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Bioengineering

Formazione del materiale di sete di ragno ricombinante attraverso la Solvazione acquosa utilizzando calore e pressione

doi: 10.3791/59318 Published: May 6, 2019

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per produrre soluzioni di proteina di seta ragno ricombinante solubile in acqua e le forme di materiale che possono essere formate da queste soluzioni.

Abstract

Molti ragni producono sette tipi di sete. Sei dei sete sono fibre in forma quando prodotte dai ragni. Queste fibre non sono solubili in acqua. Al fine di riprodurre le notevoli proprietà meccaniche delle sete di ragno, devono essere prodotte in padroni eterolodi come i ragni sono sia territoriali che cannibali. Anche gli analoghi sintetici della seta di ragno tendono ad essere insolubili in soluzioni acquose. Così, una grande percentuale di ricerca in sete di ragno ricombinante si basano su solventi organici che sono dannosi per la produzione su larga scala di materiali. Il metodo del nostro gruppo costringe la solvazione di questi sete di ragno ricombinanti in acqua. Sorprendentemente, quando queste proteine sono preparate utilizzando questo metodo di calore e pressione, una vasta gamma di forme di materiale può essere preparata dalla stessa soluzione di proteine di seta ragno ricombinante (rSSp) tra cui: film, fibre, spugna, hydrogel, lyogel, e adesivi. Questo articolo illustra la produzione di RSSP e forme di materiale solvatato in un modo che è più facilmente comprensibile che da solo materiali e metodi scritti.

Introduction

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I sete ragno hanno raccolto l'interesse degli scienziati materiali per la loro impressionante combinazione di forza, elasticità e biocompatibilità. Ricreare le fibre è stata tradizionalmente la spinta della ricerca. Questo sforzo è stato ostacolato dall'insolubilità di proteina di seta del ragno ricombinante (rSSp) in acqua, nonché dall'incapacità delle tecniche di solvazione tradizionali (agenti chaotropici e detergenti) di raggiungere la solvazione acquosa. Inoltre, le tecniche sviluppate per le versioni solvatanti di RSSP non funzionano su tutte le varianti RSSP e richiedono anche una manipolazione e un tempo sostanziali che spesso si traduce in perdita di proteine1,2. Questo ha portato in gran parte il campo utilizzando 1, 1, 1, 3, 3, 3-hexafluoroisopropanolo (HFIP) come un solvente da cui formare fibre, e altre forme limitate di materiale. Il vantaggio è che tutti i rSSp conosciuti sono solubili in HFIP, fornendo uniformità dei dati tra ogni gruppo di ricerca. Lo svantaggio è che HFIP è un solvente tossico che è costoso e poco pratico per scalare a causa di problemi di salute e considerazioni ambientali.

È stato sviluppato un nuovo approccio alla solvazione rSSp che ha colato il divario tecnologico tra il duro solvente organico HFIP e altre tecniche che hanno funzionato selettivamente per la solvazione rSSp. La combinazione di manches e pressioni specifiche è stata applicata alle sospensioni di rSSp e acqua. I risultati sono stati quasi 100% di solvazione e recupero del rSSp, nonché alte concentrazioni proteiche; una varietà di forme di materiali sono stati determinati per essere possibile da queste formulazioni che non erano tutti ottenibili utilizzando HFIP o altri solventi organici3,4,5,6. L'obiettivo di questo approccio è quello di solubilizzare efficacemente e facilmente le proteine del ragno ricombinante depurato e essiccato in una soluzione acquosa che può essere utilizzata per la produzione di una varietà di forme di materiale.

Fibre, pellicole, Rivestimenti, adesivi, idrogel, lyogel, microsfere e materiali in spugna sono tutti facilmente realizzabili dalla stessa soluzione acquosa di rSSp con questo metodo. L'evoluzione continua di questo metodo, non solo con ulteriori rSSp ma con altre proteine, potrebbe portare a nuove forme di materiale e vie alternative di purificazione e solubilizzazione delle proteine.

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Protocol

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1. preparazione della miscela di seta di ragno ricombinante da scorte proteiche liofilizzate

  1. Determinare la formulazione e il volume necessari per le formazioni di materiale previste. Le formulazioni tipiche vanno dal 3% (w/v) fino al 15% (p/v). Utilizzando questa selezione, calcolare l'rSSp, le concentrazioni e i rapporti appropriati.
    1. Utilizzare le seguenti formulazioni per preparare ogni materiale descritto nel presente protocollo: idrogel/spugne/lyogel, 6% (p/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; film/rivestimenti, 5% (p/v) 80:20 MaSp1: MaSp2; adesivi, 12% (p/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; fibre, 12,5% (p/v) 80:20 MaSp1: MaSp2.
      Nota: anche se la maggior parte delle formulazioni sono meglio montate per forme e materiali specifici, c'è una vasta gamma di formulazioni che spesso possono sovrapporsi. Inoltre, i materiali rSSp finali possono essere adattati anche durante la formazione e l'elaborazione per produrre le proprietà desiderate. In generale, ogni proteina richiederà l'analisi di parametri appropriati o utili.
  2. Selezionare un flaconcino di coltura in vetro borosilicato autoclavabile da 8 mL con un tappo a vite rivestito in gomma.
  3. Rimuovere il tappo e posizionare il flaconcino vuoto su una bilancia analitica. Tarare la massa del flaconcino vuoto in modo che la bilancia legga la massa zero.
  4. Aggiungere la polvere di rSSp liofilizzata desiderata al flaconcino vuoto per ogni materiale specifico.
    1. Utilizzare queste masse specifiche di ogni tipo di proteina per ogni materiale, quando si prepara un 2 mL di soluzione: idrogel/spugne/lyogel, 60 mg di MaSp1 e 60 mg di MaSp2; film/rivestimenti, 80 mg di MaSp1 e 20 mg di MaSp2; adesivi, 120 mg di MaSp1 e 120 mg di MaSp2; fibre, 200 mg di MaSp1 e 50 mg di MaSp2.
  5. Aggiungere la quantità desiderata di acqua ultrapura, almeno 2 mL, al flaconcino che contiene già le polveri rSSp ponderate.
    Nota: per tutte le procedure di solvazione è consigliato un volume minimo di 2 mL.
  6. Sigillare il tappo del flaconcino e agitare vivacemente il contenuto per creare una miscela di rSSp dispersa e omogenea che è ora pronta per la procedura di solvazione. Ulteriori approcci di omogeneizzazione come la sonicazione o la miscelazione della girante possono essere impiegati con, o in aggiunta, la miscelazione Vortex.

2. solvazione della seta del ragno ricombinante

Attenzione: durante la procedura di solvazione vengono generate alte manches e pressioni. Per questo processo sono necessari adeguati dispositivi di protezione individuale, in particolare occhiali, maniche lunghe e guanti resistenti al calore.

  1. Eseguire un controllo finale del flaconcino, o recipiente, tappo per assicurarsi che sia stato saldamente e saldamente serrati. Quindi trasferire la miscela rSSp sospesa in un forno a microonde convenzionale.
    Nota: le unità a microonde all'interno della gamma di potenza di 700 a 1.500 watt, in possesso di capacità camera interna più piccole, e piattaforme rotanti sono raccomandati per fornire migliori condizioni di solvazione.
  2. Iniziare il funzionamento del forno a microonde con 5 s scoppia a piena potenza. Dopo ogni scoppio aprire brevemente la porta e mescolare accuratamente/turbinare il flaconcino per evitare di sedimentare e mantenere la miscela sospesa.
  3. Ripetere questo processo a microonde fino a quando la miscela e/o la soluzione non ha ottenuto una temperatura di almeno 130 ° c, se misurata con un termometro a infrarossi direttamente contro la soluzione contenente porzioni del flaconcino. Ripetere questo processo fino a quando tutti i particolati solidi sono stati completamente disciolti e non sono più visibili.
    Nota: si suggerisce di consentire al flaconcino e alla soluzione di raffreddare occasionalmente, soprattutto se la formulazione ha un'alta concentrazione di rSSp presente. Temperature superiori a 200 ° c aumentano il rischio di rottura della guarnizione del flaconcino. Particolare attenzione deve essere prestata anche per evitare che la miscela/soluzione surriscaldata tocchi la guarnizione, il che comporterà anche un guasto di contenimento del flaconcino.
  4. Dopo aver risolto con successo la miscela di rSSp in una soluzione, consentire la temperatura della soluzione e il tappo del flaconcino per raffreddare al di sotto di 100 ° c (punto di ebollizione) prima dell'apertura.

3. idrogel

  1. Preparare un idrogel dalla soluzione dopo averlo rimosso dal forno a microonde e permettendo di raffreddare e impostare. Lanciare l'idrogel in geometrie specifiche prima di consentirlo di raffreddare completamente.
    Nota: diversi RSSP richiederanno diverse quantità di volte per passare a un idrogel. Ad esempio, le sequenze MaSp2-like tendono a formare idrogel più rapidamente rispetto alle sequenze simili a MaSp1. Le concentrazioni proteiche, la salinità e il pH influenzano direttamente anche il tasso di transizione verso un idrogel.

4. spugne

  1. Preparare una spugne RSSP consentendo prima la soluzione solvatato primaria di formare un idrogel.
  2. Mettere l'idrogel in un bagno d'acqua, mettere questo bagno nel congelatore a-20 ° c, e attendere fino a quando il bagno è congelato completamente.
  3. Completare il processo di formazione della spugna rimuovendo l'idrogel congelato e il bagno d'acqua dal congelatore e scongelando a 25 ° c. La spugna risultante può ora essere rimossa dall'acqua scongelato.

5. il lyogel

  1. Preparare un lyogel RSSP congelando direttamente un idrogel formato, con o senza bagnomaria, e trasferendo il campione di idrogel congelato a un liofilizzatore (Liofilizzato).
  2. Rimuovere il materiale gel liofilizzato finale dalla nave che si è verificata la sublimazione dell'umidità.

6. pellicole e rivestimenti

  1. Utilizzare uno dei tre metodi seguenti: fusione di soluzioni, spruzzatura di soluzioni o rivestimento DIP per produrre pellicole o rivestimenti di rSSp.
    1. Gettare la soluzione di seta solubilizzata in/su forme PDMS della forma desiderata.
    2. Versare e diffondere 200 μL della soluzione di pellicola e lasciar asciugare prima di staccarli dal substrato PDMS per il test o il trattamento.
    3. Dopo aver permesso a questi di asciugare, rimuovere le pellicole formate per prove meccaniche o post-trattare le pellicole per migliorare le proprietà meccaniche.
  2. Per preparare un rivestimento, o un film che non può essere rimosso dal substrato, utilizzare sia spray o dip coating per produrre uno strato di pellicola sottile.
    Nota: per spruzzare cappotto, questo protocollo ha trovato successo con un maestro aerografo modello spruzzatore di vernice.
    1. Formare un rivestimento DIP semplicemente immergendo il substrato di scelta nel rSSp solubilizzato e ripetere dopo l'essiccazione per ottenere lo spessore desiderato.
    2. Eseguire uno spray iniziale prima di applicare un DIP coat per aumentare la consistenza e l'efficacia del rivestimento finale.

7. adesivi

Nota: la formazione di adesivi è ottenuta attraverso uno dei seguenti metodi.

  1. Aggiungere direttamente il rSSp solubilizzato su un substrato e quindi applicare un secondo substrato sopra la parte superiore della soluzione. Serrare saldamente i pezzi e asciugare i campioni in un forno con una temperatura minima di 25 ° c per almeno 16 ore.
  2. In alternativa, spruzzare le due superfici del substrato con un rivestimento spray e quindi serrare insieme i substrati.
  3. Applicando il rSSp attraverso il metodo DIP di rivestimento dei substrati e attaccando i substrati può anche essere utilizzato per preparare e adesivo.

8. fibre filate a umido

  1. Caricare la soluzione di droga solubilizzata in una siringa concentrica con punta Luer-Lok attraverso un ago di scorrimento da 19 G. Espellere le bolle d'aria e lasciare che la droga si sieda all'estremità Luer-Lok della siringa.
  2. Inserire almeno 25 mm di tubo PEEK, diametro interno 0,01 pollici, nel tubo di PEEK di un pezzo stretto raccordi per 1/16 pollici OD e 10/32 cono. Collegare questo raccordo a un tubo PEEK all'adattatore femmina Luer-Lok.
    1. Sostituire l'ago da 19 gauge con questo set up sulla siringa caricata.
  3. Riempire un alto, bagno di vetro chiaro con 99% isopropanolo puro da utilizzare per il bagno di coagulazione.
    1. Riempire i bagni elasticizzati, che si trova sotto i godets stretch. Questi avranno 80:20 isopropanolo: acqua distillata nel primo bagno elastico, e 20:80 isopropanolo: acqua distillata nel secondo bagno stretch.
  4. Impostare il sistema di allungamento Godet in modo che il primo Godet dopo il bagno di coagulazione e il primo Godet nel primo bagno stretch ruotano alla stessa velocità.
    1. Avviare il primo tratto regolando le velocità del godet finale in bagno stretch 1, il Godet medio superiore, e il primo Godet in bagno stretch 2 alla stessa velocità. Questa velocità sarà 2x veloce come la velocità di rimozione della fibra iniziale.
    2. Avviare il secondo tratto regolando le velocità del godet finale in bagno stretch 2, l'ultimo Godet superiore, e l'avvolgitore alla stessa velocità. Questa velocità sarà 2x veloce come la velocità utilizzata per il primo tratto o 4x la velocità di rimozione delle fibre iniziali.
    3. Posizionare i guanti di nitrile all'esterno dei cilindri intermedi per evitare che la fibra scivoli.
  5. Iniziare a estinare lentamente la soluzione nel bagno di coagulazione. In un sistema automatizzato impostare il tasso di estrusione per abbinare una velocità di rimozione di 10 mm/s.
    1. Consentire l'estrusione della fibra per diventare uniforme prima di tirare le fibre fuori dal bagno utilizzando con un gancio metallico sottile o pinze. Verificare la rimozione della fibra dal bagno creato un loop tra la punta del tubo PEEK e il percorso della fibra lasciando il bagno il bagno.
  6. Guida la fibra recuperata attraverso la serie di cilindri in modo che la fibra sia sommersa nei bagni elasticizzati ma asciugando nell'aria tra i bagni elasticizzati e prima di andare su una bobina. Questa essiccazione è ottenuta dai godets intermedi posizionati più alti.
    Nota: il tasso di asportazione delle fibre e/o la velocità di estrusione dovranno essere regolati in base alla concentrazione proteica, agli additivi e al tipo di proteina per consentire un ampio tempo di coagulazione senza mettere in comune le fibre sul fondo del bagno di coagulazione.
  7. Collegare la fibra completamente allungata alla bobina sul meccanismo di avvolgimento utilizzando il nastro.

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Representative Results

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Dal metodo descritto di solubilizzazione di rSSp, una varietà di forme di materiale può essere ottenuta come si vede nella Figura 1. Il metodo di solubilizzazione è quello di applicare calore e pressione, generata da un forno a microonde convenzionale, ad una sospensione di rSSp e acqua. Quando si raggiungono temperature e pressioni critiche, la proteina si solubilizza. Da questa soluzione di rSSp solubilizzata, le condizioni richieste sono presentate per sette forme di materiale: idrogel, lyogel, spugna, adesivi, Rivestimenti, film e fibre. Gli idrogel sono preparati permettendo al rSSp solubilizzato di raffreddare e naturalmente auto-associarsi. Un lyogel viene preparato liofilizzando l'idrogel. Il materiale spugna è formato dal congelamento dell'idrogel mentre è immerso in acqua. I film possono essere preparati lanciando il rSSp solubilizzato su superfici PDMS (e altre superfici suscettibili) ed essiccati. Il PDMS consente di rimuovere facilmente il film per trattamenti post-trattamento o analisi. I rivestimenti e gli adesivi vengono generati utilizzando metodi spray o DIP o combinazioni di spray e dip. Le fibre richiedono la lavorazione più estesa estendendo in un bagno di coagulazione e poi allungando in serie la fibra grezza nei bagni elasticizzati post-spin. Le fibre possono essere generate estecando in un bagno di coagulazione da solo. Tuttavia, la migliore capacità meccanica nelle fibre richiede stretching in bagni elasticizzati post-spin3,7,8,9.

Figure 1
Figura 1: solvazione acquosa e materiali rSSp. Immagini rappresentative dei materiali che sono stati formulati utilizzando questo metodo di solubilizzazione di calore e pressione con RSSP solvatato in acqua. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

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Discussion

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Dopo che le proteine di seta del ragno ricombinante vengono purificate, devono essere preparate in una soluzione che può essere utilizzata per la formazione del materiale. Mescolando proteina di seta di ragno liofilizzata con acqua ed esponendo questa miscela all'irraggiamento a microonde, per generare calore e pressione, è possibile preparare una soluzione rSSp. Una vasta gamma di forme di materiale può essere prodotta da questo metodo semplice ed efficiente di solubilizzazione rSSp. Ogni materiale deve essere preparato e elaborato in modo univoco per ottenere il risultato e le proprietà desiderati. Con lievi alterazioni alle formulazioni iniziali, condizioni di formazione, e/o parametri di elaborazione, ogni materiale può essere facilmente regolato utilizzando questo metodo. Ci sono più forme che sono presentate qui e attraverso ulteriori indagini da parte di altri sul campo, questi materiali continueranno ad evolversi per esplorare nuove forme di materiale utilizzando questa tecnica.

A condizione che la soluzione sia costituita principalmente da acqua e proteine (gli additivi possono essere utilizzati per ritardare la gelazione e migliorare la stabilità delle soluzioni), la possibilità di funzionalizzazione con componenti biologicamente attivi è notevolmente migliorata in rispetto alle soluzioni rSSp basate su HFIP. Una varietà di componenti, ma non esaustivo campionamenti sono stati inclusi nei drogasse e quindi forme materiali tra cui: antibiotici, antimicotici, eparina, nanoparticelle d'argento, e integrine per l'adesione delle cellule. Oltre agli additivi, le proteine multiple di seta ragno ricombinante di varie dimensioni, sequenze, Nature e fonti sono state con successo con questo metodo e utilizzate nella formazione dei materiali descritti in questo protocollo.

Ampliando ulteriormente l'utilità di questo metodo di solubilizzazione per non solo RSSP ma tutte le proteine solvatato in questo metodo, è che le soluzioni sono sterili purché la temperatura e le pressioni all'interno del flaconcino o della camera siano sufficientemente elevate. Queste soluzioni possono essere e sono state prese direttamente alla coltura cellulare senza contaminare le culture.

Se questi materiali devono essere presi direttamente nei sistemi in vivo, occorre affrontare i livelli di endotossina. Un triplo metodo autoclave che distrugge endotossine in modo che i loro livelli sono a, o al di sotto, la raccomandata 0,25 EU/mL è stato recentemente riportato10. Mentre l'autoclave è utile per distruggere l'endotossina, le sue pressioni e temperature di solito non riescono a raggiungere la temperatura o la pressione critica necessaria per solvare completamente tutti i campioni rSSp tentati fino ad oggi6. Ciò richiede il Microwaving o un reattore di temperatura/pressione necessario per completare la solvazione.

In modo univoco, la rimozione di endotossina e la solvazione del materiale utilizzando calore e pressione non degradano la proteina o la capacità meccanica del materiale risultante forma4,5,6,7. È apprezzato che ci sia probabilmente un punto di svolta per ottenere troppo alto di pressione e/o temperatura e troppi cicli di calore e pressione che provoca degradata capacità meccanica e/o la distruzione della proteina. Questo punto di svolta probabilmente varierà per il tipo di RSSP solvatato e, in una certa misura, la lunghezza del RSSP utilizzato. Tuttavia, con questo metodo di base di solvazione, è possibile eseguire diversi esperimenti di solvazione esplorativa in breve per delineare la temperatura e le pressioni di risoluzione appropriate necessarie per le proteine specifiche.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Acknowledgments

Gli autori vorrebbero ringraziare con gratitudine i finanziamenti dell'iniziativa Utah Science and Technology Research (USTAR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3 mL Syringe with Luer-Lok Tip BD 309657 Other size syringes can be used but to keep the tips on, it is advised to use luer-lok tips
4 mL culture vial, clear with rubber lined cap Wheaton 225142 Minimum dope volume is 1mL, max is 2mL
8 mL culture vial, clear with rubber lined cap Wheaton 225144 Minimum dope volume is 2mL, max is 4mL
99% Isopropyl Alcohol, Reagent ACS/USP Grade Pharmco-Aaper 231000099
Freezone 4.5 Plus Labconco 7386030 Freeze Dryer
Luer Adapter Female Luer x 10-32 Female, Tefzel (ETFE) IDEX P-629
Microwave Magic Chef HMD1110B 120V, 60Hz AC; 1000 watts; 1.1 cu. ft. capacity; with glass turn table
One-Piece Fingertight 10-32 Coned, for 1/16" OD IDEX F-120X
PEEK Tubing 1/16" OD x 0.010" ID IDEX 1531B
Sprayer: Master Airbrush Master Airbrush TC-60

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References

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Jones, J. A., Harris, T. I., Bell, B. E., Oliveira, P. F. Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure. J. Vis. Exp. (147), e59318, doi:10.3791/59318 (2019).More

Jones, J. A., Harris, T. I., Bell, B. E., Oliveira, P. F. Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure. J. Vis. Exp. (147), e59318, doi:10.3791/59318 (2019).

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