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Behavior

一种表征姿势反应的仪器拉力测试

doi: 10.3791/59309 Published: April 6, 2019

ERRATUM NOTICE

Summary

姿势反射的损害, 称为姿势不稳定, 是很难量化的。临床评估 (如拉力测试) 会遇到可靠性和扩展性方面的问题。在这里, 我们提出了一个仪器版本的拉测试, 以客观地描述姿势反应。

Abstract

姿势反射的损害, 称为姿势不稳定, 是帕金森病的常见和致残的缺陷。为了评估体位反射, 临床医生通常采用拉力测试来对肩部向后的扰动进行校正反应。但是, 拉力测试容易出现可靠性和缩放 (记分) 方面的问题。在这里, 我们提出了一个仪器版本的拉测试, 以更精确地量化姿势反应。亲缘对临床试验, 拉除拉力外, 还记录拉。主干和脚的位移被半便携式运动跟踪系统捕获。原始数据表示行驶距离 (毫米单位), 使后续解释和分析直观。仪器拉力测试还检测影响拉力测试管理的变异性, 如拉力, 从而识别和量化可由统计技术解释的潜在混淆。仪器拉力试验可应用于旨在捕获姿势反应早期异常、跟踪体位不稳定和检测治疗反应的研究。

Introduction

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姿势反射的作用是保持平衡和直立的立场, 以响应扰动 1。这些姿势反应的损害, 如帕金森病的疾病导致姿势不稳定, 并通常导致跌倒, 步行信心下降和生活质量下降 2,3,4。在临床实践中, 姿势反射通常通过拉力测试进行评估, 在这种测试中, 审查员轻快地将患者拉向后靠在肩膀上, 并在视觉上对反应 5,6, 7 进行评分,8. 姿势不稳定通常使用国际运动障碍协会5公布的帕金森病综合评分表 (0-正常至 4-严重) 进行评分.这种方法已被广泛用于评估患有帕金森病的个人, 但可靠性差, 缩放 (记分)6,7,9。拉考试成绩通常与重要的临床终点 (如跌倒) 和基于整数的评分缺乏敏感性来检测精细的姿势变化10,11

基于实验室的客观测量方法通过量化动力学 (例如压力中心)、运动学 (如关节性腺/肢体位移) 和神经生理学 (如肌肉), 提供有关平衡反应性质的准确信息) 终点12。这些方法可以在临床上明显的姿势不稳定之前发现异常, 并跟踪随着时间的推移而变化, 包括对治疗13,14的反应。

量化姿势不稳定的工具

传统的动态后尿路技术通常采用移动平台。所产生的姿势反应是通过后尿路造影、肌电图 (emg) 和加速度计 121516 的组合来量化的。然而, 平台扰动的自下而上的反应----这引起了像在潮湿的地板上滑倒一样的反应----与临床拉力试验的自上而下的姿势反应有根本的不同----当在人群中被撞时可能会发生这种情况。新出现的证据表明, 截断扰动产生的姿势特征与移动平台的姿势特征不同, 为 171819.因此, 其他人则试图在实验室中使用复杂的技术, 包括电机、滑轮和钟摆 152021、22,截断扰动.测量方法往往费用高昂, 无法使用, 包括基于视频的运动捕捉, 需要在专门实验室提供专门的空间 20,21。理想情况下, 一个客观的方法来描述拉测试反应应该具有优良的心理测量性能, 易于管理, 易于操作, 广泛访问, 和便携。这对于促进广泛采用该技术作为一种替代评估工具以评估研究和潜在的临床环境中的体位反应非常重要。

仪器拉力测试

该方案的目的是为研究人员提供一种客观评估拉拔试验姿势反应的技术。半便携和广泛使用的电磁运动捕获系统是这一技术的基础。这种扰动涉及手动拉力, 不需要专门的机械系统。该方法具有足够的灵敏度, 可检测体位反应时间和响应振幅的微小差异;因此, 根据 UPDRS (无辅助平衡恢复的姿势不稳定),它适合捕获从正常到1级姿势不稳定的潜在异常。该方法也可用于探讨治疗对体位不稳定的影响。这里描述的协议来自 Tan 等人的协议。

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Protocol

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墨尔本卫生部当地人类研究伦理委员会对所描述的所有方法进行了审查和批准。研究前获得了参与者的知情同意。

1. 设备设置

  1. 根据制造商的指导, 使用3个微型运动传感器准备电磁运动跟踪器。在收集数据之前, 请确保每个传感器至少采样 250 Hz, 位移以毫米单位测量, 旋转 (俯仰、滚动和打哈欠) 以度为单位。确保禁用所有内部过滤器, 并将传感器设置为引用静态原点 (通常是电磁变送器) 的位置。
  2. 使用最小直径为10毫米的绳子, 将称重传感器 (最小张力范围为 100 n, s 型) 贴在患者的肩级线束上。
    注: 线束系统和绳索适用于重量不超过120公斤的参与者。
  3. 将称重传感器连接到数据采集单元 (aad 转换器)。
  4. 将数据采集单元的触发器输出连接到运动跟踪器的触发输入中, 以确保同步录制。设置数据采集单元采样率以匹配运动跟踪器并禁用所有筛选。
  5. 在安静的房间里进行实验, 以最大限度地减少评估过程中的干扰。为参与者留出足够的空间, 以采取若干纠正步骤来恢复平衡。
    注: 已知帕金森病和逆转的患者在拉试验中向后走5-6 步。
  6. 作为预防措施, 将瀑布垫放在地板上。
  7. 在对每个参与者进行测试之前, 请使用医院级消毒剂擦拭干净安全带、传感器和电线。
    注: 建议对检测的拉力测试程序进行视频录制 (例如, 在三脚架上使用便携式摄像机), 以便在数据处理过程中的任何不规则现象都可以针对试验的视频数据进行引用。

2. 参与者的选择和准备

  1. 确定合适的研究参与者: 参与者可以包括一系列年龄、疾病状况和严重程度, 在这些年龄、疾病状况和严重程度中, 姿势反应是有意义的, 平衡评估通常采用临床拉力测试。确保参与者能够独立站立并生成纠正平衡响应, 而不需要帮助即可恢复 (即根据 UPDRS, 最多不需要1级姿势不稳定)。
  2. 排除任何患有心血管、前庭、视力和肌肉骨骼疾病 (包括需要足部矫形器或夹板的人) 的人, 这些人可能会损害平衡性能, 除非这是调查的主题, 即接触的人预防措施, 以及那些已知会影响平衡或注意力的药物 (例如抗抑郁药、神经肽、苯并二氮杂卓、抗癫痫药、抗心律失常药物和利尿剂)。
  3. 让参与者在实验当天穿上舒适宽松的衣服, 并在拉试程序前脱鞋。
  4. 协助参与者使用自定义的行李箱线束和称重传感器。点击胸部和腰部的扣子。确保安全带上的调整带紧, 但舒适。拉绳子时, 不要让马具的松弛超过 5 0 毫米。在已知的姿势不稳定的参与者中, 确保在参与者站立时应用线束时存在助手。
  5. 使用医用胶带将运动传感器连接到胸骨凹槽 (在第二和第三胸椎的水平), 并在脚上的右侧和左侧脚踝小腿。
    注: 将传感器应用于坐姿中已知姿势不稳定的参与者。所有电缆必须小心布线, 以避免行程危险。
  6. 要求参与者赤脚站立, 以舒适的姿势 (根据参与者的首选支持基础) 沿垂直和水平线标记在地板上。注意参与者的脚位。让参与者也注意自己的脚位, 以便每次拉完之后恢复到相同的位置。每次试验后监控参与者的脚部位置, 如果发现任何偏差, 请参与者返回原来的脚位。
  7. 指示参与者将注意力集中在1.5 米前的眼睛水平上, 双手放在身边, 以最大限度地减少拉扯之间的干扰。

3. 仪器拉力试验程序

  1. 根据 UPDRS5描述的临床拉力试验指南进行仪器拉力测试。
  2. 解释测试过程, 并让参与者知道, 步进是允许在向后拉之后重新获得平衡的。在拉之前, 劝阻预期的反应, 如向前躯干屈曲、姿势僵硬或膝盖屈曲。如果这些响应发生在实验过程中, 请注意这些响应。
  3. 每次拉之前, 通过要求参与者关注挂在墙上的图片, 确保参与者的注意力。确保参与者站直, 眼睛睁开, 双手放在身边, 脚放在指定的标记上, 姿势舒适。
  4. 站在参与者的身后。通过与参与者肩部水平垂直的绳索和称重传感器, 施加足够的力的轻快拉力, 以产生躯干和阶跃响应。
  5. 每次拉完之后, 确保参与者返回到原来的脚部定位。将位置重置回地板上的指定标记, 然后重复35次。
    注: 试验数量可根据实验设计和临床人群而有所不同。
  6. 每10次试验结束后, 或根据需要, 让参与者短暂休息 2分钟, 以减少疲劳的影响, 并确保将注意力集中在任务上。参与者可以选择坐着或站着。要求参与者不要在拉之间交谈, 除非在手术过程中要求休息或表示不适。
  7. 作为额外的安全预防措施, 确保评估员和助理站在靠近墙壁的背上, 同时给参与者足够的空间向后走几步。
    注: 评估人员必须时刻准备着抓住病人。在评估已知的体位不稳定的参与者时, 需要一名助手来确保安全。
  8. 在完成检测的拉力测试程序后, 分离传感器并协助参与者离开线束。

4. 信号处理

注: 使用合适的数据科学平台, 如 MATLAB、R 或 Python。此处显示的命令是 MATLAB 的命令, 示例代码可作为补充文件使用。

  1. 将步骤3.4 中记录的数据导入到合适的数据科学平台: csvread ()。
  2. 使用触发信号将运动跟踪器和称重传感器数据对齐, 并将采样率恢复到更高的采样率: 如果需要, 可重新采样 1 kHz () 功能。
  3. 高通过滤器所有运动跟踪和称重传感器数据具有 0.05 Hz 截止频率, 以消除基线漂移: 黄油 () 和滤芯 ()。
  4. 双分化主干运动跟踪位移数据, 以获得主干速度和加速度: 差异 ()。
  5. 使用触发信号或峰值检测算法应用于称重传感器数据, 切片记录, 以获得每个单独的拉试验试验的时代: findpeaks () 函数。
  6. 检测和拒绝具有预期截断的试验。在拉管理之前的正向主干位移通常表现为至少三个标准偏差高于主干传感器基线平均值的峰值: std () 和平均值 ()。
  7. 确定姿势反应时间作为在拉和树干速度曲线的转折点 (表示树干减速的开始) 之后的树干位移的开始 (3个标准偏差高于基线平均值) 之间的差异:区分、差异 (), 并使用零交叉检测器, zcd ()。
  8. 确定姿势反应的大小作为躯干的峰值减速: 最小 () 或最大 ()。
  9. 计算步进反应时间, 作为截断位移的开始 (如 4.7) 与步进肢体初始运动之间的差异: 比基线平均值高出3个标准偏差。
  10. 通过计算脚的总位移 (毫米) (以毫米) 为单位来确定步进响应幅度, 从最初的脚升力到接触步进肢体的接触, 阻止向后排斥。排除小于50毫米的步骤, 因为支撑基座的变化被认为可以忽略不计24:min () 或 max ()。
  11. 计算称重传感器的峰值拉力和力发展速度: 最大 () 为拉力;力率的最大值 () 和差异 ()。
    注: 峰值拉力表示传递的瞬时最大力, 而力率是力与时间曲线的斜率, 表示力产生的速度有多快。

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Representative Results

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仪器拉力测试 (图 1) 用于调查一个年轻的, 健康的队列23的躯干和步骤反应.对35项试验进行了连续介绍, 每次拉同时进行听觉刺激 (图 2)。听觉刺激有90分贝 (正常) 或116分贝 (大声)。大声的刺激已经被证明足以触发 StartReact 效应, 在这种效果下, 事先准备好的反应会通过惊人的听觉刺激25提前发布。启动反应效应可用作探针, 以探索电机制备的基本机制 26.第一次试验是为了分析不习惯的反应, 随后的四次试验被放弃, 以考虑到实践效果, 这些试验已被证明是习惯于五个初步试验27。随后的习惯试验包括20次正常强度和10项随机混合的大声试验。试验间间隔 (10-15秒) 是可变的。由于多种因素可能影响躯干和阶跃姿势反应 (例如, 试验或参与者身高和体重之间拉力的变异性), 使用线性混合模型进行了分析。使用以下公式进行了线性混合模型分析:

Equation 1

其中yij 是参与者的反应时间或反应幅度试验i, β0-5 是固定效应系数, 0j 是参与者j的随机效应 (随机截距), 是错误的术语。

仪器拉力测试区分了一审反应和对向后摄动的启动反应效果。在第一次试验中, 步进反应时间较慢 (第一次试验与后续试验的平均差异: 36.9 毫秒, p = 0.009), 步进尺寸较大 (第一次试验与后续试验的平均差异:60 毫米, p = 0.002) (表 1).树干反应时间和响应量保持不变。开始反应作用在树干仅存在到随后的适应的拉扯。大声的听觉刺激加速了躯干反应时间 (大声的与正常刺激的平均差异: 10.2 ms, p = 0.002) 和增加的躯干反应幅度 (大声与正常刺激的平均差: 588 毫米-s.-2, p < 0.001) (图 3表 2)。探讨了有助于拉动测试响应的变量。值得注意的是, 发现审查员峰值拉力会影响步进响应的大小 (p < 0.001) 和主干反应时间 (p < 0.001) (表3表 4)。参与者体重影响步进反应时间 (p = 0.008) (表 3)。否则, 参与者的身高和体重不会影响结果。

Figure 1
图 1.设置仪器拉力测试.仪器拉力测试允许评估人员使用绳索和线束 (a)应用肩级向后摄动。摄动的力是用力计(b)记录的;通过放置在胸骨凹槽(c)的传感器进行截断响应;并通过左脚踝和右脚踝的传感器 ( d)步进。运动跟踪系统包括一个处理单元(e) , 用于计算与电磁发射机(f)有关的最多四个传感器的三维位置。听觉刺激是通过耳机提供的。这一数字已从23.请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2.从仪器拉力测试中收集的具有代表性的试验数据.垂直断线表示时间 (t) 轴上的标记。拉力的开始发生在标记 0, 随后在标记1处开始的躯干移位。正截形位移表示向后运动。听觉刺激从声音触发器的下降边缘开始, 峰值拉力在21±6毫秒内。在标记2处, 树干减速的开始发生在树干峰值速度的逆转时。姿势反应 (即截断反应时间) 被定义为标记2和1之间的差异。.这一数字已从23请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3.在躯干姿势反应中的初始反应效应.原始数据代表与正常刺激相关的单个试验在 90 dB (正常), 表示为灰色线和大声的听觉刺激在 116 dB (大声), 由蓝线表示。垂直断线表示时间轴上的标记。与灰色断线 (a) 相比, 蓝色断线垂直线与正常听觉刺激相比, 以主干速度对响亮听觉刺激的反应时间更快, 从而证明了启动反应的发生时间。对姿势任务的响应幅度来自躯干加速度。水平断线表示主干加速度轴上的标记。最大的响应幅度显示在大声试验中, 如代表加速度曲线最小点的蓝色断开的水平线所示, 与以灰色破碎水平线 (b) 表示的普通试验相比。这一数字已从23请点击这里查看此图的较大版本.

步进反应时间 步进响应幅度
试用类型比较 均值
(毫秒)
95% CI p 值 均值 (mm.s-2) 95% CI p 值
第一 vs. 正常 36。9 4.7, 69。2 0.009 60 17, 103 0.002
第一 vs. 大声 46。1 13.1, 79。2 0.002 53 9, 97 0.005
正常 vs. 大声 9。8 -3.1, 21。5 0.072 -7 -23, 9 0.315

表1。第一次拉试验试验和随后的试验之间的平均差异 () 与 90 dB (正常) 或 116 dB (大声) 的反应时间和反应幅度的听觉刺激 i.此表已从23修改。

中继反应时间 中继响应大小
试用类型比较 均值
(毫秒)
95% CI p 值 均值 (mm.s-2) 95% CI p 值
第一 vs. 正常 -6 -31.1, 19。0 0.692 162 -412, 737 0.497
第一 vs. 大声 4。2 -21.2, 29。6 0.692 -425 -1008, 158 0.12
正常 vs. 大声 10。2 3.0, 17。5 0.002 -588 -750,-425 < 0.001

表2。第一次拉试验试验和随后的试验之间的平均差异 () 为躯干反应时间和反应幅度 90 db (正常) 或 116 db (大声) 听觉刺激 i.此表已从23修改。

步进反应时间 步进响应幅度
预测 估计 95% CI p 值 估计 95% CI p 值
峰值力 -0.12 -0.44, 0.44 0.436 1.02 0.55, 1.49 < 0.001
力率 -0.01 -0.04, 0.04 0.575 0.01 -0.03, 0.03 0.528
高度 -64.65 -283.98、154.69 0.542 240.26 -77.51, 1278. 03 0.629
重量 2.37 0.72, 4.03 0.008 -2.51 -10.56, 5.55 0.518

表3。系数估计、95% 置信区间 (CI) 以及线性混合模型产生的步进响应检测拉力测试预测因子的统计意义.此表已从23修改。

中继反应时间 中继响应大小
预测 估计 95% CI p 值 估计 95% CI p 值
峰值力 0.36 0.22, 0.22 < 0.001 0.98 -2.95, 4.91 0.623
力率 -0.01 -0.03, 0.03 0.062 -0.12 -0.47, 0.47 0.486
高度 45.97 -31.16, 123.11 0. 233 -708.94 -3362.70, 19482 0.587
重量 -0.17 -0.75, 0.75 0.566 2.08 -18.04, 22.19 0.834

表4。系数估计, 95% 置信区间 (CI), 以及由截断响应的线性混合模型产生的检测拉力测试预测因子的统计意义.此表已从23修改。

补充编码文件.请点击此处下载此文件.

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Discussion

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在这里, 我们已经证明了临床拉力试验仪器的协议, 采取了一种广泛应用于临床实践的方法, 并产生了一个客观的测量姿势反应, 除了拉给管理的重要方面。使用半便携式运动跟踪, 这种方法提供了一种测量手段, 比传统的实验室技术更好地访问28。利用这种方法, 研究人员可以探索不同年龄和条件人群对自上而下的扰动的姿势反应特征。

虽然该议定书得到了成功使用, 但应当注意到一些限制。运动跟踪检测净运动, 而不是肌肉招募的开始, 通常由 emg29、3031测量。如果需要, 肌电图 (例如, 从肌肉测量, 包括胫骨前, 单侧, 腿筋, 四头肌, 腹直肌和腰椎副胸肌) 可以被整合到协议相对容易。我们使用的运动传感器是通过电线连接到基本单元的。这些电线在实验室有足够的长度来记录拉力测试运动学, 然而无线系统将更加实用, 特别是在临床环境中。需要对不同疾病状态和严重程度的队列进行进一步的有效性和可靠性测试, 才能找到可信的标准评估工具, 以评估根据 UPDRS (姿势姿势) 到一级的姿势反应不稳定与无人协助的平衡恢复)5

仪器拉拔试验作为评估姿势不稳定性的工具

与报告位移数据213233的其他解决方案相比, 电磁运动跟踪相对便宜, 半便携。以毫米单位记录位移是该技术的简单性的关键, 因为它否定了对复杂信号处理的要求, 因此可以直观地理解数据。其他常用的技术, 如加速度计, 如果不使用适当的传感器融合技术来消除几个混淆 (重力伪影, 随着时间的推移漂移, 校准错误)28, 34,35

在该协议中发现了关键步骤, 以确保准确收集数据。重要的是, 我们定义了在仪器拉力测试中的姿势反应时间的开始, 截断位移, 而不是开始的检查者启动拉。这对于排除在拉力时导致响应延迟的线束和绳索的任何移动都是至关重要的。在以前的工作中, 姿势反应的峰值加速度发生得更早, 与对截断摄动17的反应的囊相比, 上半身的振幅更大.非标准化力的拉力是人工获得的, 类似于临床拉力试验。步进的定义是在向后方向超过姿态脚的脚, 不包括向任何其他方向移动。我们发现峰值力对阶跃和主干反应有显著影响。因此, 在方法上必须记录力, 结果可以通过使用混合效应模型来解释拉力。根据称重传感器规格的不同, 可能需要一个前置放大器和单独的电源。使用制造商提供的校准曲线将记录的电压转换为拉力 (牛顿)。触发器也可用于计时传递听觉或视觉刺激, 以进一步表征平衡机制。

当执行35项试验时, 检测的拉力测试程序大约需要20分钟才能完成。与通常评估姿势不稳定性的方法相比, 此协议的用户需要确定实验所需的时间框架是否合适。在任务期间, 参与者被指示关注图片, 因为据悉, 注意力会随着反复暴露在平衡控制的威胁上而减弱.对姿势任务的关注与对姿势的意识监测增加有关, 姿势位移振幅的相应下降 37.在测试过程中, 参与者的安全以及评估人员和患者的潜在风险都是当务之急。其他安全预防措施包括为已知姿势不稳定和靠近墙壁的病人使用助理, 以防止评估人员与参与者 9一起坠落。

初始反应和电机准备

仪器拉力测试证明了检测姿势反应响应延迟微小变化的能力。在有代表性的结果中, 我们提供了与摄动同时进行的听觉刺激, 以评估与大声 (116 dB) 发生的反应时间的加速度, 而不是强度较小的 (90 dB) 刺激, 称为 StartReact 效应25,38. 我们能够检测到在33名参与者23中, 通过仪器拉力测试协议, 截断反应潜伏期的平均差异约为10 毫秒.这种运动的加速度到启动反应效应通常发生的幅度小于20毫秒使用 EMG 15.在首次试验响应中也检测到步进延迟的差异, 步进响应较大。这与使用移动平台3940 发现的 "第一次试验效果" 中发现的更大的不稳定是一致的。

本手稿中描述的这种方法已经证明了仪器拉力测试的能力, 以提供精确的姿势反应的量化, 以响应通常使用的临床拉力测试。目前, 仪器拉力试验是一种替代方法, 以评估在研究环境中的姿势反应。在临床使用之前, 还需要在可靠性和有效性方面做进一步的工作。根据统计功率计算, 用户可以酌情调整检测的拉力测试试验的数量。为了增加参与者在测试期间的舒适性, 特别是对女性的舒适性, 在未来版本的仪器拉力测试中, 可以考虑从后面固定的改装线束。需要进一步研究, 以充分探索这些反应的患者群体的平衡异常 (根据 UPDRS 的1级姿势不稳定), 以调查治疗的效果和阐明机制的姿势失 稳。

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Disclosures

提交人没有宣布任何经济或其他利益冲突。

Acknowledgments

我们感谢安格斯·比格 (仿生学研究所) 在视频协议方面的协助。我们感谢推荐博士 (墨尔本大学统计咨询中心和墨尔本统计咨询平台) 提供统计支持。这项工作得到了国家卫生和医学研究委员会 (1066565)、维多利亚狮子基金会和维多利亚州政府运营基础设施支助方案的资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Analog to Digital Convertor & Software CED Micro 1401-3 Any suitable digital acquisition system can be used
Load Cell Omegadyne LCM201-100N
MATLAB Software MathWorks Inc. NA Any data science platform can be used
Motion Sensor Ascension 6DOF, type-800
Motion Tracker Ascension  3D Guidance trakSTAR Mid-range transmitter
S&F Technical Harness and Belt Lowepro LP36282

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: An Instrumented Pull Test to Characterize Postural Responses
Posted by JoVE Editors on 04/30/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: An Instrumented Pull Test to Characterize Postural Responses.  Author affiliations were updated.

The affiliations for Joy Tan were updated from:

1. Department of Medical Bionics, The University of Melbourne 
2. Department of Neurology, The Royal Melbourne Hospital

to:

1. Department of Medical Bionics, The University of Melbourne 
2. Department of Neurology, The Royal Melbourne Hospital
4. The Bionics Institute

The affiliations for Thushara Perera were updated from:

1. Department of Medical Bionics, The University of Melbourne 
3. Department of Neurology, Austin Hospital

to:

1. Department of Medical Bionics, The University of Melbourne 
4. The Bionics Institute

一种表征姿势反应的仪器拉力测试
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Tan, J., Thevathasan, W., McGinley, J., Brown, P., Perera, T. An Instrumented Pull Test to Characterize Postural Responses. J. Vis. Exp. (146), e59309, doi:10.3791/59309 (2019).More

Tan, J., Thevathasan, W., McGinley, J., Brown, P., Perera, T. An Instrumented Pull Test to Characterize Postural Responses. J. Vis. Exp. (146), e59309, doi:10.3791/59309 (2019).

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