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Bioengineering

Formation matérielle de soies d’araignée recombinantes par solvatation aqueuse utilisant la chaleur et la pression

doi: 10.3791/59318 Published: May 6, 2019

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour produire des solutions de protéines de soie d’araignée recombinantes solubles dans l’eau et les formes matérielles qui peuvent être formées à partir de ces solutions.

Abstract

De nombreuses araignées produisent sept types de soies. Six des soies sont des fibres sous forme lorsqu’elles sont produites par les araignées. Ces fibres ne sont pas solubles dans l’eau. Afin de reproduire les remarquables propriétés mécaniques des soies d’araignée, elles doivent être produites dans des hôtes hétérologues car les araignées sont à la fois territoriales et cannibales. Les analogues synthétiques de la soie d’araignée ont également tendance à être insoluble dans les solutions aqueuses. Ainsi, un grand pourcentage de recherches sur les soies d’araignée recombinantes reposent sur des solvants organiques qui nuisent à la production à grande échelle de matériaux. La méthode de notre groupe force la solvatation de ces soies d’araignée recombinantes dans l’eau. Remarquablement, lorsque ces protéines sont préparées à l’aide de cette méthode de chaleur et de pression, une large gamme de formes matérielles peut être préparée à partir de la même solution de protéines de soie d’araignée recombinantes (rSSp), y compris: films, fibres, éponge, hydrogel, lyogel, et adhésifs. Cet article démontre la production du rSSp solvaté et des formes matérielles d’une manière plus facile à comprendre que des matériaux écrits et des méthodes seules.

Introduction

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Les soies d’araignée ont suscité l’intérêt des scientifiques matériels pour leur impressionnante combinaison de force, d’élasticité et de biocompatibilité. La recréation des fibres a traditionnellement été la poussée de la recherche. Cet effort a été entravé par la protéine de soie d’araignée recombinante (rSSp) insolubilité dans l’eau ainsi que l’incapacité des techniques de solvatation traditionnelles (agents chaotropes et détergents) pour obtenir la solvatation aqueuse. En outre, les techniques qui ont été développées pour la solvatation des versions de RSSP ne fonctionnent pas sur toutes les variantes RSSP et nécessitent également une manipulation substantielle et le temps qui se traduit souvent par la perte de protéine1,2. Cela s’est traduit en grande partie par le champ utilisant le 1, 1, 1, 3, 3, 3-hexafluoroisopropanol (HFIP) comme solvant pour former des fibres, et d’autres formes matérielles limitées. L’avantage étant que tous les rSSp connus sont solubles dans le HFIP, fournissant l’uniformité des données entre chaque groupe de recherche. L’inconvénient est que le HFIP est un solvant toxique qui est coûteux et peu pratique à l’échelle en raison de problèmes de santé et de considérations environnementales.

Une nouvelle approche de la solvatation rSSp a été développée qui a comblé l’écart technologique entre le solvant organique sévère HFIP et d’autres techniques qui ont fonctionné sélectivement pour la solvatation de rSSp. La combinaison de chaleurs et de pressions spécifiques a été appliquée aux suspensions de rSSp et d’eau. Les résultats ont été près de 100% de solvatation et de récupération du rSSp, ainsi que des concentrations élevées de protéines; une variété de formes de matériaux ont été déterminées comme étant possibles à partir de ces formulations qui n’étaient pas toutes réalisables à l’aide de HFIP ou d’autres solvants organiques3,4,5,6. L’objectif de cette approche est de solubiliser efficacement et facilement les protéines d’araignée recombinantes purifiées et séchées dans une solution aqueuse qui peut ensuite être utilisée pour la production d’une variété de formes matérielles.

Les fibres, les films, les revêtements, les adhésifs, les hydrogels, les lyogels, les microsphères et les matériaux éponge sont tous facilement utilisables à partir de la même solution aqueuse de rSSp utilisant cette méthode. L’évolution continue de cette méthode, non seulement avec rSSp supplémentaire, mais avec d’autres protéines, pourrait conduire à de nouvelles formes matérielles et alternatives de purification des protéines et des avenues de solubilisation.

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Protocol

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1. préparation de mélange de soie d’araignée recombinante à partir de stocks protéiques lyophilisés

  1. Déterminer la formulation et le volume nécessaires pour les formations de matériaux prévues. Les formulations typiques varient de 3% (w/v) à 15% (w/v). À l’aide de cette sélection, calculez les rSSp, les concentrations et les ratios appropriés.
    1. Utiliser les formulations respectives suivantes pour préparer chaque matière décrite dans le présent protocole: hydrogels/éponges/lyogels, 6% (p/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; films/revêtements, 5% (p/v) 80:20 MaSp1: MaSp2; adhésifs, 12% (p/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; fibres, 12,5% (p/v) 80:20 MaSp1: MaSp2.
      Remarque: même si la plupart des formulations sont mieux ajustées pour des formes et des matériaux spécifiques, il existe un large éventail de formulations qui peuvent souvent se chevaucher. En outre, les matériaux rSSp finaux peuvent également être adaptés pendant la formation et le traitement pour produire les propriétés souhaitées. En général, chaque protéine nécessitera une investigation sur des paramètres appropriés ou utiles.
  2. Sélectionnez un flacon de culture en verre borosilicaté autoclavable de 8 mL propre et neuf avec un bouchon à vis doublé en caoutchouc.
  3. Retirez le bouchon et placez le flacon vide sur une balance analytique. Tare la masse du flacon vide de sorte que la balance lit la masse zéro.
  4. Ajouter la poudre de rSSp lyophilisée désirée au flacon vide pour chaque matériau spécifique.
    1. Utiliser ces masses spécifiques de chaque type de protéine pour chaque matière, lors de la préparation d’un 2 mL de solution: hydrogels/éponges/lyogels, 60 mg de MaSp1 et 60 mg de MaSp2; films/revêtements, 80 mg de MaSp1 et 20 mg de MaSp2; adhésifs, 120 mg de MaSp1 et 120 mg de MaSp2; fibres, 200 mg de MaSp1 et 50 mg de MaSp2.
  5. Ajouter la quantité désirée d’eau ultrapure, au moins 2 mL, au flacon contenant déjà les poudres rSSp pondérées.
    Remarque: un volume minimal de 2 mL est recommandé pour toutes les procédures de solvatation.
  6. Sceller le bouchon du flacon et tourbillonner vigoureusement le contenu pour créer un mélange dispersé et homogène, rSSp qui est maintenant prêt pour la procédure de solvatation. Des approches d’homogénéisation supplémentaires telles que la sonication ou le mélange de la turbine peuvent être employées avec, ou en plus, le mélange de Vortex.

2. solvatation de la soie d’araignée recombinante

ATTENTION: des Chaleurs et des pressions élevées sont générées pendant la procédure de solvatation. Un équipement de protection personnel adéquat, en particulier des lunettes, des manches longues et des gants résistants à la chaleur sont nécessaires pour ce processus.

  1. Effectuer une vérification finale du flacon, ou du récipient, pour s’assurer qu’il a été fermement et solidement serré. Transférer ensuite le mélange rSSp suspendu à un four à micro-ondes conventionnel.
    Remarque: les appareils à micro-ondes dans la plage de puissance de 700 à 1 500 watts, possédant de plus petites capacités internes de chambre, et des plates-formes tournantes sont recommandés pour fournir de meilleures conditions de solvatation.
  2. Commencer le fonctionnement du micro-ondes avec des rafales de 5 s à pleine puissance. Après chaque éclatement, ouvrir brièvement la porte et mélanger/Agiter délicatement le flacon pour éviter de décantation et de maintenir le mélange suspendu.
  3. Répéter ce processus à micro-ondes jusqu’à ce que le mélange et/ou la solution ait obtenu une température d’au moins 130 ° c, mesurée avec un thermomètre infrarouge directement contre la solution contenant des portions du flacon. Répétez ce processus jusqu’à ce que toutes les particules solides aient été complètement dissoutes et ne soient plus visibles.
    NOTE: il est suggéré de permettre au flacon et à la solution de refroidir occasionnellement, surtout si la formulation présente une forte concentration de rSSp. Les températures dépassant 200 ° c augmentent le risque de défaillance du joint de flacon. Une attention particulière doit également être accordée pour empêcher le mélange/solution surchauffé de toucher le joint, ce qui entraînera également une défaillance du confinement du flacon.
  4. Après avoir réussi à solvatation le mélange RSSP dans une solution, laissez la température de la solution et le bouchon du flacon refroidir au-dessous de 100 ° c (point d’ébullition) avant l’ouverture.

3. les hydrogels

  1. Préparer un hydrogel de la solution après l’avoir enlevé du micro-ondes et lui permettre de refroidir et de régler. Jeter l’hydrogel dans des géométries spécifiques avant de lui permettre de refroidir complètement.
    Remarque: différents rSSps nécessiteront des quantités variées de temps pour passer à un hydrogel. Par exemple, les séquences de type MaSp2 tendent à former des hydrogels plus rapidement par rapport aux séquences de type MaSp1. Les concentrations de protéines, la salinité et le pH affectent aussi directement le taux de transition vers un hydrogel.

4. éponges

  1. Préparez une éponges RSSP en permettant d’abord à la solution solvatés primaire de former un hydrogel.
  2. Placer l’hydrogel dans un bain d’eau, placer ce bain dans le congélateur à-20 ° c, et attendre que le bain soit complètement gelé.
  3. Terminez le processus de formation de l’éponge en enlevant l’hydrogel congelé et le bain d’eau du congélateur et décongelant à 25 ° c. L’éponge résultante peut maintenant être retirée de l’eau dégelé.

5. lyogel

  1. Préparer un lyogel rSSp en gelant directement un hydrogel formé, soit avec ou sans bain d’eau, et en transfèrement l’échantillon d’hydrogel congelé dans un lyophilisateur (lyophilisateur).
  2. Retirez le matériau de gel lyophilisé final du récipient dans lequel la sublimation de l’humidité s’est produite.

6. films et revêtements

  1. Utilisez l’une des trois méthodes suivantes: moulage de solution, pulvérisation de solution ou revêtement DIP pour produire des films ou des revêtements de rSSp.
    1. Lancez la solution de soie solubilisée dans/sur les formes de la forme désirée.
    2. Verser et étaler 200 μL de la solution de film et laisser sécher avant de les éplucher sur le substrat de la RPDB pour l’essai ou le traitement.
    3. Après avoir permis à ces derniers de sécher, retirer les films formés pour les essais mécaniques ou post-traiter les films pour améliorer les propriétés mécaniques.
  2. Pour préparer un enduit, ou un film qui ne peut pas être enlevé du substrat, utilisez soit le revêtement de pulvérisation ou de trempette pour produire une couche mince de film.
    Remarque: pour pulvériser le pelage, ce protocole a trouvé le succès avec un pulvérisateur de peinture de modèle d’aérographe principal.
    1. Former un revêtement DIP en submergeant simplement le substrat de choix dans le rSSp solubilisé et répéter après séchage pour obtenir l’épaisseur désirée.
    2. Effectuer une première couche de pulvérisation avant d’appliquer une couche de trempette pour augmenter la consistance et l’efficacité du revêtement final.

7. adhésifs

Remarque: la formation d’adhésifs est obtenue par l’une des méthodes suivantes.

  1. Ajouter directement le rSSp solubilisé sur un substrat, puis appliquer un deuxième substrat sur le dessus de la solution. Serrer fermement les pièces ensemble, puis sécher les échantillons dans un four avec une température minimale de 25 ° c pendant au moins 16 h.
  2. Alternativement, vaporisez les deux surfaces de substrat avec un enduit de pulvérisation, puis serrez les substrats ensemble.
  3. L’application du rSSp par la méthode de trempette du revêtement des substrats et du collage des substrats peut également être utilisée pour préparer et coller.

8. fibres filées à l’eau

  1. Chargez la solution de Dope solubilisée dans une seringue concentrique avec la pointe Luer-Lok à travers une aiguille de glissement de 19 G. Éjectez les bulles d’air et laissez la dope s’asseoir à l’extrémité Luer-Lok de la seringue.
  2. Insérez au moins 25 mm de tube PEEK, diamètre intérieur 0,01 pouce, dans les raccords à doigt monobloc de la tubulure PEEK pour 1/16 pouce OD et 10/32 cône. Fixez ce raccord sur un tube PEEK à l’adaptateur Luer-Lok femelle.
    1. Remplacez l’aiguille de calibre 19 par cette mise en place sur la seringue chargée.
  3. Remplissez un grand bain de verre clair avec 99% d’isopropanol pur à utiliser pour le bain de coagulation.
    1. Remplissez les bains extensibles, situés sous les godets extensibles. Ceux-ci auront 80:20 isopropanol: eau distillée dans le premier bain extensible, et 20:80 isopropanol: eau distillée dans le deuxième bain extensible.
  4. Réglez le système d’étirement de godet de telle sorte que le premier godet après le bain de coagulation et le premier godet dans le premier bain extensible tournent à la même vitesse.
    1. Initier le premier tronçon en ajustant les vitesses du godet final dans le bain extensible 1, le godet supérieur du milieu, et le premier godet dans le bain extensible 2 à la même vitesse. Cette vitesse sera 2x aussi rapide que la vitesse initiale de retrait de la fibre.
    2. Lancez le deuxième tronçon en ajustant les vitesses du godet final dans le bain extensible 2, le dernier godet supérieur et l’enrouleur à la même vitesse. Cette vitesse sera 2x aussi rapide que la vitesse utilisée pour le premier tronçon ou 4x la vitesse initiale d’enlèvement des fibres.
    3. Placez des gants en nitrile à l’extérieur des godets intermédiaires pour empêcher la fibre de glisser.
  5. Commencer à extruder lentement la solution dans le bain de coagulation. Dans un système automatisé, réglez le taux d’extrusion pour qu’il corresponde à une vitesse d’enlèvement de 10 mm/s.
    1. Permettre l’extrusion de fibres pour devenir uniforme avant de tirer les fibres hors de la baignoire en utilisant un crochet en métal mince ou forceps. Vérifier la suppression de la fibre de la baignoire a créé une boucle entre la pointe du tube PEEK et le chemin de la fibre laissant le bain le bain.
  6. Guider la fibre Récupérée à travers la série de godets tels que la fibre est submergée dans les bains extensibles, mais le séchage dans l’air entre les bains extensibles et avant d’aller sur une bobine. Ce séchage est réalisé par les godets intermédiaires les plus élevés.
    Remarque: le taux d’enlèvement des fibres et/ou le taux d’extrusion devront être ajustés en fonction de la concentration en protéines, des additifs et du type de protéine pour permettre un temps de coagulation suffisant sans mettre en commun les fibres sur le fond du bain de coagulation.
  7. Fixez la fibre entièrement tendue à la bobine sur le mécanisme de l’enrouleur à l’aide de ruban adhésif.

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Representative Results

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De la méthode décrite de solubilisation de rSSp, une variété de formes matérielles peut être obtenue comme on le voit dans la figure 1. La méthode de solubilisation est d’appliquer la chaleur et la pression, générées par un micro-ondes conventionnel, à une suspension de rSSp et d’eau. Lorsque des températures et des pressions critiques sont atteintes, la protéine se solubiliser. De cette solution solubilisée de rSSp, les conditions requises sont présentées pour sept formes matérielles: hydrogels, lyogels, éponge, adhésifs, revêtements, films, et fibres. Les hydrogels sont préparés en permettant au rSSp solubilisé de refroidir et d’auto-associer naturellement. Un lyogel est préparé par lyophilisation de l’hydrogel. Le matériau éponge est formé en gelant l’hydrogel alors qu’il est immergé dans l’eau. Les films peuvent être préparés en jetant le rSSp solubilisé sur les surfaces de la SSPP (et d’autres surfaces aménables) et séchés. Le RPDB permet de retirer facilement le film pour les traitements post-traitement ou l’analyse. Les revêtements et les adhésifs sont générés à l’aide de méthodes de pulvérisation ou de trempette ou de combinaisons de pulvérisation et de trempette. Les fibres exigent le traitement le plus étendu en extrudant dans un bain de coagulation, puis étirant en série la fibre brute dans les bains extensibles post-spin. Les fibres peuvent être générées en extrudant dans un bain de coagulation seul. Cependant, la meilleure capacité mécanique dans les fibres nécessite l’étirement dans les bains extensibles post-spin3,7,8,9.

Figure 1
Figure 1: solvatation aqueuse et matériaux rSSp. Images représentatives des matériaux qui ont été formulés à l’aide de cette méthode de solubilisation de la chaleur et de la pression avec le rSSp solvaté dans l’eau. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

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Après que les protéines de soie d’araignée recombinantes soient purifiées, elles doivent ensuite être préparées dans une solution qui peut être utilisée pour la formation de matériaux. En mélangeant la protéine de soie d’araignée lyophilisée à l’eau et en exposant ce mélange à l’irradiation par micro-ondes, pour générer de la chaleur et de la pression, il est possible de préparer une solution rSSp. Une grande variété de formes matérielles peut être produite à partir de cette méthode simple et efficace de solubilisation rSSp. Chaque matériau doit être préparé et traité de façon unique pour obtenir les résultats souhaités et les propriétés. Avec des modifications mineures des formulations initiales, des conditions de formation et/ou des paramètres de traitement, chaque matériau peut être facilement ajusté à l’aide de cette méthode. Il y a plus de formes que ce qui est présenté ici et par d’autres investigations par d’autres sur le terrain, ces matériaux continueront à évoluer pour explorer de nouvelles formes matérielles en utilisant cette technique.

À condition que la solution soit composée principalement d’eau et de protéines (les additifs peuvent être utilisés pour retarder la gélification et améliorer la stabilité des solutions), la possibilité de fonctionnalisation avec des composants biologiquement actifs est grandement améliorée dans comparaison avec les solutions rSSp basées sur HFIP. Une variété de composants, mais pas des échantillonnements exhaustifs ont été inclus dans les idiots et donc les formes matérielles, y compris: antibiotiques, antimycotiques, héparine, nanoparticules d’argent, et intégrines pour l’adhérence des cellules. En plus des additifs, plusieurs protéines de soie d’araignée recombinante de différentes tailles, séquences, natures et sources ont été solvées avec succès avec cette méthode et utilisées dans la formation des matériaux décrits dans ce protocole.

En élargissant encore l’utilité de cette méthode de solubilisation pour non seulement rSSp mais toutes les protéines solvées dans cette méthode, est que les solutions sont stériles à condition que la température et les pressions à l’intérieur du flacon ou de la Chambre soient suffisamment élevées. Ces solutions peuvent être et ont été prises directement à la culture cellulaire sans contaminer les cultures.

Si ces matières doivent être prises directement dans des systèmes in vivo, il faut s’attaquer aux niveaux d’endotoxine. Une méthode de triple autoclave qui détruit les endotoxines de sorte que leurs niveaux sont à, ou en dessous, le recommandé 0,25 EU/mL a récemment été rapporté10. Bien que l’autoclave soit utile pour détruire l’endotoxine, ses pressions et ses températures ne parviennent généralement pas à atteindre la température ou la pression critique nécessaire pour complètement solvate tous les échantillons de rSSp tentés à ce jour6. Cela nécessite un micro-ondulation ou un réacteur de température/pression nécessaire pour terminer la solvatation.

De façon unique, l’élimination de l’endotoxine et la solvatation du matériau à l’aide de la chaleur et de la pression ne dégradent pas la protéine ou la capacité mécanique de la forme matérielle résultante4,5,6,7. Il est apprécié qu’il y ait probablement un point de basculement d’obtenir trop élevé de pression et/ou de température et trop de cycles de chaleur et de pression qui se traduit par la capacité mécanique dégradée et/ou la destruction de la protéine. Ce point de basculement variera vraisemblablement pour le type de rSSp solvaté et, dans une certaine mesure, la longueur du rSSp utilisé. Cependant, avec cette méthode de solvatation de base, plusieurs expériences de solvatations de dépistage peuvent être effectuées en bref afin de délimiter la température de solvatations et les pressions nécessaires pour des protéines spécifiques.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Les auteurs aimeraient remercier avec gratitude le financement de l’initiative de recherche scientifique et technologique de l’Utah (USTAR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3 mL Syringe with Luer-Lok Tip BD 309657 Other size syringes can be used but to keep the tips on, it is advised to use luer-lok tips
4 mL culture vial, clear with rubber lined cap Wheaton 225142 Minimum dope volume is 1mL, max is 2mL
8 mL culture vial, clear with rubber lined cap Wheaton 225144 Minimum dope volume is 2mL, max is 4mL
99% Isopropyl Alcohol, Reagent ACS/USP Grade Pharmco-Aaper 231000099
Freezone 4.5 Plus Labconco 7386030 Freeze Dryer
Luer Adapter Female Luer x 10-32 Female, Tefzel (ETFE) IDEX P-629
Microwave Magic Chef HMD1110B 120V, 60Hz AC; 1000 watts; 1.1 cu. ft. capacity; with glass turn table
One-Piece Fingertight 10-32 Coned, for 1/16" OD IDEX F-120X
PEEK Tubing 1/16" OD x 0.010" ID IDEX 1531B
Sprayer: Master Airbrush Master Airbrush TC-60

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References

  1. Huemmerich, D., et al. Primary Structure Elements of Spider Dragline Silks and Their Contribution to Protein Solubility. Biochemistry. 43, (42), 13604-13612 (2004).
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Cite this Article

Jones, J. A., Harris, T. I., Bell, B. E., Oliveira, P. F. Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure. J. Vis. Exp. (147), e59318, doi:10.3791/59318 (2019).More

Jones, J. A., Harris, T. I., Bell, B. E., Oliveira, P. F. Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure. J. Vis. Exp. (147), e59318, doi:10.3791/59318 (2019).

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