Summary
Diese Arbeit präsentiert ein Protokoll zur Etablierung einer Zellsuspensionskultur aus Tee (Camellia sinensis L.) Blätter, die verwendet werden können, um den Stoffwechsel von externen Verbindungen zu studieren, die von der ganzen Pflanze aufgenommen werden können, wie Insektizide.
Abstract
Es wurde eine Plattform zur Untersuchung des Insektizidstoffwechsels mit In-vitro-Geweben von Teepflanzen entwickelt. Blätter aus sterilen Teepflanzen wurden dazu induziert, lose Callus auf Murashige und Skoog (MS) Basalmedien mit den Pflanzenhormonen 2,4-Dichlorophenoxyessigsäure (2,4-D, 1,0 mg L-1) und Kinetin (KT, 0,1 mg L-1) zu bilden. Callus gebildet nach 3 oder 4 Runden Subkulierung, jede Dauer von 28 Tagen. Loser Callus (ca. 3 g) wurde dann in Flüssigmedien b5 geimpft, die die gleichen Pflanzenhormone enthielten, und in einem Schüttelinkubator (120 Umdrehungen pro Minute) im Dunkeln bei 25 °C bei 1 °C kultiviert. Nach 3-4 Subkulturen wurde eine aus DemTeeblatt gewonnene Zellsuspension in einem Subkulturverhältnis zwischen 1:1 und 1:2 (Suspensionsmutterflüssigkeit: frisches Medium) festgestellt. Auf dieser Plattform wurden sechs Insektizide (5 g ml-1 pro Thiamethoxam, Imidacloprid, Acetamiprid, Imidaclothiz, Dimethoat und Omethoat) in die von Teeblättern abgeleitete Zellsuspensionskultur aufgenommen. Der Stoffwechsel der Insektizide wurde mittels Flüssigchromatographie und Gaschromatographie verfolgt. Um die Nützlichkeit der Suspensionskultur der Teezellen zu validieren, wurden die Metaboliten von Thiamethoxan und Dimethoat in behandelten Zellkulturen und intakten Pflanzen mittels Massenspektrometrie verglichen. In behandelten Teezellkulturen wurden sieben Metaboliten von Thiamethoxan und zwei Metaboliten von Dimethoat gefunden, während in behandelten intakten Pflanzen nur zwei Metaboliten von Thiamethoxam und einer von Dimethoat gefunden wurden. Die Verwendung einer Zellsuspension vereinfachte die metabolische Analyse im Vergleich zur Verwendung intakter Teepflanzen, insbesondere für eine schwierige Matrix wie Tee.
Introduction
Tee ist eines der am häufigsten konsumierten alkoholfreien Getränke der Welt1,2. Tee wird aus den Blättern und Knospen der holzigen mehrjährigen Camellia sinensis L. Teepflanzen werden in riesigen Plantagen angebaut und sind anfällig für zahlreiche Insektenschädlinge3,4. Organophosphor und neonicotinoide Insektizide werden oft als systemische Insektizide5 verwendet, um Teepflanzen vor Schädlingen wie Weißfliegen, Blatttrichtern und einigen lepidopteranartenArten zuschützen 6,7. Nach der Anwendung werden diese Insektizide absorbiert oder in die Pflanze übertragen. Innerhalb der Pflanze können diese systemischen Insektizide durch Hydrolyse, Oxidation oder Reduktionsreaktionen durch Pflanzenenzyme transformiert werden. Diese Transformationsprodukte können polarer und weniger toxisch sein als die Ausgangsverbindungen. Bei einigen Organophosphaten sind die Bioaktivitäten einiger Produkte jedoch höher. Zum Beispiel wird Acephat in die giftigeren Methamidophos8,9, und Dimethoat in Omethoat10,11metabolisiert. Pflanzenstoffwechselstudien sind daher wichtig, um das Schicksal eines Pestizids innerhalb einer Pflanze zu bestimmen12.
Pflanzengewebekulturen haben sich als nützliche Plattform für die Untersuchung des Pestizidstoffwechsels erwiesen, mit den identifizierten Metaboliten ähnlich denen in intakten Pflanzengefunden 13,14,15. Die Verwendung von Gewebekulturen, insbesondere Zellsuspensionskulturen, hat mehrere Vorteile. Erstens können Experimente frei von Mikroorganismen durchgeführt werden, wodurch die Interferenz der Pestizidumwandlung oder des Abbaus durch Mikroben vermieden wird. Zweitens bietet die Gewebekultur jederzeit konsistente Materialien für den Einsatz. Drittens sind die Metaboliten leichter aus Gewebekulturen zu extrahieren als aus intakten Pflanzen, und Gewebekulturen haben oft weniger zwischenende Verbindungen und eine geringere Komplexität von Verbindungen. Schließlich können Gewebekulturen leichter verwendet werden, um eine Reihe von Pestizidstoffwechsel in einem einzigen Experiment16zu vergleichen 16 .
In dieser Studie wurde eine Zellsuspension, die aus den Blättern steril angebauter Teepflanzelet gewonnen wurde, erfolgreich etabliert. Die Teezellensuspensionskultur wurde dann verwendet, um das Ableitungsverhalten von sechs systemischen Insektiziden zu vergleichen.
Dieses detaillierte Protokoll soll einige Anleitungen bieten, so dass Forscher eine Pflanzengewebekultur-Plattform einrichten können, die nützlich ist, um das metabolische Schicksal von Xenobiotika im Tee zu untersuchen.
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Protocol
1. Tee-Callus-Kultur
HINWEIS: Sterile Blätter wurden aus in vitro angebauten Plantletlinien gewonnen, die zuerst in der Forschungsgruppe17entwickelt wurden. Alle Eingriffe bis Abschnitt 5 wurden in einer sterilen laminaren Durchflusshaube durchgeführt, mit Ausnahme der Kulturzeit in einem Inkubator.
- Stellen Sie den pH-Wert der beiden Medien (Murashige und Skoog [MS] Basalmedium und Gamborgs flüssiges Medium B5) vor dem Autoklavieren auf 5,8 ein (121 °C, 20 min).
- Mit einer Schere entlang der mittleren Vene eines sterilen Blattes schneiden und dann jede Hälfte in kleine Stücke von etwa 0,3 cm x 0,3 cm in einer Petrischale unterteilen.
- Legen Sie die sterilen Explants (die kleinen Blattstücke) auf MS-Basalmedien, die die Pflanzenhormone 2,4-D (1,0 mg L-1) und KT (0,1 mg L-1) enthalten. Sechs Explanten können in einen 300 ml-Kolben mit 100 ml MS-Basalmedien gelegt werden.
- Kultur die oben genannten Blatt explantiert bei einer konstanten Temperatur von 25 °C im Dunkeln. Nach 28 Tagen wählen Sie die erste Generation des induzierten Callus und übertragen Sie auf frischen Kolben (eine Subkultur). Erwerben Sie den lockeren und friablen Callus nach 3-4 Subkulturen.
2. Teezellensuspensionskultur
- Schneiden Sie die kräftigen, zerbrechlichen und lockeren Callusen aus dem festen Medium mit einer sterilen Klinge unter sterilen Bedingungen in kleine Stücke (Bereich hier 0,5 x 2 mm).
- Wiegen Sie ca. 3 g der kleinen Stücke von Callus. Legen Sie den Callus in einen 150 ml Kolben mit 20 ml Flüssigmedien B5, ergänzt durch 2,4-D (1,0 mg L-1) und KT (0,1 mg L-1).
- Die Flüssigzellsuspension bei konstanter Temperatur (25 x 1 °C) in einem Schüttelinkubator bei 120 Umdrehungen pro Minute im Dunkeln anseln.
- Nach 7 bis 10 Tagen Kultivierung die Kulturkolben entfernen und für ein paar Minuten stehen lassen.
- Nehmen Sie alle Überstand als Ausgangsmaterial für Subkultur zu frischem Medium (SubkulturVerhältnis von Suspension Mutterflüssigkeit zu frischen mittleren Bereich zwischen 1:1 und 1:2). Entfernen Sie die gefällten, großen Calluses.
- Erhalten Sie die letzte gut gewachsene Zellsuspensionskultur nach 3-4 Subkulturzyklen von jeweils 28 Tagen.
3. Triphenyltetrazoliumchlorid-Assay der Zelllebensfähigkeit
- Töten Sie eine Probe von lebenden Zellen bei 100 °C für 10 min als Kontrollzelle, bevor die Lebensfähigkeit färbung.
- Zentrifuge alle Zellsuspensionskultur für 8 min bei 6000 x g. Entfernen Sie den Überstand, bevor Sie die Zellen in 2,5 ml Phosphat-gepufferter Saline(PBS) Puffer (pH 7.3) aussetzen, und schütteln Sie ihn 1 min von Hand.
- 2,5 ml der 0,4%Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-Lösung hinzufügen und wieder von Hand schütteln.
- Inkubieren Sie die Mischung für 1 h in einem stehenden Inkubator (30 °C).
4. Behandlung und Probenahme von Teezellensuspensionskulturen mit Insektiziden
- Fügen Sie den Zellsuspensionskulturen ein Aliquot von 400 l filtersterilisierter Stofflösung (500 g ml-1) von vier Neonicotinoiden (Thiamethoxam, Acetamiprid, Imidacloprid und Imidaclothiz) oder zwei Organophosphate (Dimethoat und Omethoat) hinzu. in dieser reihenfolge.
HINWEIS: Wenn das Ziel darin besteht, xenobiotische Verhaltensweisen zu vergleichen, verwenden Sie dieselbe Muttercharge von Zellsuspensionen, um die verschiedenen Verbindungen zu testen. - Die Proben von Zellsuspensionen mit Insektiziden bei konstanter Temperatur (25 x 1 °C) und Schüttelinkubatorgeschwindigkeit (120 Rpm) kulturieren. Nehmen Sie die Proben (siehe Schritt 4.3 oder 4.4) an 0, 3, 5 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 und 75 Tagen.
- Um eine Probe mit einem Neonicotinoid zu testen, entfernen Sie ein 1 ml Aliquot der homogenen Zellkultur, legen Sie es in ein 1,5 ml Kunststoffzentrifugenrohr und Zentrifuge bei 4000 x g für 2 min.
- Übergeben Sie die Überstände vor der Analyse durch eine 0,22-m Poren-Filtermembran durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Ultraviolett (HPLC-UV) und Ultrahochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Quadrupol-Zeit-des-Fluges (UPLC-QTOF) Masse Spektrometrie (Materialtabelle).
- Um eine Probe zu testen, die ein Organophosphat enthält, entfernen Sie ein 500 L Aliquot der Zellkultur und legen Sie es in ein 35 ml Zentrifugenrohr oder ein 1,5 ml Kunststoffzentrifugenrohr (bereiten Sie die letztere Probe wie die von Neonicotinoid).
- 0,1 g Natriumchlorid und 5 ml Aceton/Ethylacetat (3:7, v/v) in das 35 ml Zentrifugenrohr der 500 l Proben geben.
- Wirbeln Sie die Mischungen für 1 min, und lassen Sie sie dann für 10 min ruhen.
- 2,5 ml des Überstandes in ein 10 ml Glasrohr geben und mit einem Stickstoffverdampfer bei 40 °C nahezu trocken verdampfen.
- Lösen Sie den Rückstand mit 1 ml Aceton, Wirbel für 1 min, durch eine 0,22-m-Filtermembran vor der Analyse durch Gaschromatographie-Flammen-Photometriedetektor (GC-FPD).
5. Probenvorbereitung intakter Teepflanze mit Insektiziden
ANMERKUNG: Die testte für intakte Teepflanzen wurde in einem hydroponischen System mit Teesämlingen durchgeführt, die in 50 ml einer Nährlösung (30 NH4+, 10 NO3-, 3.1 PO4-, 40 K+, 20 Ca2+, 25 Mg2+, 0.35 Fe2+, 0.1 B 3+, 1.0 Mn2+, 0.1 Zn2+, 0.025 Cu2+, 0.05 Mo+, und 10 Al3+, in mg L-1)18. Ein experimentelles Gewächshaus befand sich bei 20 °C an der Anhui Agricultural University in einem hellen und dunklen Zyklus (12 h Licht und 12 h Dunkelheit).
- Legen Sie fünf Pflanzen in einen 4 L Kunststofftopf für 15 Tage.
- 0 ppm (Steuerung) bzw. 100 ppm Thiamethoxam oder Dimethoat in Plastiktöpfe geben.
- Bereiten Sie die intakte Pflanzenprobe nach der vorherigen Methode vor, mit Ausnahme des Voreinweichens19, und analysieren Sie dann mit Massenspektrometrie auf ein genaues Massenspektrum.
6. Instrumentenanalyse
-
HPLC-Analyse des Stoffwechselverhaltens von Neonicotinoiden
- Verwenden Sie ein HPLC-UV (Materialtabelle) , um den Inhalt und die Stoffwechselprodukte von Thiamethoxam und Acetamiprid bei einer Wellenlänge von 254 nm sowie von Imidacloprid und Imidaclothiz bei 270 nm in Proben aus Abschnitt 4.3 zu detektieren.
HINWEIS: Der HPLC-UV-Zustand war derselbe wie in der vorherigen Studie19.
- Verwenden Sie ein HPLC-UV (Materialtabelle) , um den Inhalt und die Stoffwechselprodukte von Thiamethoxam und Acetamiprid bei einer Wellenlänge von 254 nm sowie von Imidacloprid und Imidaclothiz bei 270 nm in Proben aus Abschnitt 4.3 zu detektieren.
-
GC-Analyse des Stoffwechselverhaltens von Organophosphaten
- Erkennen Sie den Gehalt an Dimethoat und Omethoat in Proben aus Abschnitt 4.4 durch eine GC-FPD mit einer chiralen Spalte (Materialtabelle).
- Verwenden Sie Stickstoff als Trägergas und stellen Sie den Durchfluss auf 1,0 ml min-1ein.
- Stellen Sie die Anfangstemperatur auf 120 °C ein und halten Sie sie 5 min. Erhöhen Sie die Temperatur auf 150 °C bei 30 °C min-1 und halten Sie 3 min. Erhöhen Sie auf 170 °C bei 10 °C min-1 und halten Sie 7 min. Zum Schluss bei 30 °C min-1 auf 210 °C anerhöhen und dann 5 min halten.
- Stellen Sie die Einspritztemperatur im splitless-Modus auf 200 °C ein; Stellen Sie die Detektortemperatur auf 250 °C ein.
- Stellen Sie das Injektionsvolumen auf 1 L ein.
-
UPLC-QTOF Analyse der Insektizidmetaboliten in der Zellkultur
- Mit UPLC-QTOF mit einer C18-Spalte (Materialtabelle) können die Metaboliten der Insektizide in der Zellkultur (Proben aus Abschnitt 4.3) erkannt werden.
- Stellen Sie den Durchfluss auf 0,2 ml min-1ein. Stellen Sie das Injektionsvolumen auf 10 l ein.
- Für die mit Neonicotinoid behandelten Proben die erste mobile Phase auf 85% A (5 mM Ammoniumformatwasser) und 15% B (Acetonitril) einstellen. Über 10 min, erhöhen mobile Phase B auf 38% und Rückkehr auf 15% über 1 min, halten für 9 min.
- Für die organophosphatbehandelten Proben die erste mobile Phase auf 55% A (0,1% Ameisensäurewasser) und 45% B (Acetonitril) einstellen. Über 5 min, erhöhen Sie die mobile Phase B auf 70%, dann kehren Sie zu 45% von B über 0,5 min zurück, halten Sie für 2,5 min.
- Stellen Sie die QTOF-Betriebsparameter wie folgt ein: Gastemperatur, 325 °C; Trocknungsgas (Stickstoff), 10 L min-1; Mantelgastemperatur, 350 °C; Mantelgasdurchfluss, 11 L min-1; Kapillarspannung, 4000 V; Düsenspannung, 1000 V; Fragmentorspannung, 100 V für neonicotinoide Insektizide oder 110 V für Organophosphor-Insektizide; Abschäumerspannung, 65 V; im positiven Ionenmodus.
- Stellen Sie das Gerät auf das volle Scanspektrum und den Ziel-MS/MS-Modus ein.
- Verarbeiten der Daten mit genauen Massenwerkzeugen; Schließen Sie die Metaboliten ohne Standardprodukte aus der MS/MS-Anmerkung sowie die Literatur12,15,20,21,22ab.
-
UPLC-Orbitrap-Analyse der Insektizidmetaboliten in intaktem Pflanzenextrakt
- Nachweis der Metaboliten von Insektiziden in intaktem Pflanzenextrakt mit UpLC-Orbitrap-Massenspektrometrie (Materialtabelle).
- Stellen Sie die Betriebsparameter für die Massenspektrometrie (Tabelle der Materialien) wie folgt ein: Mantelgasdruck, 35 arb; Gastemperatur, 300 °C; Düsenspannung, 3,5 KV; Kapillartemperatur, 350 °C.
- Legen Sie die Elutionsprogramme als oben beschrieben fest (Schritte 6.3.3 und 6.3.4) für die UPLC-QTOF-Analyse der Zellkultur.
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Representative Results
Die Induktion von Callus aus Blättern, die von Feldteebäumen geerntet wurden, und von Blättern, die aus in vitro in einer sterilen Umgebung angebauten Teepflanzen entnommen wurden, wurde durch Messung von Kontamination, Bräunung und Induktion nach 28 Tagen Anbau auf MS-Medien verglichen ( Abbildung 1A). Das Calluswachstum wurde bei 20, 37, 62 und 90 Tagen Kultur registriert (Abbildung 1B). Der aus den in vitro gewachsenen Blättern abgeleitete Callus zeigte während der gesamten 90 Tage des Anbaus ein kräftigeres Wachstum als der Von den Feldwuchs gewonnene Callus. Der Callus der sterilen Blätter war hellgelb, während der Callus aus den feldgewachsenen Blättern braun war (Abbildung 1B).
Bei einer Konzentration von 1,0 mg L-1 von 2,4-D23wurde die KT-Konzentration optimiert. Bei 0,05 mg L-1 KT war die Calluswachstumsrate langsam, die Textur etwas kompakt und der Callus war weiß in der Farbe (Abbildung2C); mit 0,1 mg L-1 KT-Konzentration war die Calluswachstumsrate mit bis zu 61,5 % die höchste (Abbildung 2A), die Textur war locker und die Farbe gelblich (Abbildung2C); als der KT auf 0,5 mg L-1erhöht wurde, war der Callus kompakt und unregelmäßig und braun in der Mitte (Abbildung2C). Nach der Auswahl der KT-Konzentration wurde die Konzentration von 2,4 D weiter untersucht. Bei einer Kombination von 1 mg L-1 2,4-D und 0,1 mg L-1 KT war die Calluswachstumsrate mit 46,9% die höchste, und das Aussehen des Callus war das beste (Abbildung2B,D).
Nach der 2. Subkultur auf festen Medien wurde mehr als die Hälfte der Oberfläche jedes ausgeschnittenen Blattes durch wachsenden Callus abgedeckt (Abbildung 3A). Nach der 4. Subkultur wurden die Blattabschnitte vollständig vom Callus abgedeckt. Nach der 5. Subkultur begann die Callustextur mit einigen weißen und braunen Flecken auf dem Boden kompakt zu werden.
Wenn der Subkulturzyklus 21 Tage lang war (Abbildung3B), war der Callus kräftig, aber das größte Wachstum war nicht erreicht worden, was darauf hindeutet, dass häufige Subkulturen zu weniger Callusmenge führen würden. Als der Subkulturzyklus 28 Tage lang war, war der Callus kräftig gewachsen, die Farbe war gelblich und die Textur war locker. Nach 35 Tagen begann der Callus aus dem Zentrum zu bräunen. Der Callus war im schlechtesten Zustand, mit einer tiefbraunen Farbe und wuchs nicht mehr, mit 42 Tagen.
Zwei Arten von flüssigen Medien wurden für ihre Auswirkungen auf das Wachstum des Callus und die Farbe der Zellsuspension verglichen (Abbildung 4). Es wurden drei verschiedene Verhältnisse von Mutterflüssigkeit zum Gesamtvolumen der Kulturflüssigkeit getestet. Während der 75 Tage der Kultivierung nahm die Zelldichte in den Kulturen allmählich zu, begann mit allen drei Verhältnissen. Das Verhältnis von 15 g Zellen in 40 ml Frischmedien (v/v) ergab einen optischen Dichtewert (OD) deutlich höher als der von 4 g in 40 ml (v/v) und 6 g in 40 ml (v/v) (Abbildung 5A). Nach 4 Subkulturzyklen von jeweils 28 Tagen wurde erfolgreich ein Teezellensuspensionssystem aus sterilem Tee-Callus in Flüssigmedien B5 hergestellt (Abbildung 6).
Abbildung 1 : Vergleich der Callusinduktion aus gepflückten Blättern und sterilen Pflanzenblättern. (A) Vergleich der Callusinduktion aus Blättern, die aus plantagengewachsenen Teepflanzen geerntet wurden, und aus Blättern, die aus sterilen, in vitro angebauten Pflanzen stammen. Explanten wurden bei Kontamination, Bräunung und Induktion von Callus beobachtet. (B) Vergleich des Calluswachstums von Blättern aus Plantagen angebauten Teepflanzen (Set 1) und sterilen in vitro angebauten Pflanzen (Set 2): Fotos waren an verschiedenen Tagen: 20 (Platten a); 37 (b); 62 (c); und 90 (d). Diese Zahl wurde von Jiao et al.24geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Die Wachstumsrate und der Wachstumsstatus von Teeblatt abgeleitet callus unter verschiedenen Pflanzenhormonkonzentrationen. Die Wachstumsrate (A) und der Wachstumsstatus (C) des von Teeblättern abgeleiteten Callus unter verschiedenen KT-Konzentrationen und 1 mg L-1 2,4-D; Die Wachstumsrate (B) und der Wachstumsstatus (D) von Callus unter verschiedenen 2,4-D-Konzentrationen und 0,5 mg L-1 KT. Diese Zahl wurde von Jiao et al.24geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : Callusstatus nach unterschiedlicher Anzahl von Subkulturzyklen (A) und unterschiedlichen Längen von Subkulturzyklen (B). Diese Zahl wurde von Jiao et al.24geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4 : Einfluss verschiedener Medientypen auf das Calluswachstum im flüssigen Suspensionskultursystem. (A) B5 mittel. (B) MS medium. Diese Zahl wurde von Jiao et al.24geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5 : Die optischen Dichtewerte und die TTC-Färbung. (A) Der OD680-Wert der Zellsuspension begann mit unterschiedlichen Verhältnissen von 0 bis 75 Tagen; (B) Die TTC-Färbung von lebenden und Kontrollzellen. Diese Zahl wurde von Jiao et al.24geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6 : Der Prozess der Etablierung einer Teezellensuspensionskultur bei konstanter Temperatur (25 x 1 °C) in einem dunklen Inkubator. Sterile Kultur von Tee-Pflanzen als Quelle der Blattexplantation (a); Teeblatt auf MS-Medium geimpft mit 2,4-D (1,0 mg L-1) und KT (0,1 mg L-1) (b); Ursprünglich kultivierter Callus nach 28 Tagen (c); Callus geeignet für Zellsuspension nach 4 Subkulturzyklen von je 28 Tagen (d); Die übrigen Schritte waren bei der gleichen Temperatur, aber bei einer konstanten Geschwindigkeit von 120 Rpm in einem Schüttel-Inkubator: Callus in B5 Medium für 7 bis 10 Tage geimpft (e); Samenzellsuspension nach Entfernen des gefällten und großen Callus (f); Die Subkultur der Zellsuspension nach 1 Zyklus von 28 Tagen (g); Reife Zellsuspension nach 3-4 Subkulturzyklen von je 28 Tagen (h). Diese Zahl wurde von Jiao et al.24geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Der Metabolismus von 5 g/ml von 6 Insektiziden in der Suspensionskultur von Teezellen und in Medien (CK), die bei konstanter Temperatur (25 x 1 °C) und einer Schüttelleitergeschwindigkeit (120 Rpm) über 75 Tage inkubiert werden. Thiamethoxan (A), imidacloprid (B), acetamiprid (C), imidaclothiz (D), dimethoate (E1), and omethoate (F); (E2) Produktion im Laufe der Zeit des Metaboliten von Dimethoat (Omethoat), das in Dimethoat-behandelter Zellkultur und Medien hergestellt wird. Diese Zahl wurde von Jiao et al.24geändert. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Gesamtionenchromatogramme (TICs) der Extrakte aus unbehandelter Kontrollzellkultur, Thiamethoxam-behandelter Zellkultur, thiamethoxam-behandelten Medien (zellfrei) nach 75 Tagen. Die Peaks 1-5, 7 und 8 waren Metaboliten von Thiamethoxam und Peak 6 war Thiamethoxam (A); TICs der Extrakte aus dimethoatbehandelter Zellkultur, dimethoatbehandelten Medien (zellfrei) und unbehandelten Kontrollzellen nach 60 Tagen. Die Peaks 1 und 2 waren Metaboliten von Dimethoat und Peak 3 war Dimethoat (B); TICs der Extrakte aus Thiamethoxam-behandelten (oberen) und unbehandelten (unteren) intakten Pflanzen (C); TICs der Extrakte aus dimethoat behandelten (oberen) und unbehandelten (unteren) intakten Pflanzen (D); Der Metabolit von Dimethoat bei tR 1,86 min in intakten Pflanzen (D1); Bei tR 1,86 min in unbehandelten Pflanzen (D2) wurden keine Verbindungen nachgewiesen. Diese Zahl wurde von Jiao et al.24geändert. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 3: Die sekundäre Massenspektrometrie mit UPLC-QTOF von Spitzen, die aus Kulturen stammen, die mit (A) Thiamethoxam und (B) Dimethoat behandelt wurden. Diese Zahl wurde von Jiao et al.24geändert. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 4: Die sekundäre Massenspektrometrie mit Q-Exactive von Spitzen, die aus intakten Pflanzen abgeleitet wurden, die mit Thiamethoxam (A1, A2 und A3) und Dimethoat (B1 und B2) behandelt wurden. Diese Zahl wurde von Jiao et al.24geändert. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
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Discussion
Dieser Artikel stellt den detaillierten Prozess der Etablierung eines Modells des Pestizidstoffwechsels in Teepflanzengewebe, einschließlich der Auswahl von Expflanzen, die Bestimmung der Zelllebensfähigkeit, und die Etablierung einer Teezellensuspensionskultur mit hoher metabolischer aktivität. Alle Teile eines Pflanzengewebes könnten verwendet werden, um Callus in einer sterilisierten Umgebung zu initiieren25. Teeblätter wurden in dieser Studie für die Callus-Initiation ausgewählt, nicht nur, weil Blätter tendenziell weniger kontaminiert sind als die Untergrundteile, sondern auch, weil sie der essbare Teil der Ernte und das Hauptziel der Pestizidanwendung sind.
In dieser Studie wurden die Induktionsrate und der Wachstumsstatus von Callus aus Blättern, die vom Feld entnommen wurden, und von Blättern, die aus einer sterilen, in vitro angebauten Pflanze verwendet wurden, verglichen. Die sterilen Blätter hatten viel niedrigere Bräunungs- und Kontaminationsraten und eine höhere Induktionsrate im Vergleich zu feldgewachsenen Blättern. Dies war wahrscheinlich, weil Blätter aus Feldpflanzen nicht nur eine Oberflächensterilisation mit Ethanol und Quecksilber durchliefen, sondern auch eine Veränderung der Wachstumsumgebung, während sterile Blätter in einer sterilen Umgebung angebaut wurden und direkt ohne zusätzliche Sterilisation. Darüber hinaus zeigte der aus den in vitro angebauten, sterilen Pflanzendasplanten ein kräftigeres Wachstum als die feldgewachsenen Blätter während der 90 Tage des Anbaus. Blätter aus sterilen Pflanzen waren besser für die Induktion von Tee-Callus geeignet, nicht nur wegen ihrer hohen Callusinduktion und niedrigen Kontaminationsraten, sondern auch wegen der kürzeren Vorbehandlungszeit und Unabhängigkeit von saisonalen Faktoren.
Um lose und friable Callus zu kultur, müssen die entscheidenden Parameter, in erster Linie Pflanzenwachstumsregulatorniveaus und Länge und Anzahl der Subkulturzyklen, optimiert werden25. 2,4-D kann effektiv Callus Induktion und Wachstum fördern und ist das am häufigsten verwendete Hormon in Calluskultur26. Subkulturzeiten und Subkulturzykluslänge sind auch für callus culture25wichtig. Nach 2 bis 4 Subkulturen von 28 Tagen eines jeden Zyklus hatte der Callus eine lockere Textur mit einer gelblichen Farbe und keine Bräunung. Die Optimierungsexperimente ergaben, dass das beste Callus-Induktionsprotokoll darin bestand, Blattexplanten aus sterilen Pflanzenaufenthalten auf MS-Basalmedien zu platzieren, die 1 mg L-1 2,4-D und 0,1 mgL-1 KT enthalten, und das Explant/Callus alle 28 Tage für eine insgesamt 4 Subkulturzyklen. Dieses Protokoll initiierte einen lockeren und friablen Callus, der für die Einleitung einer Zellsuspension geeignet war.
In der Pflanzengewebekultur kann das feste Medium, das für das Calluswachstum verwendet wird, oft für die Zellsuspensionskultur in flüssiger Form verwendet werden23. Während Tee große Mengen an Polyphenolen in MS-Basalmedium entsteht, die eine hohe Konzentration an anorganischer Salze enthalten, was zur Kalusbräunung27,28führt. In dieser Studie wurden sowohl flüssige B5-Medien als auch MS-Medien getestet. Die durchschnittlichen Wachstumsraten ergaben keinen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Kulturen (16,66 % in B5-Basalmedien und 15,77 % in den BASalen Medien der Ms; Abbildung 4). Allerdings waren die Calluses in MS Basalmedien braun. So wurde B5 Basalmedien in der vorgeschlagenen Methode ausgewählt.
Sauerstoff ist wichtig, um Zellwachstum und Stoffwechsel zu pflanzen. In der flüssigen Kultur wird ein übermäßiges Flüssigkeitsvolumen die Sauerstoffkonzentration verringern und das Zellwachstum hemmen, während zu wenig Flüssigkeit auch das Zellwachstum hemmt25. Es wurden mehrere Verhältnisse von Flüssigkeit zu Kolbenvolumen (mL-Flüssigkeit: mL-Kolben) getestet. Basierend auf dem Trockengewicht des Zellwachstums nach 21 d, die Flüssigkeit: Kolbenverhältnisse wie folgt: 30:150 > 40:150 > 20:150, 50:150, 60:150 (mL: mL)23. In dieser Studie wurden 40 ml Kulturflüssigkeit in einen 150 ml Kolben (40 ml: 150 ml) gelegt, der danach ausgewählt wurde, wie die Zellsuspension aussah, wie sie mit bloßem Auge beobachtet wurde.
Pflanzenzellen können nicht gut wachsen, wenn die Zelldichte zu hoch oder zu niedrig ist. So beeinflusst der Anteil der Mutterzellsuspensionskultur an frischem Medium zum Zeitpunkt der Subkultur das Wachstumspotenzial der Zellen29. Diese Studie verwendete den OD-Wert der homogenen Zellsuspensionskultur, um die Menge des Zellwachstums darzustellen. Die Impfung mit 15 g Mutterflüssigkeit in 40 ml Gesamtvolumen der Kulturflüssigkeit (v/v) war für das Zellwachstum geeignet. Das Subkulturverhältnis lag zwischen 1:1 und 1:2 (Suspension summische Flüssigkeit: frisches Medium).
Die Zelllebensfähigkeit innerhalb der Suspensionskultur der Teezellen wurde durch TTC-Färbung getestet. Die farblose TTC-Verbindung kann durch Dehydrogenasen in den Mitochondrien lebender Zellen in den rot gefärbten Formazan umgewandelt werden, aber die Farbe kann von abgestorbenen Zellen nicht geändert werden (Abbildung 5B). Diese Methode überprüfte den Wachstumsstatus der Zellen in flüssiger Kultur.
Die Etablierung einer Teezellensuspensionskultur bietet eine einfache In-vitro-Forschungsplattform für die Untersuchung des Stoffwechsels und der Metaboliten verschiedener Pestizide. Unabhängig von Saison und Wetter können Zellsuspensionskulturen mit verschiedenen Pestiziden, unterschiedlichen Wirkstoffkonzentrationen und für unterschiedliche Zeiträume behandelt werden. Die in den Suspensionskulturen der Teezellen produzierten Metaboliten ähnelten denen, die aus intakten Pflanzen extrahiert wurden (Ergänzungsfigur 1 und Ergänzende Abbildung 2). Interessanterweise wurden sieben Metaboliten von Thiamethoxam und zwei Metaboliten von Dimethoat in der Suspensionskultur der Teezellen nachgewiesen, aber nur zwei Metaboliten von Thiamethoxam und einer für Dimethoat in behandelten intakten Pflanzen ( Ergänzende Abbildung 2und Ergänzende Abbildung 3). Dies kann an der einfacheren Extraktion von Zellen ohne wachsartige Nagelhaut, weniger Verbindungen aus dem Tee, die die Massenspektrometrie-Ergebnisse stören (der Matrixeffekt), oder dem einfacheren Metabolitenprofil von Teezellen im Vergleich zur gesamten Pflanze zurückzuführen sein.
Die Ergebnisse zeigten, dass Thiamethoxam von der Teezelle leichter metabolisiert wurde als die anderen drei Neonicotinoide (Ergänzungsfigur 4). Beide Organophosphate (Dimethoat und Omethoat) wurden schneller metabolisiert als die Neonicotinoide. Diese Ergebnisse zeigen die Vielfalt der Stoffwechselwege und der metabolischen Regulation in der Teezelle, die weiter untersucht werden müssen.
Die Verwendung intakter Pflanzen zur Untersuchung des Insektizidstoffwechsels und zur Identifizierung von Insektizidenmetaboliten stellt zahlreiche Schwierigkeiten dar, darunter Hindernisse für die Absorption und den Ferntransport von Anfangs- und Abbauverbindungen innerhalb der Pflanze30. Zellsuspensionskulturen könnten dieses Problem nicht nur lösen, sondern auch Matrixstörungen in der Probenanalyse im Vergleich zum Extrakt aus frischen Blättern reduzieren24. Diese Forschung hat bewiesen, dass Teezellensuspensionskulturen eine effektive Plattform für die Untersuchung des Stoffwechsels von xenobiotischen Verbindungen in der Teepflanze sind. Es kann als ein Modus dienen, um den Stoffwechsel von Xenobiotika in anderen Pflanzen zu studieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch das National Key Research & Development Program (2016YFD0200900) of China, die National Natural Scientific Foundation of China (Nr. 31772076 und Nr. 31270728), Die China Postdoctoral Science Foundation (2018M630700) und der Open Fund of Of Of China (Nr. 31772076 und Nr. 31270728), die China Postdoctoral Science Foundation (2018M630700) und der Open Fund of Of Fund of China State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization (SKLTOF20180111).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetamiprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 46717 | CAS No: 135410-20-7 |
| Acetonitrile (CAN, 99.9%) | Tedia | AS1122-801 | CAS No: 75-05-8 |
| Agar | Solarbio Science & Technology | A8190 | CAS No: 9002-18-0 |
| Clothianidin (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 525 | CAS No: 210880-92-5 |
| Dimethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 109217 | CAS No: 60-51-5 |
| Imidacloprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 91029 | CAS No: 138261-41-3 |
| Imidaclothiz (99.5%) | Toronto Research Chemical | I275000 | CAS No: 105843-36-5 |
| Kinetin (KT, >98.0%) | Solarbio Science & Technology | K8010 | CAS No: 525-79-1 |
| Omethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 105491 | CAS No: 1113-02-6 |
| Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) | Solarbio Science & Technology | P8070 | CAS No: 25249-54-1 |
| Sucrose | Tocris Bioscience | 5511 | CAS No: 57-50-1 |
| Thiamethoxam (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 20625 | CAS No: 153719-23-4 |
| Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%) | Solarbio Science & Technology | T8170 | CAS No: 298-96-4 |
| 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%) | Guangzhou Saiguo Biotech | D8100 | CAS No: 94-75-7 |
| chiral column | Agilent CYCLOSIL-B | 112-6632 | Chromatography column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) |
| Gas chromatography (GC) | Shimadu | 2010-Plus | Paired with Flame Photometric Detector (FPD) |
| High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1260 | Paired with Ultraviolet detector (UV) |
| HSS T3 C18 column | Waters | 186003539 | Chromatography column (100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Agilent | 1290-6545 | Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Thermo Scientific | Ultimate 3000-Q Exactive Focus | Connected to a Orbitrap mass spectrometer |
References
- Zhao, Y., et al. Tentative identification, quantitation, and principal component analysis of green pu-erh, green, and white teas using UPLC/DAD/MS. Food Chemistry. 126 (3), 1269-1277 (2011).
- Alcazar, A., et al. Differentiation of green, white, black, Oolong, and Pu-erh teas according to their free amino acids content. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55 (15), 5960-5965 (2007).
- Kopjar, M., Tadic´, M., Pilizˇota, V. Phenol content and antioxidant activity of green, yellow and black tea leaves. Chemical and Biological Technologies in Agriculture. 2 (1), 1-6 (2015).
- Chen, H., Yin, P., Wang, Q., Jiang, Y., Liu, X. A modified QuEChERS sample preparation method for the analysis of 70 pesticide residues in tea using gas chromatography-tandem mass spectrometry. Food Analytical Methods. 7 (8), 1577-1587 (2014).
- Hou, R. Y., et al. Alteration of the Nonsystemic Behavior of the Pesticide Ferbam on Tea Leaves by Engineered Gold Nanoparticles. Environmental Science & Technology. 50 (12), 6216-6223 (2016).
- Abdel-Gawad, H., Mahdy, F., Hashad, A., Elgemeie, G. H. Fate of C-14-Ethion insecticide in the presence of deltamethrin and dimilin pesticides in cotton seeds and oils, removal of ethion residues in oils, and bioavailability of its bound residues to experimental animals. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (51), 12287-12293 (2014).
- Fang, Q., et al. Degradation Dynamics and Dietary Risk Assessments of Two Neonicotinoid Insecticides during Lonicerajaponica Planting, Drying, and Tea Brewing Processes. Journal of Agricultural and Food. 65 (8), 1483-1488 (2017).
- Pan, R., et al. Dissipation pattern, processing factors, and safety evaluation for dimethoate and its metabolite (omethoate) in tea (Camellia sinensis). PloS One. 10 (9), e0138309 (2015).
- Pavlic, M., Haidekker, A., Grubwieser, P., Rabl, W.
- Mohapatra, S., Ahuja, A. K., Deepa, M., Sharma, D. Residues of acephate and its metabolite methamidophos in/on mango fruit (Mangifera indica L.). Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 86 (1), 101-104 (2011).
- Phugare, S. S., Gaikwad, Y. B., Jadhav, J. P. Biodegradation of acephate using a developed bacterial consortium and toxicological analysis using earthworms (Lumbricus terrestris) as a model animal. International Biodeterioration & Biodegradation. 69, 1-9 (2012).
- Ford, K. A., Casida, J. E. Comparative metabolism and pharmacokinetics of seven neonicotinoid insecticides in spinach. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10168-10175 (2008).
- Frear, D. S., Swanson, H. R. Metabolism of cisanilide (cis-2,5-Dimethyl-1-Pyrrolidinecarboxanilide) by Excised Leaves and Cell Suspension Cultures of Carrot and Cotton. Pesticide Biochemistry and Physiology. 5, 73-80 (1975).
- Sandermann, H. Jr, Scheel, D., Trenck, T. H. V. D. Use of plant cell cultures to study the metabolism of environmental chemicals. Ecotoxicology and Environmental Safety. 8 (2), 167-182 (1984).
- Karmakar, R., Bhattacharya, R., Kulshrestha, G. Comparative metabolite profiling of the insecticide thiamethoxam in plant and cell suspension culture of tomato. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (14), 6369-6374 (2009).
- Lichtner, F. Phloem mobility of crop protection products. Australian Journal of Plant Physiology. 27, 609-614 (2000).
- Sun, J., et al. Shoot basal ends as novel explants for in vitro plantlet regeneration in an elite clone of tea. Journal of Horticultural Science & Biotechnology. 87 (1), 71-76 (2012).
- Meng, M. T., et al. Uptake, Translocation, Metabolism, and Distribution of Glyphosate in Nontarget Tea Plant (Camellia sinensis L). Journal of Agricultural and Food Chemistry. (65), 7638-7646 (2017).
- Hou, R. Y., et al. Effective Extraction Method for Determination of Neonicotinoid Residues in Tea. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 12565-12571 (2013).
- Karmakar, R., Kulshrestha, G. Persistence, metabolism and safety evaluation of thiamethoxam in tomato crop. Pest Management Science. 65 (8), 931-937 (2009).
- Dauterman, W. C., Viado, G. B., Casida, J. E., O'Brien, R. D. Persistence of Dimethoate and Metabolites Following Foliar Application to Plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 8 (2), 115-119 (1960).
- Lucier, G. W., Menzer, R. E. Nature of oxidative metabolites of dimethoate formed in rats, liver microsomes, and bean plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 18 (4), 698-704 (1970).
- Yang, G. W. Construction of Camellia sinensis Cell Suspension Culture and Primary Study on Kineties. , College of Food Science and Nutrition Engineering. China Agricultural University. (2004).
- Jiao, W., et al. Comparison of the Metabolic Behaviors of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (L.) Leaves. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66, 8593-8601 (2018).
- Mustafa, N. R., Winter, D. W., Iren, F. V., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nature Protocols. 6, 715-742 (2011).
- Zhong, J. J., Bai, Y., Wang, S. J. Effects of plant growth regulators on cell growth and ginsenoside saponin production by suspension cultures of Panax quinquefolium. Journal of Biotechnology. 45, 227-234 (1996).
- Grover, A., et al. Production of monoterpenoids and aroma compounds from cell suspension cultures of Camellia sinensis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 108, 323-331 (2012).
- Lei, P. D., et al. Prevent Browning of Axillary Buds in vitro Culture of Camellia sinensis. Chinese Agricultural Science Bulletin. 28, 190-193 (2012).
- Hou, X., Guo, W. The effect of various nitrogen sources on the growth and nitrate assimilation indicator of suspension roselle cell. Guihaia. 18, 169-172 (1998).
- Shimabukuro, R. H., Walsh, W. C. Xenobiotic Metabolism in Plants: In vitro Tissue, Organ, and Isolated Cell Techniques. ACS Symposium Series. 97 (1), 3-34 (1979).
