Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Studie over het metabolisme van zes systemische insecticiden in een nieuw opgerichte cel schorsing cultuur afgeleid van thee (Camellia sinensis L.) Bladeren

Published: June 15, 2019 doi: 10.3791/59312
Automatic Translation
*1,2, *1, 2, 1, 1, 1
1State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, School of Tea and Food Science & Technology, Anhui Province Key Lab of Analysis and Detection for Food Safety, 2School of Resource & Environment, Anhui Agricultural University, Key Laboratory of Agri-food Safety of Anhui Province
* These authors contributed equally

Summary

Dit werk presenteert een protocol voor de oprichting van een cel schorsing cultuur afgeleid van thee (Camellia sinensis L.) bladeren die kunnen worden gebruikt om het metabolisme van de externe verbindingen die kunnen worden opgenomen door de hele plant, zoals insecticiden studie.

Abstract

Een platform voor het bestuderen van insecticide metabolisme met behulp van in vitro weefsels van theeplant werd ontwikkeld. De bladeren van steriele thee plantjes werden veroorzaakt om losse aanroepus op Murashige en Skoog (Mej.) basismedia met de installatie hormonen te vormen 2, 4-dichlorophenoxyacetic zuur (2, 4-D, 1,0 mg L-1) en KINETIN (KT, 0,1 mg l-1). Aanroepus vormde zich na 3 of 4 rondes van subculturing, elk die 28 dagen duurt. Losse Callus (ongeveer 3 g) werd vervolgens geënt in B5 vloeibare media met dezelfde plantenhormonen en werd gekweekt in een schudden incubator (120 rpm) in het donker bij 25 ± 1 ° c. Na 3 − 4 subculturen, een cel schorsing afgeleid van thee blad werd vastgesteld op een subcultuur ratio variërend tussen 1:1 en 1:2 (schorsing moeder vloeistof: vers medium). Met behulp van dit platform, zes insecticiden (5 µ g mL-1 elk thiamethoxam, Imidacloprid, Acetamiprid, imidaclothiz, dimethoaat, en omethoaat,) werden toegevoegd in de thee Leaf-afgeleide cel schorsing cultuur. Het metabolisme van de insecticiden werd gevolgd gebruikend vloeibare chromatografie en de chromatografie van het gas. Om het nut van de Tea Cell Suspension cultuur te valideren, werden de metabolieten van thiamethoxan en dimethoaat aanwezig in behandelde cellen culturen en intacte planten vergeleken met massaspectrometrie. In behandelde Tea Cell culturen, zeven metabolieten van thiamethoxan en twee metabolieten van dimethoaat werden gevonden, terwijl in behandelde intacte planten, slechts twee metabolieten van thiamethoxam en een van dimethoaat werden gevonden. Het gebruik van een cel schorsing vereenvoudigde de metabole analyse in vergelijking met het gebruik van intacte thee planten, vooral voor een moeilijke matrix zoals thee.

Introduction

Thee is een van de meest geconsumeerde non-alcoholische dranken in de wereld1,2. Thee wordt geproduceerd uit de bladeren en knoppen van de Woody meerjarige Camellia sinensis L. thee planten worden geteeld in grote plantages en zijn vatbaar voor tal van insectenplagen3,4. Organophosphorus en neonicotinoid insecticiden worden vaak gebruikt als systemische insecticiden5 om thee planten te beschermen tegen plagen zoals whiteflies, Leaf hoppers, en sommige Lepidoptera soorten6,7. Na toepassing, worden deze insecticiden geabsorbeerd of in de installatie verplaatst. Binnen de plant kunnen deze systemische insecticiden worden getransformeerd door middel van hydrolyse, oxidatie of reductiereacties door plantaardige enzymen. Deze transformatie producten kunnen meer polaire en minder giftig dan de bovenliggende verbindingen. Echter, voor sommige organofosfaten, de bioactiviteiten van sommige producten zijn hoger. Bijvoorbeeld, wordt acefaat omgezet in giftigere methamidofos8,9, en dimethoaat in omethoaat,10,11. De metabolische studies van de installatie zijn zo belangrijk voor het bepalen van het lot van een pesticide binnen een installatie12.

Plant aardige weefselculturen zijn bewezen een nuttig platform voor het onderzoek van het metabolisme van pesticiden, met de geïdentificeerde metabolieten vergelijkbaar met die gevonden in intact planten13,14,15. Het gebruik van weefselculturen, in het bijzonder de cellen schorsing culturen, heeft een aantal voordelen. Ten eerste, experimenten kunnen worden uitgevoerd vrij van micro-organismen, waardoor de interferentie van pesticide transformatie of degradatie door microben te voorkomen. Ten tweede, weefselcultuur biedt consistente materialen voor gebruik op elk gewenst moment. Ten derde, de metabolieten zijn gemakkelijker te halen uit weefselculturen dan van intacte planten, en weefselculturen hebben vaak minder interring verbindingen en lagere complexiteit van verbindingen. Ten slotte kan weefselculturen gemakkelijker worden gebruikt om een reeks van pesticiden metabolisme te vergelijken in een experiment16.

In deze studie, een cel schorsing afgeleid van de bladeren van steriel geteelde thee plantlet werd met succes vastgesteld. De Tea Cell Suspension cultuur werd vervolgens gebruikt om de dissipatie gedrag van zes systemische insecticiden te vergelijken.

Dit gedetailleerde protocol is bedoeld om enige leidraad te bieden, zodat onderzoekers kunnen een plantweefsel cultuur platform nuttig voor het bestuderen van de metabole lot van xenobiotica in thee vast te stellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tea oproepus cultuur

Nota: de steriele bladeren werden afgeleid uit in vitro-grown plantlet lijnen die eerst in Onderzoekgroep17worden ontwikkeld. Alle procedures tot en met sectie 5 werden uitgevoerd in een steriele laminaire stromings kap, met uitzondering van de cultuur tijd in een incubator.

  1. Pas de pH van de twee media (Murashige en Skoog [MS] basal medium en Gonsales B5 vloeistof medium) tot 5,8 voorafgaand aan autoclaaf (121 °C, 20 min).
  2. Snijd langs de middelste ader van een steriele blad met behulp van een schaar, en vervolgens onderverdelen elke helft in kleine stukjes van ongeveer 0,3 cm x 0,3 cm in een petrischaaltje.
  3. Plaats de steriele Explants (de kleine stukjes blad) op MS basale media met de planthormonen 2, 4-D (1,0 mg L-1) en KT (0,1 mg l-1). Zes Explants kunnen worden geplaatst in een kolf van 300 mL met 100 mL MS basale media.
  4. Cultuur het bovenstaande blad Explants bij een constante temperatuur van 25 °C in het donker. Na 28 dagen, selecteert u de eerste generatie van geïnduceerde Callus en transfer naar een nieuwe fles (een subcultuur). Verwerf de losse en brokkelig Callus na 3 − 4 subculturen.

2. Tea Cell schorsing cultuur

  1. Snijd de krachtige, brokkelig en losse eelt van het vaste medium in kleine stukjes (bereik hier 0,5 − 2 mm) met behulp van een steriele chirurgische mes onder steriele omstandigheden.
  2. Weeg ongeveer 3 g van de kleine stukjes van de Callus. Plaats de aanroepus in een kolf van 150 mL met 20 mL B5-vloeibare media, aangevuld met 2, 4-D (1,0 mg L-1) en KT (0,1 mg l-1).
  3. Cultuur de vloeibare cel schorsing bij een constante temperatuur (25 ± 1 ° c) in een schudden incubator op 120 rpm in het donker.
  4. Na 7 tot 10 dagen van kweken, verwijder de cultuur kolven en laat ze staan voor een paar minuten.
  5. Neem alle bovendrijvende als zaad materiaal voor subcultuur op vers medium (subcultuur ratio van Suspension moeder vloeistof tot vers medium varieerde tussen 1:1 en 1:2). Verwijder de neergeslagen, grote eelt.
  6. Verkrijg de laatste goed gekweekte cel schorsing cultuur na 3 − 4 subcultuur cycli van 28 dagen per stuk.

3. trifenylfosfaat tetrazolium chloride assay van de levensvatbaarheid van cellen

  1. Dood een steekproef van levende cellen bij 100 °C voor 10 min als controle cel vóór levensvatbaarheid het bevlekken.
  2. Centrifugeer alle cel schorsing cultuur voor 8 min bij 6000 x g. Verwijder de bovendrijvende voor de schorsing van de cellen in 2,5 mL fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) buffer (pH 7,3), en schud het voor 1 min met de hand.
  3. Voeg 2,5 mL van de 0,4% trifenylfosfaat tetrazolium chloride (TTC) oplossing toe en schud met de hand opnieuw.
  4. Incubeer het mengsel voor 1 h in een staande incubator (30 °C).

4. behandeling en bemonstering van thee cel schorsing culturen met insecticiden

  1. Voeg een hoeveelheid van 400 µ L van filter-gesteriliseerde stockoplossing (500 µ g mL-1) van vier neonicotinoids (thiamethoxam, Acetamiprid, Imidacloprid, en imidaclothiz) of twee organofosfaten (dimethoaat en omethoaat,) in de cel schorsing culturen, Respectievelijk.
    Opmerking: als het doel is om xenobiotische gedrag te vergelijken, gebruik maken van dezelfde moeder partij van cel schorsingen om de verschillende verbindingen te testen.
  2. Cultuur de monsters van de cel schorsingen met insecticiden bij constante temperatuur (25 ± 1 ° c) en schudden incubator snelheid (120 rpm). Neem de monsters (zie stap 4,3 of 4,4) op 0, 3, 5 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 en 75 dagen.
  3. Als u een monster met een neonicotinoid wilt testen, verwijdert u een hoeveelheid van 1 mL van de homogene cellen cultuur, plaatst u deze in een 1,5 mL plastic centrifugebuis en centrifugeer bij 4000 x g gedurende 2 minuten.
    1. Passeer de supernatants door middel van een 0,22-µm porie-size filter membraan voor analyse door High-Performance vloeistofchromatografie-ultraviolet (HPLC-UV) en ultra-high performance vloeistofchromatografie-quadrupole time-of-Flight (UPLC-QTOF) massa spectrometrie (lijst van materialen).
  4. Om een monster met een organofosfaat te testen, verwijdert u een 500 µ L hoeveelheid van de cel cultuur en plaats in een 35 mL centrifugebuis of een 1,5 mL plastic centrifugebuis (bereid het laatste monster als dat van neonicotinoid).
    1. Voeg 0,1 g natriumchloride en 5 mL aceton/ethylacetaat (3:7, v/v) toe aan de 35 mL centrifugebuis van de 500 µ L-monsters.
    2. Draai de mengsels voor 1 minuut en laat ze dan 10 minuten rusten.
    3. Neem 2,5 mL van de bovendrijvende in een 10 mL glazen buis en verdampen tot bijna-droogheid met behulp van een stikstof verdamper bij 40 °C.
    4. Los het residu op met 1 mL aceton, Vortex voor 1 min, doorgeven door middel van een 0,22-µm filter membraan voor analyse door Gas Chromatografie-vlam fotometrische detector (GC-FPD).

5. sample voorbereiding van intacte theeplant met insecticiden

Opmerking: de intact Tea plant trial werd uitgevoerd in een hydrocultuur systeem met behulp van thee zaailingen geteeld in 50 mL van een voedingsoplossing (30 NH4+, 10 nr3-, 3,1 PO4-, 40 K+, 20 CA2 +, 25 mg2 +, 0,35 Fe2 +, 0,1 B 3 +, 1,0 MN2 +, 0,1 Zn2 +, 0,025 cu2 +, 0,05 mo+, en 10 al3 +, in mg L-1)18. Een experimentele serre was onder een licht-donkere cyclus (12 h van licht en 12 h van duisternis) bij 20 °C bij de Landbouwuniversiteit van Anhui.

  1. Zet vijf planten in een 4 L plastic pot voor 15 dagen.
  2. Voeg 0 ppm (controle) of 100 ppm van thiamethoxam of dimethoaat in plastic potten, respectievelijk.
  3. Bereid het intacte plant monster volgens de vorige methode, met uitzondering van voor weken19, en vervolgens analyseren met massaspectrometrie voor een nauwkeurige massaspectrum.

6. instrument analyse

  1. HPLC-analyse van het metabolische gedrag van neonicotinoids
    1. Gebruik een HPLC-UV (tabel met materialen) om de inhoud en de metabole producten van thiamethoxam en Acetamiprid te detecteren bij een golflengte van 254 nm, en van Imidacloprid en imidaclothiz bij 270 nm in monsters van punt 4,3.
      Nota: de HPLC-UV voorwaarde was het zelfde als vorige studie19.
  2. GC analyse van het metabolische gedrag van organofosfaten
    1. Detecteren van de inhoud van dimethoaat en omethoaat, in monsters van punt 4,4 door een GC-FPD met behulp van een chirale kolom (tabel van materialen).
    2. Gebruik stikstof als de vervoerder gas en zet de debiet op 1,0 mL min-1.
    3. Stel de begintemperatuur in op 120 °C en houd deze 5 min. Verhoog de temperatuur tot 150 °C bij 30 °C min-1 en houd gedurende 3 min. te verhogen tot 170 °c bij 10 °c min-1 en houd voor 7 min. Tot slot verhogen tot 210 °C bij 30 °C min-1 en dan greep 5 min.
    4. Zet de injectie temperatuur op 200 °C in splitloze modus; Stel de detector temperatuur in op 250 °C.
    5. Stel het injectie volume in op 1 µ L.
  3. UPLC-QTOF analyse van de insecticide metabolieten in de cel cultuur
    1. Detecteren van de metabolieten van de insecticiden in de cel cultuur (monsters van punt 4,3) met behulp van UPLC-QTOF met een C18 kolom (tabel van materialen).
    2. Stel het debiet in op 0,2 mL min-1. Stel het injectie volume in op 10 µ L.
    3. Voor de neonicotinoid-behandelde monsters stelt u de initiële mobiele fase in op 85% A (5 mM ammonium formate water) en 15% B (acetonitril). Meer dan 10 min, verhoog mobiele fase B tot 38% en terug te keren naar 15% meer dan 1 min, houd voor 9 min.
    4. Voor de organofosfaat-behandelde monsters, zet de initiële mobiele fase tot 55% A (0,1% vorm zuur water) en 45% B (acetonitril). Meer dan 5 min, verhoog mobiele fase B tot 70%, dan terug te keren naar 45% van B meer dan 0,5 min, vast te houden voor 2,5 min.
    5. Stel de QTOF operatie parameters als volgt in: temperatuur van het gas, 325 °C; droog gas (stikstof), 10 L min-1; de temperatuur van het schede gas, 350 °C; het gas stroom van de schede, 11 L min-1; capillair voltage, 4000 V; Nozzle voltage, 1000 V; het voltage van de fragmentatie, 100 V voor neonicotinoid insecticiden of 110 V voor organophosphorus insecticiden; het voltage van de skimmer, 65 V; actief in de positieve Ion-modus.
    6. Stel het instrument in op het volledige scan spectrum en doel MS/MS-modus.
    7. Verwerken van de gegevens met behulp van nauwkeurige massa tools; Afleiden van de metabolieten met geen standaard producten uit de MS/MS annotatie, alsmede de literatuur12,15,20,21,22.
  4. UPLC-Orbitrap analyse van de insecticide metabolieten in intact plantenextract
    1. Sporen van de metabolieten van insecticiden in intact plantenextract met behulp van UPLC-Orbitrap massaspectrometrie (tabel van materialen).
    2. Zet de massaspectrometrie (tabel van materialen) werking parameters als volgt: schede gasdruk, 35 arb; de temperatuur van het gas, 300 °C; Nozzle voltage, 3,5 KV; capillaire temperatuur, 350 °C.
    3. Stel de elutie Programma's als het bovenstaande (stappen 6.3.3 en 6.3.4) voor UPLC-QTOF analyse van de cel cultuur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De inductie van eelt uit bladeren geoogst uit veld-geteelde thee bomen en uit bladeren van thee plantjes geteeld in vitro in een steriele omgeving werd vergeleken door het meten van verontreiniging, Browning, en inductie na 28 dagen van de teelt op MS Media ( Figuur 1a). De groei van Callus werd opgenomen bij 20, 37, 62 en 90 dagen van cultuur (Figuur 1b). De eelt afkomstig van de in vitro-grown bladeren toonde een krachtiger groei dan de eelt afkomstig van de veld-geteelde bladeren gedurende de hele 90 dagen van de teelt. De aanroepus van de steriele bladeren was helder geel, terwijl de aanroepus van de veld-geteelde bladeren bruin was (Figuur 1b).

Bij een concentratie van 1,0 mg L-1 van 2, 4-D23, werd de concentratie van KT geoptimaliseerd. Op 0,05 mg L-1 KT, de roepus groeisnelheid was traag, de textuur was een beetje compact, en de aanroepus was wit van kleur (figuur 2c); op 0,1 mg L-1 KT concentratie, de Callus groeisnelheid was de hoogste, tot 61,5% (Figuur 2a), de textuur was los, en de kleur was geelachtig (figuur 2c); toen de KT werd verhoogd tot 0,5 mg L-1, was de aanroepus compact en onregelmatig en bruin in het midden (figuur 2c). Nadat de KT-concentratie werd geselecteerd, werd de concentratie van 2, 4-D verder bestudeerd. Bij een combinatie van 1 mg L-1 2, 4-D en 0,1 mg l-1 KT, was het groeipercentage van de aanroepus de hoogste, het bereiken van 46,9%, en het uiterlijk van de Callus was de beste (Figuur 2b,D).

Na de 2ND -subcultuur op vaste dragers werd meer dan de helft van het oppervlak van elk besneden blad gedekt door een groeiende aanroepus (Figuur 3a). Na de 4e subcultuur, werden de blad secties volledig behandeld door de aanroepus. Na de 5e subcultuur, de Callus textuur begon te worden compact met een aantal witte en bruine vlekken op de bodem.

Toen de subcultuur cyclus 21 dagen lang was (Figuur 3b), was de aanroepus krachtig, maar de grootste hoeveelheid groei was niet bereikt, wat erop wijst dat frequente subcultuur zou resulteren in minder Callus bedrag. Toen de subcultuur cyclus 28 dagen lang was, was de aanroepus krachtig gegroeid, de kleur was gelige kleur en de textuur was los. Na 35 dagen, de Callus begon te bruin van het centrum. De aanroepus was in de ergste staat, met een diepe bruine kleur en niet meer groeien, op 42 dagen.

Twee soorten vloeibare media werden vergeleken voor hun gevolgen voor de groei van bellus en de kleur van de cel opschorting (Figuur 4). Drie verschillende ratio's van moeder vloeistof tot het totale volume van de cultuur vloeistof werden getest. Tijdens de 75 dagen van de teelt, de cel dichtheid geleidelijk toegenomen in culturen begon op alle drie de ratio's. De verhouding van 15 g-cellen in 40 mL verse media (v/v) leverde een waarde van de optische dichtheid (OD) significant hoger op dan die van 4 g in 40 mL (v/v) en 6 g in 40 mL (v/v) (figuur 5a). Na 4 subcultuur cycli van 28 dagen per stuk, werd een Tea Cell Suspension systeem met succes opgericht uit steriele thee Callus in B5 vloeibare media (Figuur 6).

Figure 1
Figuur 1 : Vergelijking van aanroepus inductie van geplukte bladeren en steriele plantlet bladeren. (A) vergelijking van de inductie van aanroepen van bladeren die zijn geoogst uit plantage-geteelde thee planten en van bladeren die uit steriele, in vitro-geteelde plantjes. Explants werden waargenomen voor verontreiniging, het bruinen en inductie van Callus. Bvergelijking van de groei van de aanplanting van bladeren die afkomstig zijn van plantage-geteelde thee planten (set 1) en steriele in vitro-grown plantjes (set 2): Foto's waren op verschillende dagen: 20 (panelen a); 37 (b); 62 (c); en 90 (d). Dit cijfer is gewijzigd van Jiao et al.24. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2 : Het groeitempo en de groei status van Tea-Leaf afgeleide bellus onder verschillende plantenhormoon concentraties. Het groeipercentage (A) en de groei status (C) van thee blad afgeleide CALLus onder verschillende KT-concentraties en 1 mg L-1 2, 4-D; Het groeipercentage (B) en de groei status (D) van de aanroepus onder verschillende 2, 4-D concentraties en 0,5 mg L-1 KT. Dit cijfer is gewijzigd van Jiao et al.24. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3 : Callus status na verschillende aantallen subcultuur cycli (a) en verschillende lengten van subcultuur cycli (B). Dit cijfer is gewijzigd van Jiao et al.24. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4 : Invloed van verschillende media types op de groei van de ring in Liquid Suspension cultuursysteem. AB5-medium. BMS medium. Dit cijfer is gewijzigd van Jiao et al.24. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5 : De optische dichtheid waarden en TTC kleuring. (A) de OD680 waarde van de schorsing van de cel begon bij verschillende verhoudingen van 0 tot 75 dagen; Bde TTC-kleuring van de levens-en controlecellen. Dit cijfer is gewijzigd van Jiao et al.24. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6 : Het proces van de oprichting van een thee-cel schorsing cultuur bij constante temperatuur (25 ± 1 ° c) in een donkere incubator. Steriele cultuur van thee plantjes als bron van blad explant (a); Thee blad geënt op MS medium met 2, 4-D (1,0 mg L-1) en KT (0,1 mg l-1) (b); Eerste gekweekte aanroepus na 28 dagen (c); Callus geschikt voor cel vering na 4 subcultuur cycli van 28 dagen per stuk (d); De resterende stappen waren bij dezelfde temperatuur, maar bij een constante snelheid van 120 rpm in een schudden incubator: Callus geënt in B5 medium voor 7 tot 10 dagen (e); Gezaaide cel schorsing na het verwijderen van de neergeslagen en grote Callus (f); De subcultuur van de schorsing van de cel na 1 cyclus van 28 dagen (g); Volwassen cel schorsing na 3-4 subcultuur cycli van 28 dagen per stuk (h). Dit cijfer is gewijzigd van Jiao et al.24. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullende Figuur 1: het metabolisme van 5 µ g/ml van 6 insecticiden in Tea Cell schorsing cultuur en in de media (CK) uitgebroed bij constante temperatuur (25 ± 1 ° c) en schudden incubator snelheid (120 rpm) meer dan 75 dagen. Thiamethoxan (a), Imidacloprid (B), Acetamiprid (C), Imidaclothiz (D), dimethoaat (E1) en omethoaat, (F); (E2) Productie in de tijd van de metaboliet van dimethoaat (omethoaat,) geproduceerd in dimethoaat-behandelde cel cultuur en media. Dit cijfer is gewijzigd van Jiao et al.24. Gelieve Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Aanvullend Figuur 2: totale Ion chromatogrammen (TICs) van de extracten van onbehandelde controle-cel cultuur, thiamethoxam-behandelde cel cultuur, thiamethoxam-behandelde media (cel-vrij) na 75 dagen. Pieken 1-5, 7 en 8 waren metabolieten van thiamethoxam en Peak 6 was thiamethoxam (a); TICs van de uittreksels van dimethoaat-behandelde cel cultuur, dimethoaat-behandelde media (cel-vrij), en onbehandelde controlecellen na 60 dagen. Pieken 1 en 2 waren metabolieten van dimethoaat en piek 3 was dimethoaat (B); TICs van de extracten van thiamethoxam (bovenste) en onbehandelde (lagere) intacte planten (C); TICs van de extracten van dimethoaat (bovenste) en onbehandelde (lagere) intacte planten (D); De metaboliet van dimethoaat bij tR 1,86 min in intacte planten (D1); Geen verbindingen gedetecteerd bij tR 1,86 min in onbehandelde planten (D2). Dit cijfer is gewijzigd van Jiao et al.24. Gelieve Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Aanvullend Figuur 3: de secundaire massaspectrometrie met behulp van UPLC-QTOF van pieken afgeleid van culturen behandeld met (a) thiamethoxam en (B) dimethoaat. Dit cijfer is gewijzigd van Jiao et al.24. Gelieve Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Aanvullend Figuur 4: de secundaire massaspectrometrie met behulp van Q-Exactive van pieken afkomstig van intacte plant behandeld met Thiamethoxam (a1, a2 en a3) en dimethoaat (B1 en B2). Dit cijfer is gewijzigd van Jiao et al.24. Gelieve Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit artikel presenteert het gedetailleerde proces van de vaststelling van een model van het metabolisme van pesticiden in theeplant weefsel, met inbegrip van de selectie van Explants, de bepaling van de levensvatbaarheid van de cellen, en de oprichting van een thee-cel schorsing cultuur met een hoge metabole Activiteit. Om het even welke delen van een installatie weefsel zouden kunnen worden gebruikt om aanroepus in een gesteriliseerde milieu te initialiseren25. Thee bladeren werden gekozen voor Callus Inleiding in deze studie, niet alleen omdat bladeren om de neiging om minder verontreinigd dan de onderdelen onder de grond, maar ook omdat ze het eetbare deel van het gewas en de belangrijkste doelstelling van de toepassing van pesticiden.

In deze studie werden de inductie graad en de groei status van Callus uit de bladeren geplukt uit het veld en uit bladeren uit een steriele plantlet geteeld in vitro werden vergeleken. De steriele bladeren hadden veel lagere tarieven van Browning en vervuiling en een hoger percentage van de inductie in vergelijking met veld-geteelde bladeren. Dit was waarschijnlijk omdat de bladeren van veld-geteelde planten niet alleen oppervlakte sterilisatie onderging met behulp van ethanol en kwik, maar ook een verandering in de groeiomgeving, terwijl steriele bladeren werden geteeld in een steriele omgeving en kan direct worden gebruikt zonder extra sterilisatie. Bovendien toonde de eelt uit de in vitro-grown, steriele plantjes, een krachtiger groei dan de veld-geteelde bladeren tijdens de 90 dagen van de teelt. De bladeren van steriele plantjes waren meer geschikt voor inductie van thee-aanroepus, niet alleen vanwege hun hoge inductie en lage besmettings percentages, maar ook vanwege de kortere voorbehandelings tijd en de onafhankelijkheid van seizoensgebonden factoren.

Aan cultuur los en brokkelig Callus, moeten de essentiële parameters, hoofdzakelijk de niveaus van de installatiegroei regulator en de lengte van en het aantal subcultuur cycli,25worden geoptimaliseerd. 2, 4-D effectief kan bevorderen Callus inductie en de groei en is het meest gebruikte hormoon in Callus cultuur26. Subcultuur tijden en subcultuur cyclus lengte zijn ook belangrijk voor de cultuur van Callus25. Na 2 tot 4 subculturen van 28 dagen van elke cyclus, de bellus had een losse textuur met een gelige kleur en geen bruinen. De optimaliserings experimenten bepaalden dat het beste protocol van de inductie van de vraag was om blad Explants van steriele plantjes op MS basale media te plaatsen die 1 mg L-1 2, 4-D en 0,1 mg l-1 KT bevatten en om de explant/Callus om de 28 dagen over te brengen voor een totaal van 4 subcultuur cycli. Dit protocol initieerde losse en brokkelig Callus die geschikt was voor de initiatie van een cel schorsing.

In plantaardige weefselcultuur, het vaste medium gebruikt voor de groei van de oproepus kan vaak worden gebruikt voor de cel schorsing cultuur in een vloeibare vorm23. Overwegende dat, thee komt in het zijn grote hoeveelheden polyfenolen in MS basale medium met een hoge concentratie van anorganische zouten, wat resulteert in de Callus Browning27,28. In deze studie, vloeibare B5 media en MS Media werden beide getest. De gemiddelde groeicijfers werden gevonden geen significant verschil tussen de twee culturen (16,66% in B5 basale media en 15,77% in MS basale media; Figuur 4). Echter, de eelt waren bruin in MS basale media. Dus, B5 basale media werd geselecteerd in de voorgestelde methode.

Zuurstof is belangrijk voor plantaardige celgroei en metabolisme. In vloeibare cultuur, zal een bovenmatig volume van vloeistof de zuurstofconcentratie verminderen en de celgroei remmen, terwijl te weinig vloeistof ook de groei van de cel25remt. Verschillende verhoudingen van vloeistof tot kolf volume (mL vloeistof: mL kolf) werden getest. Op basis van het droge gewicht van de celgroei na 21 d, de vloeistof: kolf ratio's gerangschikt als volgt: 30:150 > 40:150 > 20:150, 50:150, 60:150 (mL: mL)23. In deze studie werd 40 mL kweekvloeistof geplaatst in een kolf van 150 mL (40 mL: 150 mL) werd geselecteerd volgens de manier waarop de cel schorsing zag er zoals waargenomen door het blote oog.

Plantencellen kunnen niet goed groeien wanneer de dichtheid van de cellen te hoog of te laag is. Aldus, beïnvloedt het aandeel van de schorsings cultuur van de moeder cel aan vers middel op het tijdstip van subcultuur het groeipotentieel van de cellen29. Deze studie gebruikte de OD waarde van de homogene cel schorsing cultuur om het bedrag van de celgroei te vertegenwoordigen. De inenting met 15 g van moeder vloeistof in 40 mL van totaal volume van cultuur vloeistof (v/v) was geschikt voor de celgroei. De subcultuur verhouding was gelijk aan tussen 1:1 en 1:2 (de vloeistof van de opschortings moeder: vers middel).

Levensvatbaarheid van cellen binnen de Tea Cell schorsing cultuur werd getest door TTC kleuring. De kleurloze TTC compound kan worden omgezet in de rode gekleurde Formazan door dehydrogenases in de mitochondriën van levende cellen, maar de kleur kan niet worden gewijzigd van dode cellen (Figuur 5b). Deze methode controleerde de groei status van de cellen in vloeibare cultuur.

De oprichting van een Tea Cell Suspension cultuur biedt een eenvoudige in vitro Research platform voor het bestuderen van metabolisme en metabolieten van verschillende pesticiden. Onafhankelijk van het seizoen en het weer, kan cel schorsing culturen worden behandeld met verschillende pesticiden, verschillende concentraties van de werkzame stof, en voor verschillende lengtes van de tijd. De metabolieten die zijn geproduceerd in de thee cellen Suspension culturen waren vergelijkbaar met die van intacte planten (aanvullende figuur 1 en aanvullende figuur 2). Interessant, werden zeven metabolieten van thiamethoxam en twee metabolieten van dimethoaat gedetecteerd in de thee-cel schorsing cultuur, maar slechts twee metabolieten van thiamethoxam en een voor dimethoaat in behandelde intact planten (aanvullende figuur 1, Aanvullende figuur 2, en aanvullende figuur 3). Dit kan het gevolg zijn van de gemakkelijker extractie van cellen zonder wasachtige cuticula, minder verbindingen van de thee interfereren met de massaspectrometrie resultaten (de matrix effect), of de eenvoudigere metaboliet Profiel van thee cellen in vergelijking met de hele plant.

De resultaten toonden aan dat thiamethoxam gemakkelijker werd afgebroken door de thee cel in vergelijking met de andere drie neonicotinoids (aanvullende figuur 4). Zowel van de organofosfaten (dimethoaat en omethoaat,) werden sneller omgezet dan de neonicotinoids. Deze resultaten tonen de diversiteit van de metabole routes en van de metabole regulatie in de thee cel, die verder bestudeerd moeten worden.

Het gebruiken van intacte installaties om insecticide metabolisme te bestuderen en insecticide metabolieten te identificeren stelt talrijke moeilijkheden voor, met inbegrip van barrières aan absorptie en lange-afstandsvervoer van zowel aanvankelijke als analyse samenstellingen binnen installatie30. Cel schorsing culturen kon niet alleen dit probleem op te lossen, maar ook verminderen matrix interferentie in het monsteranalyse in vergelijking met het uittreksel uit verse bladeren24. Dit onderzoek bleek dat Tea Cell Suspension culturen zijn een effectief platform voor het bestuderen van het metabolisme van xenobiotische verbindingen in de theeplant. Het kan als wijze worden gediend om het metabolisme van xenobiotica in andere installaties te bestuderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door het nationale belangrijkste onderzoek & ontwikkelingsprogramma (2016YFD0200900) van China, de nationale natuurlijke wetenschappelijke stichting van China (nr. 31772076 en nr. 31270728), de postdoctorale Stichting van de wetenschap van China (2018M630700), en open fonds van Staat zeer belangrijk laboratorium van de biologie en het gebruik van de thee installatie (SKLTOF20180111).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetamiprid (99.8%) Dr. Ehrenstorfer 46717 CAS No: 135410-20-7
Acetonitrile (CAN, 99.9%) Tedia AS1122-801 CAS No: 75-05-8
Agar Solarbio Science & Technology A8190 CAS No: 9002-18-0
Clothianidin (99.8%) Dr. Ehrenstorfer 525 CAS No: 210880-92-5
Dimethoate (98.5%) Dr. Ehrenstorfer 109217 CAS No: 60-51-5
Imidacloprid (99.8%) Dr. Ehrenstorfer 91029 CAS No: 138261-41-3
Imidaclothiz (99.5%) Toronto Research Chemical I275000 CAS No: 105843-36-5
Kinetin (KT, >98.0%) Solarbio Science & Technology K8010 CAS No: 525-79-1
Omethoate (98.5%) Dr. Ehrenstorfer 105491 CAS No: 1113-02-6
Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) Solarbio Science & Technology P8070 CAS No: 25249-54-1
Sucrose Tocris Bioscience 5511 CAS No: 57-50-1
Thiamethoxam (99.8%) Dr. Ehrenstorfer 20625 CAS No: 153719-23-4
Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%) Solarbio Science & Technology T8170 CAS No: 298-96-4
2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%) Guangzhou Saiguo Biotech D8100 CAS No: 94-75-7
chiral column Agilent CYCLOSIL-B 112-6632 Chromatography column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)
Gas chromatography (GC) Shimadu 2010-Plus Paired with Flame Photometric Detector (FPD)  
High-performance liquid chromatography (HPLC) Agilent 1260 Paired with Ultraviolet detector (UV)
HSS T3 C18 column Waters 186003539 Chromatography column (100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm)
Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) Agilent 1290-6545 Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF)
Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) Thermo Scientific Ultimate 3000-Q Exactive Focus Connected to a Orbitrap mass spectrometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhao, Y., et al. Tentative identification, quantitation, and principal component analysis of green pu-erh, green, and white teas using UPLC/DAD/MS. Food Chemistry. 126 (3), 1269-1277 (2011).
  2. Alcazar, A., et al. Differentiation of green, white, black, Oolong, and Pu-erh teas according to their free amino acids content. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55 (15), 5960-5965 (2007).
  3. Kopjar, M., Tadic´, M., Pilizˇota, V. Phenol content and antioxidant activity of green, yellow and black tea leaves. Chemical and Biological Technologies in Agriculture. 2 (1), 1-6 (2015).
  4. Chen, H., Yin, P., Wang, Q., Jiang, Y., Liu, X. A modified QuEChERS sample preparation method for the analysis of 70 pesticide residues in tea using gas chromatography-tandem mass spectrometry. Food Analytical Methods. 7 (8), 1577-1587 (2014).
  5. Hou, R. Y., et al. Alteration of the Nonsystemic Behavior of the Pesticide Ferbam on Tea Leaves by Engineered Gold Nanoparticles. Environmental Science & Technology. 50 (12), 6216-6223 (2016).
  6. Abdel-Gawad, H., Mahdy, F., Hashad, A., Elgemeie, G. H. Fate of C-14-Ethion insecticide in the presence of deltamethrin and dimilin pesticides in cotton seeds and oils, removal of ethion residues in oils, and bioavailability of its bound residues to experimental animals. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (51), 12287-12293 (2014).
  7. Fang, Q., et al. Degradation Dynamics and Dietary Risk Assessments of Two Neonicotinoid Insecticides during Lonicerajaponica Planting, Drying, and Tea Brewing Processes. Journal of Agricultural and Food. 65 (8), 1483-1488 (2017).
  8. Pan, R., et al. Dissipation pattern, processing factors, and safety evaluation for dimethoate and its metabolite (omethoate) in tea (Camellia sinensis). PloS One. 10 (9), e0138309 (2015).
  9. Pavlic, M., Haidekker, A., Grubwieser, P., Rabl, W. Fatal intoxication with omethoate. International Journal of Legal Medicine. 116 (4), 238-241 (2002).
  10. Mohapatra, S., Ahuja, A. K., Deepa, M., Sharma, D. Residues of acephate and its metabolite methamidophos in/on mango fruit (Mangifera indica L.). Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 86 (1), 101-104 (2011).
  11. Phugare, S. S., Gaikwad, Y. B., Jadhav, J. P. Biodegradation of acephate using a developed bacterial consortium and toxicological analysis using earthworms (Lumbricus terrestris) as a model animal. International Biodeterioration & Biodegradation. 69, 1-9 (2012).
  12. Ford, K. A., Casida, J. E. Comparative metabolism and pharmacokinetics of seven neonicotinoid insecticides in spinach. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10168-10175 (2008).
  13. Frear, D. S., Swanson, H. R. Metabolism of cisanilide (cis-2,5-Dimethyl-1-Pyrrolidinecarboxanilide) by Excised Leaves and Cell Suspension Cultures of Carrot and Cotton. Pesticide Biochemistry and Physiology. 5, 73-80 (1975).
  14. Sandermann, H. Jr, Scheel, D., Trenck, T. H. V. D. Use of plant cell cultures to study the metabolism of environmental chemicals. Ecotoxicology and Environmental Safety. 8 (2), 167-182 (1984).
  15. Karmakar, R., Bhattacharya, R., Kulshrestha, G. Comparative metabolite profiling of the insecticide thiamethoxam in plant and cell suspension culture of tomato. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (14), 6369-6374 (2009).
  16. Lichtner, F. Phloem mobility of crop protection products. Australian Journal of Plant Physiology. 27, 609-614 (2000).
  17. Sun, J., et al. Shoot basal ends as novel explants for in vitro plantlet regeneration in an elite clone of tea. Journal of Horticultural Science & Biotechnology. 87 (1), 71-76 (2012).
  18. Meng, M. T., et al. Uptake, Translocation, Metabolism, and Distribution of Glyphosate in Nontarget Tea Plant (Camellia sinensis L). Journal of Agricultural and Food Chemistry. (65), 7638-7646 (2017).
  19. Hou, R. Y., et al. Effective Extraction Method for Determination of Neonicotinoid Residues in Tea. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 12565-12571 (2013).
  20. Karmakar, R., Kulshrestha, G. Persistence, metabolism and safety evaluation of thiamethoxam in tomato crop. Pest Management Science. 65 (8), 931-937 (2009).
  21. Dauterman, W. C., Viado, G. B., Casida, J. E., O'Brien, R. D. Persistence of Dimethoate and Metabolites Following Foliar Application to Plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 8 (2), 115-119 (1960).
  22. Lucier, G. W., Menzer, R. E. Nature of oxidative metabolites of dimethoate formed in rats, liver microsomes, and bean plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 18 (4), 698-704 (1970).
  23. Yang, G. W. Construction of Camellia sinensis Cell Suspension Culture and Primary Study on Kineties. , College of Food Science and Nutrition Engineering. China Agricultural University. (2004).
  24. Jiao, W., et al. Comparison of the Metabolic Behaviors of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (L.) Leaves. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66, 8593-8601 (2018).
  25. Mustafa, N. R., Winter, D. W., Iren, F. V., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nature Protocols. 6, 715-742 (2011).
  26. Zhong, J. J., Bai, Y., Wang, S. J. Effects of plant growth regulators on cell growth and ginsenoside saponin production by suspension cultures of Panax quinquefolium. Journal of Biotechnology. 45, 227-234 (1996).
  27. Grover, A., et al. Production of monoterpenoids and aroma compounds from cell suspension cultures of Camellia sinensis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 108, 323-331 (2012).
  28. Lei, P. D., et al. Prevent Browning of Axillary Buds in vitro Culture of Camellia sinensis. Chinese Agricultural Science Bulletin. 28, 190-193 (2012).
  29. Hou, X., Guo, W. The effect of various nitrogen sources on the growth and nitrate assimilation indicator of suspension roselle cell. Guihaia. 18, 169-172 (1998).
  30. Shimabukuro, R. H., Walsh, W. C. Xenobiotic Metabolism in Plants: In vitro Tissue, Organ, and Isolated Cell Techniques. ACS Symposium Series. 97 (1), 3-34 (1979).

Tags

Biochemie thee cel schorsing intact theeplant insecticide plant metabolisme metabolisme massaspectrometrie
Studie over het metabolisme van zes systemische insecticiden in een nieuw opgerichte cel schorsing cultuur afgeleid van thee (<em>Camellia sinensis </em>L.) Bladeren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiao, W., Ge, G., Hua, R., Sun, J.,… More

Jiao, W., Ge, G., Hua, R., Sun, J., Li, Y., Hou, R. Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves. J. Vis. Exp. (148), e59312, doi:10.3791/59312 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter