Material bildning av rekombinant Spider Silks genom vattenhaltiga Solvation med hjälp av värme och tryck
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att producera vattenlösliga rekombinanta spindelnät protein lösningar och de material former som kan bildas från dessa lösningar.
Abstract
Många spindlar producerar sju typer av Silks. Sex av silkarna är fiber i form när de produceras av spindlar. Dessa fibrer är inte vattenlösliga. För att reproducera de anmärknings värda mekaniska egenskaperna hos spindel Silks, måste de produceras i heterologa värdar som spindlar är både territoriella och kannibalistiska. De syntetiska analoger av spindel silke tenderar också att vara olösliga i vatten lösningar. Således, en stor andel av forskning i rekombinant spindel Silks förlita sig på organiska lösnings medel som är skadliga för storskalig produktion av material. Vår grupps metod tvingar solvatiseringen av dessa rekombinanta spindel Silks i vatten. Anmärknings värt, när dessa proteiner är beredda att använda denna metod för värme och tryck, kan ett brett spektrum av material former framställas från samma lösning av rekombinant spindel silke proteiner (rSSp) inklusive: filmer, fibrer, svamp, hydrogel, Lyogel, och lim. Denna artikel visar produktionen av den solverade rSSp och material former på ett sätt som är lättare att förstå än från skriftligt material och metoder ensam.
Introduction
Spider Silks har samlat intresset av material forskare för deras imponerande kombination av styrka, elasticitet, och biokompatibilitet. Återskapa fibrer har traditionellt varit inriktningen av forskningen. Denna ansträngning hämmades av rekombinant spindel silke protein (rssp) olösliga i vatten samt oförmåga traditionella solvatiseringen tekniker (chaotropic agenter och rengörings medel) för att uppnå vattenaktig solvatiseringen. Vidare, tekniker som har utvecklats för att löregla versioner av rssp fungerar inte på alla rssp varianter och kräver också betydande manipulation och tid som ofta resulterar i protein förlust1,2. Detta har till stor del resulterat i att fältet använder 1, 1, 1, 3, 3, 3-hexafluoroisopropanol (HFIP) som ett lösnings medel som bildar fibrer, och andra begränsade material former. Fördelen är att alla kända rSSp är lösliga i HFIP, vilket ger data enhetlighet mellan varje forskar grupp. Nack delen är att HFIP är ett giftigt lösnings medel som är dyrt och opraktiskt att skala på grund av hälso problem och miljömässiga överväganden.
En ny strategi för rssp solvatiseringen utvecklades som överbryggas den tekniska klyftan mellan de hårda organiska lösnings medel hfip och andra tekniker som selektivt fungerade för rssp solvatiseringen. Kombinationen av specifika Heat och tryck tillämpades på SUS pensioner av rSSp och vatten. Resultaten var nära 100% solvatiseringen och återhämtning av rssp, samt hög proteinkoncentrationer; en mängd olika material former bestämdes vara möjligt från dessa formuleringar som inte var alla kan uppnås med hjälp av hfip eller andra organiska lösnings medel3,4,5,6. Syftet med detta tillvägagångs sätt är att effektivt och enkelt solubilisera renade och torkade rekombinanta spindel proteiner i en vatten lösning som sedan kan användas för produktion av en mängd olika material former.
Fibrer, filmer, beläggningar, lim, hydrogels, lyogels, microspheres, och svamp material är alla lätt accomplishable från samma vattenhaltiga rSSp lösning med hjälp av denna metod. Den fortsatta utvecklingen av denna metod, inte bara med ytterligare rssp men med andra proteiner, kan leda till nya material former och alternativa proteiner rening och inlösning avenyer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Efter rekombinant spindel silke proteiner renas de måste sedan beredas i en lösning som kan användas för material bildning. Genom att blanda frystorkad spindel silke protein med vatten och utsätta denna blandning för att mikrovågs bestrålning, för att generera värme och tryck, det möjligt att förbereda en rSSp lösning. En mängd olika material former kan produceras från denna enkla och effektiva metod för rSSp solubilization. Varje material måste vara unikt för berett och bearbetat för att uppnå önska…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna skulle vilja tacksamt erkänna finansiering från Utah Science and Technology Research (USTAR) initiativ.
Materials
| 3 mL Syringe with Luer-Lok Tip | BD | 309657 | Other size syringes can be used but to keep the tips on, it is advised to use luer-lok tips |
| 4 mL culture vial, clear with rubber lined cap | Wheaton | 225142 | Minimum dope volume is 1mL, max is 2mL |
| 8 mL culture vial, clear with rubber lined cap | Wheaton | 225144 | Minimum dope volume is 2mL, max is 4mL |
| 99% Isopropyl Alcohol, Reagent ACS/USP Grade | Pharmco-Aaper | 231000099 | |
| Freezone 4.5 Plus | Labconco | 7386030 | Freeze Dryer |
| Luer Adapter Female Luer x 10-32 Female, Tefzel (ETFE) | IDEX | P-629 | |
| Microwave | Magic Chef | HMD1110B | 120V, 60Hz AC; 1000 watts; 1.1 cu. ft. capacity; with glass turn table |
| One-Piece Fingertight 10-32 Coned, for 1/16" OD | IDEX | F-120X | |
| PEEK Tubing 1/16" OD x 0.010" ID | IDEX | 1531B | |
| Sprayer: Master Airbrush | Master Airbrush | TC-60 |
References
- Huemmerich, D., et al. Primary Structure Elements of Spider Dragline Silks and Their Contribution to Protein Solubility. Biochemistry. 43 (42), 13604-13612 (2004).
- Schacht, K., Scheibel, T. Controlled Hydrogel Formation of a Recombinant Spider Silk Protein. Biomacromolecules. 12 (7), 2488-2495 (2011).
- Jones, J. A., et al. More Than Just Fibers: An Aqueous Method for the Production of Innovative Recombinant Spider Silk Protein Materials. Biomacromolecules. 16 (4), 1418-1425 (2015).
- Tucker, C. L., et al. Mechanical and Physical Properties of Recombinant Spider Silk Films Using Organic and Aqueous Solvents. Biomacromolecules. 15 (8), 3158-3170 (2014).
- Harris, T. I., et al. A Sticky Situation: An Investigation of Robust Aqueous-Based Recombinant Spider Silk Protein Coatings and Adhesives. Biomacromolecules. 17 (11), 3761-3772 (2016).
- Jones, J. A., et al. Importance of Heat and Pressure for Solubilization of Recombinant Spider Silk Proteins in Aqueous Solution. International Journal of Molecular Sciences. 17 (11), 1955 (2016).
- Copeland, C. G., Bell, B. E., Christensen, C. D., Lewis, R. V. Development of a Process for the Spinning of Synthetic Spider Silk. ACS Biomaterials Science and Engineering. 1 (7), 557-584 (2015).
- Arcidiacono, S., et al. Aqueous Processing and Fiber Spinning of Recombinant Spider Silks. Macromolecules. 35 (4), 1262-1266 (2002).
- Work, R. W. Mechanisms of Major Ampullate Silk Fiber Formation by Orb-Web-Spinning Spiders. Transactions of the American Microscopical Society. 96 (2), 170-189 (1977).
- Decker, R. E., et al. Method for the Destruction of Endotoxin in Synthetic Spider Silk Proteins. Scientific Reports. 8 (12166), 1-6 (2018).
