Materiale dannelse av rekombinant Spider silke gjennom vandig løsnings ved hjelp av varme og trykk
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å produsere vannløselige rekombinant Spider silke protein løsninger og materialet skjemaer som kan dannes fra disse løsningene.
Abstract
Mange edderkopper produsere syv typer silke. Seks av silke er fiber i form når produsert av edderkopper. Disse fibrene er ikke vannløselige. For å reprodusere den bemerkelsesverdige mekaniske egenskaper edderkopp silke, må de produseres i heterologous verter som edderkopper er både territorielle og kannibalistiske. Den syntetiske analogs av edderkopp silke pleier også å være uløselig i vandige løsninger. Således, en stor andel av forskningen i rekombinant Spider silke stole på organiske løsemidler som er skadelig for Storskalaproduksjon av materialer. Vår gruppes metode tvinger løsnings av disse rekombinant Spider silke i vann. Bemerkelsesverdig, når disse proteinene er utarbeidet ved hjelp av denne metoden for varme og trykk, et bredt spekter av materielle former kan tilberedes fra samme løsning av rekombinant Spider silke proteiner (rSSp) inkludert: filmer, fibre, svamp, hydrogel, lyogel, og lim. Denne artikkelen demonstrerer produksjonen av solvated rSSp og materielle former på en måte som er lettere forstått enn fra skriftlige materialer og metoder alene.
Introduction
Spider silke har fått interessen av materielle forskere for deres imponerende kombinasjon av styrke, elastisitet og biokompatibilitet. Gjenskape fibre har tradisjonelt vært den stakk av forskningen. Dette arbeidet ble hemmet av rekombinant Spider Silk protein (rSSp) uoppløselig i vann, samt manglende evne til tradisjonelle løsnings teknikker (chaotropic midler og vaskemidler) for å oppnå vandig løsnings. Videre, teknikker som er utviklet for solvating versjoner av rSSp fungerer ikke på alle rSSp varianter og krever også betydelig manipulasjon og tid som ofte resulterer i protein tap1,2. Dette har i stor grad resultert i feltet bruker 1, 1, 1, 3, 3, 3-hexafluoroisopropanol (HFIP) som et løsemiddel for å danne fibre, og andre begrensede materielle former. Fordelen er at alle kjente rSSp er løselig i HFIP, og gir data ensartethet mellom hver forskningsgruppe. Ulempen er at HFIP er en giftig løsemiddel som er dyrt og upraktisk å skalere på grunn av helsemessige bekymringer og miljømessige hensyn.
En ny tilnærming til rSSp løsnings ble utviklet som Brokoblet den teknologiske gapet mellom de harde organiske løsemiddel HFIP og andre teknikker som selektivt jobbet for rSSp løsnings. Kombinasjonen av spesifikke Heat og trykk ble brukt til suspensjoner av rSSp og vann. Resultatene var nær 100% Løsnings og gjenvinning av rSSp, så vel som høye protein konsentrasjoner; en rekke materialer former ble bestemt å være mulig fra disse formuleringer som ikke var oppnåelig ved hjelp av HFIP eller andre organiske løsemidler3,4,5,6. Målet med denne tilnærmingen er å effektivt og enkelt solubilize renset og tørket rekombinant Spider proteiner i en vandig løsning som deretter kan utnyttes for produksjon av en rekke materielle former.
Fibre, filmer, belegg, lim, hydrogeler, lyogels, mikrosfærer, og svamp materialer er alle lett accomplishable fra samme vandig rSSp løsning ved hjelp av denne metoden. Den fortsatte utviklingen av denne metoden, ikke bare med ekstra rSSp men med andre proteiner, kan føre til nye materielle former og alternative protein rensing og oppløseliggjøringen avenyer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Etter rekombinant Spider silke proteiner er renset de må da være forberedt på en løsning som kan brukes til Material dannelse. Ved å blande lyofilisert edderkopp silke protein med vann og utsette denne blandingen til mikrobølgeovn bestråling, for å generere varme og trykk, er det mulig å forberede en rSSp løsning. Et bredt utvalg av materielle former kan produseres fra denne enkle og effektive metoden for rSSp oppløseliggjøringen. Hvert materiale må være unikt forberedt og behandlet for å oppnå ønsket ut…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takknemlig erkjenner finansiering fra Utah Science and Technology Research (USTAR) initiativ.
Materials
| 3 mL Syringe with Luer-Lok Tip | BD | 309657 | Other size syringes can be used but to keep the tips on, it is advised to use luer-lok tips |
| 4 mL culture vial, clear with rubber lined cap | Wheaton | 225142 | Minimum dope volume is 1mL, max is 2mL |
| 8 mL culture vial, clear with rubber lined cap | Wheaton | 225144 | Minimum dope volume is 2mL, max is 4mL |
| 99% Isopropyl Alcohol, Reagent ACS/USP Grade | Pharmco-Aaper | 231000099 | |
| Freezone 4.5 Plus | Labconco | 7386030 | Freeze Dryer |
| Luer Adapter Female Luer x 10-32 Female, Tefzel (ETFE) | IDEX | P-629 | |
| Microwave | Magic Chef | HMD1110B | 120V, 60Hz AC; 1000 watts; 1.1 cu. ft. capacity; with glass turn table |
| One-Piece Fingertight 10-32 Coned, for 1/16" OD | IDEX | F-120X | |
| PEEK Tubing 1/16" OD x 0.010" ID | IDEX | 1531B | |
| Sprayer: Master Airbrush | Master Airbrush | TC-60 |
References
- Huemmerich, D., et al. Primary Structure Elements of Spider Dragline Silks and Their Contribution to Protein Solubility. Biochemistry. 43 (42), 13604-13612 (2004).
- Schacht, K., Scheibel, T. Controlled Hydrogel Formation of a Recombinant Spider Silk Protein. Biomacromolecules. 12 (7), 2488-2495 (2011).
- Jones, J. A., et al. More Than Just Fibers: An Aqueous Method for the Production of Innovative Recombinant Spider Silk Protein Materials. Biomacromolecules. 16 (4), 1418-1425 (2015).
- Tucker, C. L., et al. Mechanical and Physical Properties of Recombinant Spider Silk Films Using Organic and Aqueous Solvents. Biomacromolecules. 15 (8), 3158-3170 (2014).
- Harris, T. I., et al. A Sticky Situation: An Investigation of Robust Aqueous-Based Recombinant Spider Silk Protein Coatings and Adhesives. Biomacromolecules. 17 (11), 3761-3772 (2016).
- Jones, J. A., et al. Importance of Heat and Pressure for Solubilization of Recombinant Spider Silk Proteins in Aqueous Solution. International Journal of Molecular Sciences. 17 (11), 1955 (2016).
- Copeland, C. G., Bell, B. E., Christensen, C. D., Lewis, R. V. Development of a Process for the Spinning of Synthetic Spider Silk. ACS Biomaterials Science and Engineering. 1 (7), 557-584 (2015).
- Arcidiacono, S., et al. Aqueous Processing and Fiber Spinning of Recombinant Spider Silks. Macromolecules. 35 (4), 1262-1266 (2002).
- Work, R. W. Mechanisms of Major Ampullate Silk Fiber Formation by Orb-Web-Spinning Spiders. Transactions of the American Microscopical Society. 96 (2), 170-189 (1977).
- Decker, R. E., et al. Method for the Destruction of Endotoxin in Synthetic Spider Silk Proteins. Scientific Reports. 8 (12166), 1-6 (2018).
