nasıl karşılaştırır göstermiştir.
ITC tahlil bir diğer avantajı onun geçerliliği ile hemen hemen her enzim12uygulanır. Böylece, belirli bir koşullar kümesi altında farklı enzimler kararlılığını test birkaç farklı deneyleri kurma gerektirmez. Ayrıca, ITC tahlil bir roman enzim veya uygun bir Renkölçer tahlil yok bir enzim aktivitesinin istikrar belirlemek için kullanışlıdır. ITC tahlil gıda biliminde önemli bir avantajı olan opak medya da yapılabilir. Enzim aktivitesinin en önceki deneyleri enzim etkinliği ölçmek için spectrophotometry, floresan veya ışıldama kullandığından, onlar opak veya son derece renkli media ile uyumlu değildir. Her ne kadar bu iş sadece sıcaklık enzim aktivitesinin istikrar üzerindeki etkisi gösterir, ITC enzim istikrar (örneğin, pH, tuzları, sulu olmayan çözücüler ve denaturing ajanlar) etkiler çoğu diğer koşullar için geçerli yöntemdir.
Tüm ITC deneyler gibi enzim ve Substratı çözüm için kullanılan arabellek olarak mümkün olduğunca yakından eşleşmesi gerekir. Konsantrasyon veya pH uyumsuzluk Kalorimetresi dinamik aralığını aşan büyük ısı etkilere neden olabilir. Enzim ve Substratı çözümleri hazırlamak için aynı hisse senedi tampon kullanımı genellikle yeterli olur. Ama değilse, çözümler her iki çözüm de aynı arabellek çözüm karşı dialyzing tarafından eşleştirilebilir.
Bir daha da durumdur enzim substrat doymuş olmamalı, bu durumda, en yüksek yükseklik substrat konsantrasyonu bağımsızlığını ilan etti. Ve ayrıca, tamamlama veya denge enjeksiyonları arasında gitmek tepki süre aşırı olabilir/veya sinyal Kalorimetresi dinamik aralığı aşabilir. Ancak, substrat konsantrasyonu güçlü ısı sinyal sağlamak için yeterli büyüklükte olması gerekir. Enzim Substrat doymuş substrat konsantrasyonu Azaltılabilecek veya enzim konsantrasyonu artar. Kalorimetresi hücre ve şırınga yüklenirken bir hava kabarcığı yok bulunduğundan emin olmalısınız. Bir hava kabarcığı enjekte veya hücreden bir deney süresince piyasaya, ısı oranı sinyal içinde anormal bir olay neden olur.
ITC yöntemi katalize reaksiyon entalpi değişimine ve hızı ve tepki miktarı bağlıdır. Reaksiyon entalpi değişime çok küçüktür, substrat çok çözünmez veya enzim yeterli etkinlik yok, ısı oranı yeterli sinyal elde etmek için çok küçük olabilir. Enzim tarafından ürünlerin düşük konsantrasyonlarda inhibe Eğer Ayrıca, enzimatik aktivite deneme seyri sırasında gözlenen azalma ürün inhibisyon yanı sıra aktivite kaybı tarafından zamanla neden. Örneğin, laktaz titrasyon 54 mM glikoz ve galaktoz son konsantrasyonu pik yüksekliği 55 ° c (veri gösterilmez) enzim aktivitesinin % 27 azalmasına neden olur. Bu önemli ölçüde % 78'i azalışın en yüksek enjeksiyon 1 üzerinden enjeksiyon 4 şekil 1' deki için azdır. Ancak, bu enzim etkinliği tahlil süresince ulaştı ürün konsantrasyon huzurunda ölçerek düzeltilebilir. Daha fazla, daha az yüzey ile enzim titrating ürün inhibisyon miktarını azaltabilirsiniz.
Diğer sınırlamalar nedeniyle enzim oluşabilir. Örneğin, her enjeksiyon ile enzim seyreltilmiş olacak. Bu ITC bir taşma reaksiyonu gemi kullandığından, deneme süresince her enjeksiyon ile çözüm enjeksiyon boyuta eşdeğer hacmi kaldırılır. Böylece, enzim az miktarda kaldırılır ve reaksiyon ürünleri her enjeksiyon ile artar. Seyreltme ve kaldırıldı enzim miktarda etkileri enjeksiyon boyutu küçük tutulur ve bu nedenle substrat büyük bir konsantrasyon genellikle gereklidir küçük tutulabilir. Enjeksiyon cilt reaksiyon gemi birime daha büyük tepki gemi ile ITCs içinde daha küçük olduğu için seyreltme etkisi düşük hacimli bu çalışmada kullanılan ITC içinde daha küçüktür. Ayrıca, birçok enzimler için her reaksiyon mikrogram, düşük miligram miktarlar için gerektirecektir arındırmak zor ya da pahalı bir enzim varsa, bu bu tahlil kullanımını yasaklamak bu yüzden.
Bu tahlil sırasında ortaya çıkabilecek sorunları çoğu ile ilgili uygun bakım ve temizlik ITC reaksiyon teknesinin. ITC istikrarlı bir temel ulaşmazsa, reaksiyon gemi yeterince temiz değil varlık nedeniyle bu kez. Çünkü proteinler tepki gemi için sopa ve ısı oranı ölçümü ile müdahale proteinler ITC içinde kullanırken her deneyden sonra güçlü bir deterjan kullanmanızı öneririz. İçin daha derin bir temiz, ilâ 12 h temizleme solüsyonu (Tablo malzemeler), etanol ve su ile temizlik tarafından takip için 55 ° C'de inkübe %50 formik asit çözüm en kirletici kaldırır.
ITC çözümleri yükledikten sonra equilibrate için yaklaşık 45 dakika sürer çünkü son olarak, etkinlik nispeten istikrarsız enzimlerin veya marjinal koşullar altında mümkün olmayabilir. Enzim bu sırasında inaktive Eğer sinyal yok, mevcut olacak ya da çürüme istikrar verileri elde etmek için ilk enjeksiyon sonra çok hızlı olabilir.
Çünkü ITC tahlil doğrudan enzim aktivitesi önlemler, diğer kullanan bir dizi için genişletilebilir. Örneğin, bu tahlil inhibisyon sabiti, kı, inhibitör konsantrasyon artan enzim aktivitesi azalmaya temel alarak belirlemek için bir inhibitörü konsantrasyonları artan ile yapılabilir. Şekil 5' te gösterildiği gibi bu iletişim kuralı için sağlam bir destek immobilize enzimler adapte edilebilir. Nanofiber membran bu çalışmada kullanılan, ancak bir yöntem eklemek ve çıkarmak o küçük erişim tüpten geliştirilebilir varsa diğer sağlam destek de kullanılabilir. ITC yöntemi aynı zamanda enzimler kimyasal ya da genetik olarak değiştirilmiş termal kararlılığınızı geliştirmek için ya da bilinmeyen bir örnek etkin enzim miktarını belirlemek için için uzun olabilir (yani, şekil 6 ısı oranı en yüksek arasındaki doğrusal ilişkiyi gösterir konsantrasyon) yükseklik ve enzim.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbiri
Acknowledgments
Hiçbiri
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| a-Lactose | Fisher Scientific | unknown (too old) | 500g |
| Sodium Acetate, Anhydrous 99% min | Alfa Aesar | A13184-30 | 250g |
| Lactase | MP Bio | 100780 | 5g |
| Hydrocholric Acid Solution, 1N | Fisher Scientific | SA48-500 | 500mL |
| Benchtop Meter- pH | VWR | 89231-622 | |
| Ethanol 70% | Fisher Scientific | BP8231GAL | 1gallon |
| Micro-90 | Fisher Scientific | NC024628 | 1L (cleaning solution) |
References
- Anastas, P., Eghbali, N. Green chemistry: principles and practice. Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).
- Jin, L. Q., et al. Immobilization of Recombinant Glucose Isomerase for Efficient Production of High Fructose Corn Syrup. Applied Biochemistry Biotechnoiogy. 183 (1), 293-306 (2017).
- Budak, ŞÖ, Koçak, C., Bron, P. A., de Vries, R. P. Microbial Cultures and Enzymes Dairy Technology. , 182-203 (2018).
- van Donkelaar, L. H. G., Mostert, J., Zisopoulos, F. K., Boom, R. M., van der Goot, A. J. The use of enzymes for beer brewing: Thermodynamic comparison on resource use. Energy. 115, 519-527 (2016).
- Rodriguez-Colinas, B., Fernandez-Arrojo, L., Ballesteros, A. O., Plou, F. J. Galactooligosaccharides formation during enzymatic hydrolysis of lactose: Towards a prebiotic-enriched milk. Food Chemistry. 145, 388-394 (2014).
- Lawrence, P. B., Price, J. L. How PEGylation influences protein conformational stability. Current Opinions in Chemical Biology. 34, 88-94 (2016).
- Bernal, C., Rodriguez, K., Martinez, R. Integrating enzyme immobilization and protein engineering: An alternative path for the development of novel and improved industrial biocatalysts. Biotechnology Advances. 36 (5), 1470-1480 (2018).
- Rigoldi, F., Donini, S., Redaelli, A., Parisini, E., Gautieri, A. Review: Engineering of thermostable enzymes for industrial applications. Applied Bioengeneering. 2 (1), 011501 (2018).
- Johnson, C. M. Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability. Archives of Biochemistry and Biophysics. 531 (1), 100-109 (2013).
- Chen, N. G., Gregory, K., Sun, Y., Golovlev, V. Transient model of thermal deactivation of enzymes. Biochimica et biophysica acta. 1814 (10), 1318-1324 (2011).
- Mason, M., et al. Calorimetric Methods for Measuring Stability and Reusability of Membrane Immobilized Enzymes. Jounal of Food Science. , (2017).
- Leksmono, C. S., et al. Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab. Journal of visualized experiments : Journal of Visual Experiments. (138), e54377 (2018).
