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Biochemistry

चाय से व्युत्पन्न एक नव स्थापित सेल निलंबन संस्कृति में छह प्रणालीगत कीटनाशक के चयापचय पर अध्ययन(कैमेलिया Sinensis एल.) पत्ते

Published: June 15, 2019 doi: 10.3791/59312
Automatic Translation
*1,2, *1, 2, 1, 1, 1
1State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, School of Tea and Food Science & Technology, Anhui Province Key Lab of Analysis and Detection for Food Safety, 2School of Resource & Environment, Anhui Agricultural University, Key Laboratory of Agri-food Safety of Anhui Province
* These authors contributed equally

Summary

यह काम चाय से व्युत्पन्न एक सेल निलंबन संस्कृति की स्थापना के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है(कैमेलिया sinensis एल) पत्तियों कि बाहरी यौगिकों कि पूरे संयंत्र द्वारा लिया जा सकता है के चयापचय का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे कीटनाशकों के रूप में.

Abstract

चाय संयंत्र के इन विट्रो ऊतकों का उपयोग कर कीटनाशक चयापचय का अध्ययन करने के लिए एक मंच विकसित किया गया था। बाँझ चाय के पौधों से पत्तियों को पौधे हार्मोन के साथ मुरशीज और स्कोग (एमएस) बेसल मीडिया पर ढीला कॉलस बनाने के लिए प्रेरित किया गया 2,4-डाइक्लोरोफेनोक्सीएसीटिक एसिड (2,4-डी, 1.0 मिलीग्राम एल-1) और किनेटिन (केटी, 0.1 मिलीग्राम एल-1)। कैलस subculturing के 3 या 4 दौर के बाद गठित, प्रत्येक स्थायी 28 दिन. ढीला कैलस (लगभग 3 ग्राम) तो एक ही संयंत्र हार्मोन युक्त बी 5 तरल मीडिया में inoculated किया गया था और एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में सुसंस्कृत किया गया था (120 आरपीएम) अंधेरे में 25 - 1 डिग्री सेल्सियस. 3 डिग्री 4 उपसंस्कृतियों के बाद, चाय पत्ती से व्युत्पन्न एक सेल निलंबन 1:1 और 1:2 (निलंबन माँ तरल: ताजा माध्यम) के बीच एक subculture अनुपात में स्थापित किया गया था। इस मंच का उपयोग करते हुए, चाय पत्ती व्युत्पन्न सेल निलंबन संस्कृति में छह कीटनाशकों (5 ग्राम एमएल-1 प्रत्येक थायामेथॉक्सम, इमिडाक्लोप्रिड, एसीटामिप्रिड, इमिडापोरिज, डाइमेथोएट, और ओमेथोएट) को जोड़ा गया। कीटनाशकों के चयापचय तरल क्रोमैटोग्राफी और गैस क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर ट्रैक किया गया था। चाय सेल निलंबन संस्कृति की उपयोगिता को मान्य करने के लिए, इलाज सेल संस्कृतियों और बरकरार पौधों में मौजूद थायामेथोक्सन और डाइमेथोएट के चयापचयों की तुलना बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके की गई थी। इलाज चाय सेल संस्कृतियों में, थायामेथॉक्सन के सात चयापचयों और डाइमेथोएट के दो चयापचय पाए गए, जबकि उपचारित अक्षुण्ण पौधों में, थियामेथोक्सम के केवल दो चयापचय और डाइमेथोएट में से एक पाया गया। एक सेल निलंबन का उपयोग बरकरार चाय पौधों के उपयोग की तुलना में चयापचय विश्लेषण सरलीकृत, विशेष रूप से चाय के रूप में एक मुश्किल मैट्रिक्स के लिए.

Introduction

चाय दुनिया में सबसे व्यापक रूप से सेवन गैर शराबी पेय ों में से एक है1,2. चाय का उत्पादन वुडी बारहमासी कैमेलिया सिनेन्सिस एल चाय के पौधों की पत्तियों और कलियों से होता है जो विशाल बागानों में उगाए जाते हैं और अनेक कीट ोंडकों के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं3,4. ऑर्गेनोफॉस्फोरस और नियोनिकोटिनोइड कीटनाशकों का उपयोग अक्सर चाय के पौधों को सफेद मक्खी, पत्ती हॉपर और कुछ लेपिडोप्टेरन प्रजातियों6,7जैसे कीटों से बचाने के लिए प्रणालीगत कीटनाशकों के रूप में किया जाता है . आवेदन के बाद, इन कीटनाशकों अवशोषित या संयंत्र में स्थानांतरित कर रहे हैं. संयंत्र के भीतर, इन प्रणालीगत कीटनाशकों hydrolysis, ऑक्सीकरण या संयंत्र एंजाइमों द्वारा कमी प्रतिक्रियाओं के माध्यम से तब्दील किया जा सकता है. इन परिवर्तन उत्पादों और अधिक ध्रुवीय और माता पिता यौगिकों की तुलना में कम विषाक्त हो सकता है. हालांकि, कुछ ऑर्गेनोफॉस्फेट के लिए, कुछ उत्पादों की जैव क्रियाकलाप अधिक होते हैं। उदाहरण के लिए, एसीफेट को अधिक विषाक् त मेथीडोफोस8,9तथा डाइमेथोएट को ओमेथोएट10,11में चयापचयित किया जाता है। इस प्रकार पादप12में कीटनाशक के भाग्य का निर्धारण करने के लिए पादप उपापचयिक अध्ययन महत्वपूर्ण होते हैं .

पादप ऊतक संस्कृतियों को कीटनाशक चयापचय की जांच करने के लिए एक उपयोगी मंच सिद्ध किया गया है , जिसमें पहचान किए गए चयापचयों के समान ही अक्षुण्ण पादप13,14,15में पाए जाते हैं . ऊतक संस्कृतियों, विशेष रूप से सेल निलंबन संस्कृतियों का उपयोग, कई फायदे हैं. सबसे पहले, सूक्ष्मजीवों से मुक्त प्रयोग किए जा सकते हैं, इस प्रकार रोगाणुओं द्वारा कीटनाशक परिवर्तन या गिरावट के हस्तक्षेप से बचें। दूसरे, ऊतक संस्कृति किसी भी समय उपयोग के लिए लगातार सामग्री प्रदान करता है. तीसरे, चयापचयों बरकरार पौधों से ऊतक संस्कृतियों से निकालने के लिए आसान कर रहे हैं, और ऊतक संस्कृतियों अक्सर कम interring यौगिकों और यौगिकों की कम जटिलता है. अंत में, ऊतक संस्कृतियों और अधिक आसानी से एक ही प्रयोग16में कीटनाशकों चयापचय की एक श्रृंखला की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

इस अध्ययन में, बाँझ विकसित चाय संयंत्र की पत्तियों से व्युत्पन्न एक सेल निलंबन सफलतापूर्वक स्थापित किया गया था। चाय सेल निलंबन संस्कृति तो छह प्रणालीगत कीटनाशकों के अपव्यय व्यवहार की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.

इस विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए कुछ मार्गदर्शन प्रदान करना है ताकि शोधकर्ताओं को एक संयंत्र ऊतक संस्कृति मंच चाय में xenobiotics के चयापचय भाग्य का अध्ययन करने के लिए उपयोगी स्थापित कर सकते हैं.

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Protocol

1. चाय कैलस संस्कृति

नोट: बाँझ पत्ते इन विट्रो में विकसित संयंत्र लाइनों से प्राप्त किए गए थे पहले अनुसंधान समूह में विकसित17. धारा 5 तक सभी प्रक्रियाओं एक बाँझ लेमिनर प्रवाह हुड में किए गए थे, एक इनक्यूबेटर में संस्कृति के समय को छोड़कर.

  1. दो मीडिया के पीएच समायोजित करें (Murashige और Skoog [एमएस] बेसल मध्यम और Gamborg के B5 तरल माध्यम) 5.8 autoclaving से पहले (121 डिग्री सेल्सियस, 20 मिनट).
  2. कैंची का उपयोग करके एक बाँझ पत्ती की मध्यम नस के साथ काटें, और फिर एक पेट्री डिश में लगभग 0.3 सेमी x 0.3 सेमी के छोटे टुकड़ों में प्रत्येक आधे को उपविभाजित करें।
  3. बाँझ एक्सप्लांट (छोटे पत्ते के टुकड़े) को एमएस बेसल मीडिया पर रखें जिसमें पौधे के हार्मोन 2,4-डी (1.0 मिलीग्राम एल-1) और केटी (0.1 मिलीग्राम एल-1) होते हैं। छह एक्सप्लांटको 300 एमएल फ्लास्क में रखा जा सकता है जिसमें एमएस बेसल मीडिया के 100 एमएल होते हैं।
  4. ऊपर की पत्ती को अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस के निरंतर तापमान पर एक्सप्लांट ्स्ट करें। 28 दिनों के बाद, प्रेरित कैलस की पहली पीढ़ी का चयन करें और ताजा फ्लास्क (एक उपसंस्कृति) में स्थानांतरित करें। 3 "4 subcultures के बाद ढीला और friable callus प्राप्त करें.

2. चाय सेल निलंबन संस्कृति

  1. बाँझ शर्तों के तहत एक बाँझ शल्य ब्लेड का उपयोग कर (यहाँ 0.5 डिग्री 2 मिमी रेंज) ठोस माध्यम से जोरदार, friable और ढीला calluses कट.
  2. कैलस के छोटे टुकड़ों के बारे में 3 ग्राम वजन. कैलस को 150 एमएल फ्लास्क में रखें जिसमें 20 एमएल बी 5 तरल मीडिया 2,4-डी (1.0 मिलीग्राम एल-1) और केटी (0.1 मिलीग्राम एल-1) के साथ पूरक है।
  3. अंधेरे में 120 आरपीएम पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में एक निरंतर तापमान (25 डिग्री 1 डिग्री सेल्सियस) पर तरल सेल निलंबन को संस्कृति दें।
  4. culturing के 7 से 10 दिनों के बाद, संस्कृति फ्लास्क को हटा दें और उन्हें कुछ मिनट के लिए खड़े हो जाओ.
  5. उपसंस्कृति के लिए बीज सामग्री के रूप में सभी सुपरनेंट को नए माध्यम के लिए लें (निलंबन मां तरल का उपसंस्कृति अनुपात 1:1 और 1:2) के बीच के नए माध्यम तक। वेग से, बड़े calluses निकालें.
  6. 28 दिनों के 3 डिग्री 4 subculture चक्र के बाद अंतिम अच्छी तरह से विकसित सेल निलंबन संस्कृति प्राप्त करें.

3. सेल व्यवहार्यता की त्रिफेनिल टेट्राज़ोलियम क्लोराइड परख

  1. व्यवहार्यता धुंधला से पहले एक नियंत्रण सेल के रूप में 10 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर रहने वाले कोशिकाओं का एक नमूना मार डालो।
  2. सेंट्रीफ्यूज सभी सेल निलंबन संस्कृति के लिए 8 मिनट पर 6000 x ग्राम. 2.5 एमएल फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) बफर (पीएच 7.3) में कोशिकाओं को निलंबित करने से पहले सुपरनेंट निकालें, और इसे हाथ से 1 मिनट के लिए हिलाएं।
  3. 0.4% ट्राइफेनिल टेट्राजोलियम क्लोराइड (टीटीसी) घोल का 2.5 एमएल जोड़ें और फिर से हाथ से हिलाएं।
  4. एक खड़े इनक्यूबेटर (30 डिग्री सेल्सियस) में 1 एच के लिए मिश्रण को इनक्यूबेट करें।

4. कीटनाशकों के साथ चाय सेल निलंबन संस्कृतियों के उपचार और नमूने

  1. कोशिका निलंबन संस्कृतियों में चार नियोनिकोटिनोइड्स (थियामेथोक्सम, एसीटामिप्रिड, इमिडाक्लोप्रिड, और इमिडाक्लोप्रिज) या दो ऑर्गेनोफॉस्फेट (डिमेथोएट और ओमेथोएट) के चार नियोनिकोटिनॉइड्स (500 डिग्री ग्राम एमएल-1)के 400 डिग्री एल के एक एलिकोट जोड़ें। क्रमशः.
    नोट: यदि उद्देश्य विदेशी जीव व्यवहार की तुलना करने के लिए है, सेल निलंबन के एक ही माँ बैच का उपयोग करने के लिए विभिन्न यौगिकों का परीक्षण.
  2. लगातार तापमान (25 डिग्री 1 डिग्री सेल्सियस) पर कीटनाशकों के साथ सेल निलंबन के नमूनों को संस्कृति और इनक्यूबेटर गति (120 आरपीएम) मिलाते हुए। नमूने ले लो (चरण 4.3 या 4.4 देखें) 0, 3, 5 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 और 75 दिन.
  3. एक neonicotinoid युक्त एक नमूने का परीक्षण करने के लिए, सजातीय सेल संस्कृति के एक 1 एमएल alicot निकालें, यह एक 1.5 एमएल प्लास्टिक अपकेंद्रित्र ट्यूब में जगह है, और 2 मिनट के लिए 4000 x ग्राम पर अपकेंद्रण.
    1. उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी-अल्ट्रावायलेट (HPLC-UV) और अल्ट्रा-उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी-क्वारपोल समय-की उड़ान (UPLC-QTOF) बड़े पैमाने पर विश्लेषण से पहले एक 0.22-$m pores आकार फिल्टर झिल्ली के माध्यम से supernatants पास स्पेक्ट्रोमेट्री (सामग्री की तालिका)।
  4. एक organoफॉस्फेट युक्त एक नमूना का परीक्षण करने के लिए, सेल संस्कृति के एक 500 $L alicot निकालें और एक 35 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब या एक 1.5 एमएल प्लास्टिक अपकेंद्रित्र ट्यूब में जगह (नियोनिकोटिनोइड की तरह बाद के नमूने की तैयारी).
    1. 500 एमएल नमूनों की 35 एमएल अपकेंद्रण ट्यूब में 0ण्1 ग्राम सोडियम क्लोराइड और एसीटोन/एथिल ऐसीटेट (3:7, v/v) डालें।
    2. 1 मिनट के लिए मिश्रण भंवर, और फिर उन्हें 10 मिनट के लिए आराम करने के लिए अनुमति देते हैं.
    3. सुपरनेंट के 2.5 एमएल को 10 एमएल कांच की ट्यूब में लें और 40 डिग्री सेल्सियस पर नाइट्रोजन वाष्पित्र का उपयोग करके लगभग सूखापन में वाष्पित हो जाते हैं।
    4. 1 एमएल एसीटोन के साथ अवशेषों को भंग, 1 मिनट के लिए भंवर, गैस क्रोमैटोग्राफी-ज्वाला फोटोमीट्रिक डिटेक्टर (जीसी-एफपीडी) द्वारा विश्लेषण से पहले इसे 0.22-जेडएम फिल्टर झिल्ली के माध्यम से पारित करें।

5. कीटनाशकों के साथ बरकरार चाय संयंत्र के नमूने तैयार

नोट: बरकरार चाय संयंत्र परीक्षण एक पोषक तत्व समाधान के 50 एमएल में उगाया चाय अंकुर का उपयोग कर एक hydroponic प्रणाली में आयोजित किया गया था (30 एनएच4+, 10 नहीं3-, 3.1 पीओ4-, 40 K+, 20 Ca2+, 25 Mg2 +, 0.35 Fe2 +0.1 B 3+, 1.0 Mn2+, 0.1 $n2+, 0.025 Cu2+, 0.05 मो+और 10 अल3+, मिलीग्राम एल-1में )18. एक प्रयोगात्मक ग्रीनहाउस Anhui कृषि विश्वविद्यालय में 20 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रकाश अंधेरे चक्र (12 प्रकाश के और 12 एच अंधेरे) के तहत किया गया था।

  1. 15 दिनों के लिए एक 4 एल प्लास्टिक के बर्तन में पांच पौधों रखो.
  2. प्लास्टिक के बर्तन में थायामेथॉक्सम या डाइमेथोएट के 0 पीपीएम (नियंत्रण) या 100 पीपीएम जोड़ें।
  3. पिछले विधि के अनुसार बरकरार संयंत्र नमूना तैयार, presoaking के लिए छोड़कर19, और फिर एक सटीक जन स्पेक्ट्रम के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ विश्लेषण.

6. साधन विश्लेषण

  1. Neonicotinoids के चयापचय व्यवहार के HPLC विश्लेषण
    1. 254 एनएम की तरंगदैर्ध्य पर थायामेथॉक्सम और एसीटामिप्रिड के सामग्री और चयापचय उत्पादों का पता लगाने के लिए HPLC-UV (सामग्रीकीतालिका) का उपयोग करें, और खंड 4.3 से नमूनों में 270 एनएम पर imidaloprid और imidaclothiz की सामग्री और चयापचय उत्पादों का पता लगाने के लिए।
      नोट: HPLC-यूवी हालत पिछले अध्ययन19के रूप में ही था.
  2. ऑर्गेनोफॉस्फेट के चयापचय व्यवहार का जीसी विश्लेषण
    1. एक चिराल कॉलम (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके जीसी-एफपीडी द्वारा अनुभाग 4-4 से नमूनों में डाइमेथोएट और ओमेथोएट की मात्राकापता लगाएं।
    2. वाहक गैस के रूप में नाइट्रोजन का प्रयोग करें और प्रवाह दर 1.0 एमएल न्यूनतम-1पर निर्धारित करें।
    3. प्रारंभिक तापमान को 120 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें और इसे 5 मिनट तक होल्ड करें। तापमान को 30 डिग्री सेल्सियस-1 पर बढ़ाएं और 3 मिनट के लिए रखें। 10 डिग्री सेल्सियस-1 पर 170 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाएं और 7 मिनट के लिए होल्ड करें। अंत में 30 डिग्री सेल्सियस मिनट-1 पर 210 डिग्री सेल्सियस तक वृद्धि हुई है और फिर 5 मिनट के लिए पकड़।
    4. अलग मोड में 200 डिग्री सेल्सियस के लिए इंजेक्शन तापमान सेट; 250 डिग्री सेल्सियस के लिए डिटेक्टर तापमान सेट करें।
    5. इंजेक्शन की मात्रा को 1 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
  3. सेल संस्कृति में कीटनाशक चयापचयों के UPLC-QTOF विश्लेषण
    1. सेल संस्कृति में कीटनाशकों के चयापचयों का पता लगाने (खंड 4.3 से नमूने) एक C18 स्तंभ के साथ UPLC-QTOF का उपयोग कर (सामग्री कीतालिका).
    2. प्रवाह दर को 0.2 एमएल न्यूनतम-1पर सेट करें। इंजेक्शन की मात्रा को 10 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
    3. नियोनिकोटिनोइड-उपचारित नमूनों के लिए, प्रारंभिक मोबाइल चरण को 85% ए (5 एमएम अमोनियम फोरमेट वाटर) और 15% बी (एसेटोनिट्रिल) पर सेट करें। 10 मिनट से अधिक, मोबाइल चरण बी को 38% तक बढ़ाएं और 1 मिनट से अधिक 15% पर लौटें, 9 मिनट के लिए होल्ड करें।
    4. ऑर्गेनोफॉस्फेट-उपचारित नमूनों के लिए, प्रारंभिक मोबाइल चरण को 55% ए (0.1% फोरमिक एसिड वाटर) और 45% बी (एसेटोनिट्रिल) सेट करें। 5 मिनट से अधिक, मोबाइल चरण बी को 70% तक बढ़ाएं, फिर 0.5 मिनट से अधिक बी के 45% पर लौटें, 2.5 मिनट के लिए होल्ड करें।
    5. QTOF आपरेशन मापदंडों के रूप में इस प्रकार सेट करें: गैस का तापमान, 325 डिग्री सेल्सियस; सुखाने गैस (नाइट्रोजन), 10 एल मिनट-1; म्यान गैस तापमान, 350 डिग्री सेल्सियस; म्यान गैस प्रवाह, 11 एल मिनट-1; केशिका वोल्टता, 4000 वी; नोजल वोल्टेज, 1000 वी; विखंडक वोल्टता, नियोनिकोटिनोइड कीटनाशकों के लिए 100 वी या ऑर्गेनोफॉस्फोरस कीटनाशकों के लिए 110 वी; स्किमर वोल्टता, 65 ट; सकारात्मक आयन मोड में परिचालन.
    6. पूर्ण स्कैन स्पेक्ट्रम के लिए साधन सेट और एमएस /
    7. सटीक द्रव्यमान उपकरणों का उपयोग करके डेटा संसाधित करें; MS/MS एनोटेशन के साथ -साथ साहित्य12,15,20,21,22से कोई मानक उत्पाद ों के साथ चयापचयों का अनुमान लगाना .
  4. बरकरार संयंत्र निकालने में कीटनाशक चयापचयों के UPLC-Orbitrap विश्लेषण
    1. UPLC-Orbitrap मास स्पेक्ट्रोमेट्री (सामग्री की तालिका) का उपयोग कर बरकरार संयंत्र निकालने में कीटनाशकों के चयापचयोंकापता लगाने.
    2. द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री सेट करें (सामग्री की तालिका) आपरेशन पैरामीटर इस प्रकार के रूप में: म्यान गैस दबाव, 35 arb; गैस का तापमान, 300 डिग्री सेल्सियस; नोजल वोल्टेज, 3.5 केवी; केशिका तापमान, 350 डिग्री सेल्सियस।
    3. कोशिका संस्कृति के UPLC-QTOF विश्लेषण के लिए ऊपर (चरण 6.3.3 और 6.3.4) के रूप में elution कार्यक्रमसेट सेट करें।

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Representative Results

खेतों में उगाए गए चाय के पेड़ों से और एक बाँझ वातावरण में इनविट्रो में उगाए गए चाय बागानों से उत्पादित पत्तियों से काटी गई कॉलस को शामिल करने की तुलना एमएस मीडिया पर खेती के 28 दिनों के बाद संदूषण, ब्राउनिंग और प्रेरण द्वारा की गई थी ( चित्र 1A). कैलस की वृद्धि 20, 37, 62 और 90 दिनों की संस्कृति में दर्ज की गई थी (चित्र 1ख)। इन विट्रो-विकसित पत्तियों से प्राप्त कैलस ने खेती के पूरे 90 दिनों के दौरान खेत में उगी पत्तियों से प्राप्त कैलस की तुलना में अधिक जोरदार वृद्धि दिखाई। बाँझ पत्तियों से कैलस चमकीला पीला था, जबकि खेत में उगी पत्तियों से कैलस भूरे रंग का था (चित्र 1 ख)।

की एकाग्रता में 1.0 मिलीग्राम एल-1 की 2,4-डी23, KT की एकाग्रता अनुकूलित किया गया था. पर 0.05 मिलीग्राम एल-1 KT, callus विकास दर धीमी थी, बनावट थोड़ा कॉम्पैक्ट था, और callus रंग में सफेद था (चित्र 2C); पर 0.1 मिलीग्राम एल-1 KT एकाग्रता, callus वृद्धि दर उच्चतम था, अप करने के लिए 61.5% (चित्र 2A), बनावट ढीला था, और रंग पीला था (चित्र 2C); जब KT को 0.5 मिलीग्राम एल-1तक बढ़ा दिया गया था , तो कैलस केंद्र में कॉम्पैक्ट और अनियमित और भूरे रंग का था (चित्र 2C) . केटी एकाग्रता का चयन किया गया था के बाद, 2,4-डी की एकाग्रता आगे अध्ययन किया गया था। 1 मिलीग्राम एल-1 2,4-डी और 0.1 मिलीग्राम एल-1 KT के संयोजन पर, कैलस वृद्धि दर सबसे अधिक थी, 46.9% तक पहुंच गई, और कैलस की उपस्थिति सबसे अच्छा था (चित्र 2B,D)

ठोस माध्यम पर 2द उपकृषि के बाद प्रत्येक उत्पादित पत्ती की सतह का आधे से अधिक भाग कैलस द्वारा आच्छादित होता है (चित्र 3क) 4वीं subculture के बाद, पत्ती वर्गों पूरी तरह से कैलस द्वारा कवर किया गया. 5वें subculture के बाद, callus बनावट तल पर कुछ सफेद और भूरे रंग के धब्बे के साथ कॉम्पैक्ट बनने के लिए शुरू किया.

जब उपकृषि चक्र 21 दिन का था (चित्र 3 ख) कैलस प्रबल था, लेकिन विकास की सबसे बड़ी मात्रा तक नहीं पहुंचा गया था, यह दर्शाता है कि बार-बार उप-कृषि के परिणामस्वरूप कम कैलस राशि होगी। जब subculture चक्र 28 दिन लंबा था, callus जोरदार हो गया था, रंग पीले रंग का था और बनावट ढीला था. 35 दिनों के बाद, callus केंद्र से भूरे रंग के लिए शुरू किया. Callus सबसे खराब स्थिति में था, एक गहरे भूरे रंग के साथ और अब बढ़ रहा है, 42 दिनों में.

कैलस के विकास तथा सेल निलंबन के रंग पर उनके प्रभावों के लिए दो प्रकार के द्रव मीडिया की तुलना की गई (चित्र 4)। संस्कृति तरल की कुल मात्रा के लिए माँ तरल के तीन अलग अलग अनुपात का परीक्षण किया गया. खेती के 75 दिनों के दौरान, कोशिका घनत्व धीरे-धीरे संस्कृतियों में वृद्धि हुई सभी तीन अनुपात में शुरू कर दिया. 40 एमएल ताजा मीडिया (v/v) में 15 ग्राम कोशिकाओं के अनुपात में 40 एमएल (v/v) में 4 g की तुलना में एक ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) मूल्य काफी अधिक है और 40 एमएल (v/v) में 6 g (v/v) (चित्र 5A) प्राप्त हुआ। 28 दिनों के 4 उप-कृषि चक्रों के बाद, बी 5 तरल मीडिया में बाँझ चाय कैलस से एक चाय सेल निलंबन प्रणाली सफलतापूर्वक स्थापित की गई थी (चित्र 6) ।

Figure 1
चित्र 1 : उठाया पत्तियों और बाँझ plantlet पत्तियों से कैलस प्रेरण की तुलना. (क) बागान में उगाए गए चाय संयंत्रों से काटी गई पत्तियों से तथा इनविट्रो विकसित संयंत्रों में बाँझ से उत्पादित पत्तियों से कैलस प्रेरण की तुलना। एक्सप्लांट्स को संदूषण, ब्राउनिंग और कैलस को शामिल करने के लिए मनाया गया। (ख) बागान से प्राप्त चाय के पौधों से प्राप्त पत्तियों के कैलस वृद्धि की तुलना (सेट 1) और इन विट्रो में बंध्याये हुए पौधों (सेट 2) की फोटो अलग-अलग दिनों में थीं: 20 (पैनल एक); 37 (ख); 62 (ग); और 90 (घ) यह आंकड़ा Jiao एट अल24से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : विभिन्न संयंत्र हार्मोन सांद्रता के तहत चाय पत्ती व्युत्पन्न कैलस की वृद्धि दर और विकास की स्थिति. विभिन्न केटी सांद्रता के अंतर्गत चाय-लीफ व्युत्पन्न कैलस की वृद्धि दर (क) और वृद्धि की स्थिति (सी) और 1 मिलीग्राम एल-1 2,4-डी; विभिन्न 2,4-डी सांद्रताओं के अंतर्गत कैलस की वृद्धि दर(बी) और वृद्धि की स्थिति (डी) तथा 0ण्5 मिलीग्राम एल-1 KT. यह आंकड़ा Jiao एट अल24से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : उपकृषि चक्र (ए) की विभिन्न संख्याओं और उपकृषि चक्रों की विभिन्न लंबाई (बी) के बाद कैलसस्थिति। यह आंकड़ा Jiao एट अल24से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : तरल निलंबन संस्कृति प्रणाली में callus विकास पर विभिन्न मीडिया प्रकार का प्रभाव. (A) B5 माध्यम। (बी) एमएस माध्यम। यह आंकड़ा Jiao एट अल24से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 : ऑप्टिकल घनत्व मूल्यों और टीटीसी धुंधला. (क) सेल निलंबन का ओडी680 मूल्य 0 से 75 दिनों के विभिन्न अनुपातों में शुरू हुआ था; (बी) टीटीसी रहने और नियंत्रण कोशिकाओं के धुंधला. यह आंकड़ा Jiao एट अल24से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6 : एक अंधेरे इनक्यूबेटर में लगातार तापमान (25 डिग्री 1 डिग्री सेल्सियस) पर एक चाय सेल निलंबन संस्कृति की स्थापना की प्रक्रिया। पत्ती के बीज निकालना (एक) के स्रोत के रूप में चाय के पौधों की बाँझ संस्कृति ; टी पत्ती एमएस माध्यम पर 2,4-डी (1.0 मिलीग्राम एल-1) और KT (0.1 मिलीग्राम एल-1) (बी) के साथ टीका लगाया ; 28 दिनों के बाद प्रारंभिक सुसंस्कृत कैलस (ग); 28 दिनों के 4 उपसंस्कृति चक्र के बाद सेल निलंबन के लिए उपयुक्त कैलस (डी) शेष चरण एक ही तापमान पर थे लेकिन एक झटकों वाले इनक्यूबेटर में 120 आरपीएम की निरंतर गति से: कैलस ने 7 से 10 दिनों के लिए बी 5 माध्यम में टीका लगाया (ई; सीडेड और बड़े कैलस को हटाने के बाद सीड सेल निलंबन (च; 28 दिनों के 1 चक्र के बाद सेल निलंबन की उपसंस्कृति (छ); 28 दिनों के 3-4 उपसंस्कृति चक्र के बाद परिपक्व सेल निलंबन (ज)। यह आंकड़ा Jiao एट अल24से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 1: चाय सेल निलंबन संस्कृति में और मीडिया (सीके) में 5 डिग्री/एमएल का चयापचय लगातार तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) पर इनक्यूबेट किया गया और 75 दिनों में इनक्यूबेटर गति (120 आरपीएम) मिलाते हुए। थायामेथॉक्सन (ए), इमिडाक्लोप्रिड (बी), एसीटामिप्रिड (सी), इमिडापोरिज (डी), डाइमेथोएट (ई 1) और ओमेथोएट (एफ) (E2) डाइमेथोएट-उपचारित सेल संस्कृति और मीडिया में उत्पादित डाइमेथोएट (ओमेथोएट) के मेटाबोलाइट के समय के साथ उत्पादन। यह आंकड़ा Jiao एट अल24से संशोधित किया गया है. कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए.

पूरक चित्रा 2: अनुपचारित नियंत्रण सेल संस्कृति, थियामेथोक्सम-उपचारित सेल संस्कृति, थायामेथॉक्सम-उपचारित मीडिया (सेल-मुक्त) से अर्क का कुल आयन क्रोमैटोग्राम (टीआईसी) 75 दिनों के बाद। चोटियों 1-5, 7 और 8 thiamethoxam के चयापचयों थे और पीक 6 थाthiatheoxam था (ए); 60 दिनों के बाद डाइमेथोएट-उपचारित सेल संस्कृति, डाइमेथोएट-उपचारित मीडिया (सेल-मुक्त) और अनुपचारित नियंत्रण कोशिकाओं से अर्क के TICs। चोटियों 1 और 2 dimethoate के चयापचयों थे और पीक 3 dimethoate था (बी; थायामेथोक्सम-उपचारित (ऊपरी) और अनुपचारित (कम) अक्षुण्ण पौधों (सी) से अर्क के TICs ; डाइमेथोएट-उपचारित (ऊपरी) और अनुपचारित (कम) अक्षुण्ण पौधों (डी) से अर्क के TICs ; बरकरार पौधों (D1) में टी आर 1.86 मिनट में dimethoate के चयापचय; अनुपचारित पौधों (डी 2) में टीआर 1.86 मिनट पर कोई यौगिकों का पता नहीं चला। यह आंकड़ा Jiao एट अल24से संशोधित किया गया है. कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए.

पूरक चित्र ासान 3: द्वितीयक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री, यू.पी.एल.सी.-क्यूटीओएफ का प्रयोग करते हुए जो संस्कृतियों से प्राप्त होती है (ए) थियामेथोक्सम और (बी) डाइमेथोएट। यह आंकड़ा Jiao एट अल24से संशोधित किया गया है. कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए.

पूरक चित्रा 4: अक्षुण्ण पादप से व्युत्पन्न चोटियों के क्यू-एक्सएक्टिव का प्रयोग करते हुए द्वितीयक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री ( थियामेथोसम (ए1, ए 2 और ए 3) तथा डाइमेथोएट (बी 1 और बी 2)) के साथ उपचारित है। यह आंकड़ा Jiao एट अल24से संशोधित किया गया है. कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए.

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Discussion

यह लेख चाय संयंत्र के ऊतकों में कीटनाशक चयापचय का एक मॉडल स्थापित करने की विस्तृत प्रक्रिया प्रस्तुत करता है, explants के चयन सहित, सेल व्यवहार्यता का निर्धारण, और उच्च चयापचय के साथ एक चाय सेल निलंबन संस्कृति की स्थापना गतिविधि. पादप ऊतक के किसी भी भाग का प्रयोग स्टर्लाइजकिए गए वातावरण में कैलस को आरंभ करने के लिए किया जा सकता है . चाय की पत्तियों को इस अध्ययन में कैलस दीक्षा के लिए चुना गया था, न केवल इसलिए कि पत्ते जमीन के नीचे के हिस्सों की तुलना में कम दूषित होते हैं, बल्कि इसलिए भी कि वे फसल का खाद्य हिस्सा और कीटनाशक आवेदन का मुख्य लक्ष्य हैं।

इस अध्ययन में, क्षेत्र से चुने गए पत्तों से तथा इनविट्रो में उगाए गए एक बाँझ संयंत्र से उत्पादित पत्तियों से कैलास की प्रेरण दर और वृद्धि की स्थिति की तुलना की गई थी। बाँझ पत्तियों में ब्राउनिंग और संदूषण की दर बहुत कम थी और क्षेत्र में विकसित पत्तियों की तुलना में प्रेरण की उच्च दर थी। यह संभावना थी क्योंकि क्षेत्र में विकसित पौधों से पत्ते न केवल इथेनॉल और पारा का उपयोग कर सतह नसबंदी किया, लेकिन यह भी विकास के माहौल में परिवर्तन, जबकि बाँझ पत्तियों एक बाँझ वातावरण में खेती की गई थी और सीधे बिना इस्तेमाल किया जा सकता है अतिरिक्त नसबंदी. इसके अलावा, इन विट्रो-विकसित, बाँझ पौधों से प्राप्त कैलस ने खेती के 90 दिनों के दौरान खेत में उगी पत्तियों की तुलना में अधिक जोरदार वृद्धि दिखाई। बाँझ plantlets से पत्ते चाय callus को शामिल करने के लिए अधिक उपयुक्त थे, न केवल उनके उच्च callus प्रेरण और कम संदूषण दरों की वजह से, लेकिन यह भी क्योंकि कम पूर्व उपचार समय और मौसमी कारकों से स्वतंत्रता.

संस्कृति ढीला और friable callus के लिए, महत्वपूर्ण मानकों, मुख्य रूप से संयंत्र विकास नियामक स्तर और की लंबाई और subculture चक्र की संख्या, अनुकूलित किया जाना चाहिए25. 2,4-डी प्रभावी रूप से कैलस प्रेरण और वृद्धि को बढ़ावा दे सकता है और कैलस संस्कृति26में सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला हार्मोन है। कैलस कल्चर25के लिए उपकृषि समय और उपकृषि चक्र की लंबाई भी महत्वपूर्ण है . प्रत्येक चक्र के 28 दिनों के 2 से 4 subcultures के बाद, callus एक पीले रंग और कोई भूरे रंग के साथ एक ढीला बनावट था. अनुकूलन प्रयोगों ने निर्धारित किया है कि सबसे अच्छा कैलस प्रेरण प्रोटोकॉल एमएस बेसल मीडिया पर बाँझ plantlets से पत्ती explants जगह थी जिसमें 1 मिलीग्राम एल-1 2,4-डी और 0.1 मिलीग्राम एल-1 KT और एक्सप्लांट / कुल 4 उपकृषि चक्र. इस प्रोटोकॉल ढीला और friable callus कि एक सेल निलंबन की दीक्षा के लिए उपयुक्त था शुरू की.

पादप ऊतक संवर्धन में, कैलस वृद्धि के लिए प्रयुक्त ठोस माध्यमका प्रयोग प्रायः सेल निलंबन संस्कृति के लिए तरल रूप में किया जा सकता है। जबकि चाय एमएस बेसल माध्यम में बड़ी मात्रा में पॉलीफेनॉल के रूप में आती है जिसमें अकार्बनिक लवणों की उच्च सांद्रता होती है, जिसके परिणामस्वरूप कैलस ब्राउनिंग27,28होता है। इस अध्ययन में, तरल B5 मीडिया और एमएस मीडिया दोनों का परीक्षण किया गया. औसत वृद्धि दर दो संस्कृतियों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर पाया गया (16.66% B5 बेसल मीडिया में और 15.77% एमएस बेसल मीडिया में; चित्र 4) . हालांकि, कॉलएमएस बेसल मीडिया में भूरे रंग के थे। इसलिए, प्रस्तावित पद्धति में बी 5 बेसल मीडिया का चयन किया गया था।

ऑक्सीजन सेल विकास और चयापचय संयंत्र के लिए महत्वपूर्ण है. तरल संस्कृति में, तरल की अत्यधिक मात्रा ऑक्सीजन एकाग्रता को कम करने और सेल विकास को बाधित करेगा, जबकि बहुत कम तरल भी सेल विकास को रोकताहै 25. तरल के कई अनुपातों से फ्लास्क वॉल्यूम (एमएल तरल: एमएल फ्लास्क) का परीक्षण किया गया। 21 घ के बाद सेल विकास के शुष्क वजन के आधार पर, तरल: फ्लास्क अनुपात निम्नानुसार रैंक किया गया: 30:150 और 40:150 और 20:150, 50:150, 60:150 (एमएल: एमएल)23. इस अध्ययन में, संस्कृति तरल के 40 एमएल एक 150 एमएल फ्लास्क (40 एमएल: 150 एमएल) में रखा गया था कि कैसे सेल निलंबन नग्न आंखों से मनाया के रूप में देखा के अनुसार चुना गया था।

संयंत्र कोशिकाओं को अच्छी तरह से विकसित नहीं कर सकते जब सेल घनत्व बहुत अधिक या बहुत कम है. इस प्रकार, उपकृषि के समय नए माध्यम में मातृ कोशिका निलंबन संस्कृति का अनुपातकोशिकाओं कीवृद्धि क्षमता को प्रभावित करता है 29 . इस अध्ययन में सजातीय कोशिका निलंबन संस्कृति के ओडी मान का उपयोग कोशिका वृद्धि की मात्रा का प्रतिनिधित्व करने के लिए किया गया था। संस्कृति तरल की कुल मात्रा के 40 एमएल में माँ तरल के 15 ग्राम के साथ टीका (v/v) सेल विकास के लिए उपयुक्त था। उपसंस्कृति अनुपात 1:1 और 1:2 (निलंबन माँ तरल: ताजा माध्यम) के बीच के बराबर था।

टीटीसी धुंधला द्वारा चाय सेल निलंबन संस्कृति के भीतर सेल व्यवहार्यता का परीक्षण किया गया था। बेरंग टीटीसी यौगिक जीवित कोशिकाओं के mitochondria में dehydrogenases द्वारा लाल रंग formazan में परिवर्तित किया जा सकता है, लेकिन रंग मृत कोशिकाओं से नहीं बदला जा सकता है (चित्र 5B) . इस विधि तरल संस्कृति में कोशिकाओं की वृद्धि की स्थिति सत्यापित.

एक चाय सेल निलंबन संस्कृति की स्थापना चयापचय और विभिन्न कीटनाशकों के चयापचयों का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो अनुसंधान मंच में एक आसान प्रदान करता है. मौसम और मौसम के स्वतंत्र, सेल निलंबन संस्कृतियों विभिन्न कीटनाशकों, सक्रिय संघटक के विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया जा सकता है, और समय की विभिन्न लंबाई के लिए. चाय सेल निलंबन संस्कृतियों में उत्पादित चयापचयों बरकरार पौधों से निकाले गए उन लोगों के समान थे (पूरक चित्र 1 और पूरक चित्र 2) . दिलचस्प बात यह है कि चाय सेल निलंबन संस्कृति में थियामेथोक्सम के सात चयापचयों और डाइमेथोएट के दो चयापचयों का पता लगाया गया था, लेकिन थायामेथोक्सम के केवल दो चयापचयों और उपचारित अक्षुण्ण पौधों में डाइमेथोएट के लिए एक (पूरकचित्रा 1, अनुपूरक चित्र 2, और पूरक चित्र 3) । यह मोमी क्यूटिकल के बिना कोशिकाओं से आसान निष्कर्षण की वजह से हो सकता है, चाय से कम यौगिकों बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री परिणाम (मैट्रिक्स प्रभाव) के साथ हस्तक्षेप, या पूरे संयंत्र की तुलना में चाय कोशिकाओं के सरल चयापचय प्रोफ़ाइल.

परिणामों से पता चला कि अन्य तीन नियोनिकोटिनोइडकीकी की तुलना में चाय सेल द्वारा थायामेथोक्सम को अधिक आसानी से चयापचय किया गया था (पूरक चित्र 4)। ऑर्गेनोफॉस्फेट (डिमेथोएट और ओमेथोएट) दोनों को नियोनिकोटिनोइड्स की तुलना में तेजी से चयापचय किया गया था। ये परिणाम चयापचय रास्ते और चाय सेल में चयापचय विनियमन की विविधता दिखाते हैं, जिसका आगे अध्ययन किए जाने की आवश्यकता है।

कीटनाशक चयापचय का अध्ययन करने के लिए और कीटनाशक चयापचयों की पहचान करने के लिए बरकरार पौधों का उपयोग करने से कई कठिनाइयों को प्रस्तुत करता है, जिसमें पौधे के भीतर प्रारंभिक और टूटने वाले यौगिकों दोनों के अवशोषण और लंबी दूरी के परिवहन के लिए बाधाएं शामिल हैं30. सेल निलंबन संस्कृतियों न केवल इस समस्या को हल कर सकता है, लेकिन यह भी ताजा पत्तियों से निकालने की तुलना में नमूना विश्लेषण में मैट्रिक्स हस्तक्षेप को कम24. इस शोध ने साबित कर दिया कि चाय सेल निलंबन संस्कृतियों चाय संयंत्र में विदेशी जीवविज्ञान यौगिकों के चयापचय का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी मंच हैं. यह अन्य पौधों में विदेशी जीवों के चयापचय का अध्ययन करने के लिए एक विधा के रूप में कार्य किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2016YFD0200900) द्वारा समर्थित किया गया था, चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक वैज्ञानिक फाउंडेशन (नहीं 31772076 और नहीं 31270728), चीन पोस्टडॉक्टोरल साइंस फाउंडेशन (2018M630700), और ओपन फंड के चाय संयंत्र जीव विज्ञान और उपयोग की राज्य कुंजी प्रयोगशाला (SKLTOF20180111).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetamiprid (99.8%) Dr. Ehrenstorfer 46717 CAS No: 135410-20-7
Acetonitrile (CAN, 99.9%) Tedia AS1122-801 CAS No: 75-05-8
Agar Solarbio Science & Technology A8190 CAS No: 9002-18-0
Clothianidin (99.8%) Dr. Ehrenstorfer 525 CAS No: 210880-92-5
Dimethoate (98.5%) Dr. Ehrenstorfer 109217 CAS No: 60-51-5
Imidacloprid (99.8%) Dr. Ehrenstorfer 91029 CAS No: 138261-41-3
Imidaclothiz (99.5%) Toronto Research Chemical I275000 CAS No: 105843-36-5
Kinetin (KT, >98.0%) Solarbio Science & Technology K8010 CAS No: 525-79-1
Omethoate (98.5%) Dr. Ehrenstorfer 105491 CAS No: 1113-02-6
Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) Solarbio Science & Technology P8070 CAS No: 25249-54-1
Sucrose Tocris Bioscience 5511 CAS No: 57-50-1
Thiamethoxam (99.8%) Dr. Ehrenstorfer 20625 CAS No: 153719-23-4
Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%) Solarbio Science & Technology T8170 CAS No: 298-96-4
2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%) Guangzhou Saiguo Biotech D8100 CAS No: 94-75-7
chiral column Agilent CYCLOSIL-B 112-6632 Chromatography column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)
Gas chromatography (GC) Shimadu 2010-Plus Paired with Flame Photometric Detector (FPD)  
High-performance liquid chromatography (HPLC) Agilent 1260 Paired with Ultraviolet detector (UV)
HSS T3 C18 column Waters 186003539 Chromatography column (100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm)
Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) Agilent 1290-6545 Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF)
Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) Thermo Scientific Ultimate 3000-Q Exactive Focus Connected to a Orbitrap mass spectrometer

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चाय से व्युत्पन्न एक नव स्थापित सेल निलंबन संस्कृति में छह प्रणालीगत कीटनाशक के चयापचय पर अध्ययन<em>(कैमेलिया Sinensis </em>एल.) पत्ते
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Jiao, W., Ge, G., Hua, R., Sun, J., Li, Y., Hou, R. Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves. J. Vis. Exp. (148), e59312, doi:10.3791/59312 (2019).

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