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Bioengineering

열과 압력을 이용한 수성 용 매 화를 통한 재조합 거미 실크의 재료 형성

doi: 10.3791/59318 Published: May 6, 2019

Summary

여기서, 우리는 수용 성 재조합 거미 실크 단백질 용액 및 그 용액 으로부터 형성 될 수 있는 물질 형태를 생산 하는 프로토콜을 제시 한다.

Abstract

많은 거미 들이 일곱 종류의 실크를 생산 합니다. 6 개의 실크는 거미에 의해 생성 된 형태로 섬유입니다. 이 섬유는 수용 성이 없습니다. 거미 실크의 놀라운 기계적 성질을 재현 하기 위해, 거미는 영토와 식인 것으로 서 이종의 호스트에서 생산 되어야 합니다. 거미 실크의 합성 유사 체는 또한 수 용액에 불용 성 경향이 있다. 따라서, 재조합 거미 실크 연구의 많은 비율은 물질의 대규모 생산에 해로운 유기 용 매에 의존. 우리 그룹의 방법은 이러한 재조합 거미 실크의 용 매를 물에 강제로. 놀랍게도 이러한 열과 압력 방법을 사용 하 여 이러한 단백질을 제조할 때 필름, 섬유, 스폰지, 하이드로 겔, lyogel 및 접착제를 포함 한 재조합 거미 실크 단백질 (rSSp)의 동일한 용액 으로부터 다양 한 물질 형태를 제조할 수 있습니다. 본 문서는 서 면 재료 및 방법 만으로는 보다 쉽게 이해 되는 방식으로 용 매 화 rSSp 및 재료 형태를 생산 하는 것을 보여줍니다.

Introduction

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거미 실크는 강도, 탄력성 및 생체 적합성의 인상적인 조합에 대 한 재료 과학자의 관심을 얻고 있다. 섬유를 다시 만드는 것은 전통적으로 연구의 추력 이었다. 이러한 노력은 재조합 거미 실크 단백질 (rSSp) 물에 대 한 용해성 뿐만 아니라 전통적인 용 매 화 기술 (차오 트로픽 제 및 세제)의 무 능력으로 수성 용 매를 달성 함으로써 방해를 받았습니다. 또한 rssp의 용 매 화 버전을 위해 개발 된 기술은 모든 rssp 변형에서 작동 하지 않으며, 종종 단백질 손실1,2를 초래 하는 상당한 조작 및 시간이 필요 합니다. 이는 주로 섬유를 형성 하는 용 매로 서 1, 1, 3, 3 hexafluoroisopropanol (HFIP)를 사용 하는 분야에서, 그리고 다른 한정 된 물질 형태를 초래 하였다. 모든 알려진 rSSp가 HFIP에 용 해 되어 각 연구 그룹 간의 데이터 균일성을 제공 한다는 이점이 있습니다. 단점은 HFIP가 건강 문제와 환경적 고려 사항으로 인해 규모가 비싸고 실용적이 지 않은 독성 용 매 라는 점입니다.

Rssp 용 매 화에 대 한 신규 한 접근법이 개발 되어, rSSp 용 매가 선택적으로 작동 하는 가혹한 유기 용 제 HFIP 및 기타 기술 들 사이의 기술적 간극이 브릿지 되었다. 특정가 열 및 압력의 조합은 rSSp와 물의 현 탁 액에 적용 되었습니다. 결과는 100%의 용 매 화 및 rSSp의 회수 뿐만 아니라 고 단백질 농도와도 같습니다. 다양 한 물질 형태가 hfip 또는 다른 유기 용 매를 사용 하 여 달성할 수 없었던 이들 제제 로부터 가능 하다 고 결정 되었다3,5,6. 이러한 접근법의 목적은 정제 및 건조 된 재조합 거미 단백질을 수 용액에 효율적이 고 용이 하 게 가용 화 하 여 다양 한 재료 형태의 생산을 위해 활용 하는 것 이다.

섬유, 필름, 코팅, 접착제, 하이드로 겔, lyogels, 마이크로 스피어 및 스폰지 물질은 모두이 방법을 사용 하 여 동일한 수성 rSSp 솔루션에서 쉽게 accomplishable. 추가 rSSp 뿐만 아니라 다른 단백질과 함께이 방법의 지속적인 진화는 새로운 물질 형태와 대체 단백질 정제 및 가용 화로 이어질 수 있습니다.

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Protocol

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1. 동결 건조 된 단백질 주식에서 재조합 거미 실크 혼합물 준비

  1. 원하는 재료 형성에 필요한 제제 및 체적을 결정 합니다. 일반적인 제제의 범위는 최대 15% (w/v)입니다. 이 선택 항목을 사용 하 여 적절 한 rSSp, 농도 및 비율을 계산 합니다.
    1. 다음의 각각의 제형을 사용 하 여이 프로토콜에 기재 된 각각의 물질을 제조 한다. 하이드로 겔/스폰지/l a 겔 6% 50:50 MaSp1: MaSp2; 필름 코팅 5% 80:20 MaSp1: MaSp2; 접착제 12% 50:50 MaSp1: MaSp2; 섬유, 12.5% 80:20 MaSp1: MaSp2.
      주: 대부분의 제형은 특정 형태 및 재료에 적합 하지만 종종 겹칠 수 있는 광범위 한 제형이 있습니다. 또한 최종 rSSp 재료는 형성 및 가공 중에 맞춤화 하 여 원하는 특성을 생성할 수 있습니다. 일반적으로, 각 단백질은 적절 한 또는 유용한 매개 변수를 조사 해야 합니다.
  2. 고무 줄 지 어 스크류 캡을 사용 하 여 깨끗 하 고 새로운 8 mL 오토 클레이 브 붕 규 산 유리 배양 바이 알을 선택 하십시오.
  3. 캡을 제거 하 고 빈 유리병을 분석 저울에 놓습니다. 빈 유리병의 질량을 계량 하 여 균형이 0 질량을 읽습니다.
  4. 원하는 동결 건조 rSSp 분말을 각각의 특정 물질에 대해 빈 바이 알에 첨가 한다.
    1. 각 물질에 대해 이러한 특정 질량을 각각의 재료에 사용 하 고, 2 mL 용액을 제조 하는 경우: 하이드로 겔/스폰지/lyogels, 60의 MaSp1 및 60 mg의 MaSp2; 필름/코팅, MaSp1의 80 mg 및 MaSp2의 20 mg; 접착제, 120의 MaSp1 및 120 mg의 MaSp2; 섬유, 200의 MaSp1 및 50 mg의 MaSp2.
  5. 이미 가중치가 부여 된 rSSp 분말이 들어 있는 바이 알에 원하는 양의 초순 수 (최소 2 mL)를 추가 합니다.
    참고: 모든 용 매 화 절차에는 최소 2 mL의 용량을 권장 합니다.
  6. 바이 알 캡을 밀봉 하 고, 내용물을 힘차게 소용돌이 하 여 용 매 화 과정에 사용할 수 있는 분산 및 균질 한 rSSp 혼합물을 만듭니다. 초음파 처리 또는 임 펠 러 혼합과 같은 추가적인 균질 화 접근법은, 또는 또한와 류 혼합과 함께 사용 될 수 있다.

2. 재조합 거미 실크 용 매 화

주의: 용 매 과정에서 높은가 열 및 압력이 발생 합니다. 적절 한 개인 보호 장비, 특히 고글, 긴 소매 및 내 열 장갑이이 과정에 필요 합니다.

  1. 바이 알, 용기, 캡의 최종 검사를 수행 하 여 견고 하 고 단단히 조여 졌는 지 확인 하십시오. 그런 다음 일시 중단 된 rSSp 혼합물을 통상적인 전자 렌지로 옮겨 준다.
    참고: 700의 전력 범위 내 1500에 있는 마이크로파 유닛은 더 작은 내부 챔버 용량을 보유 하 고 있으며 회전 플랫폼은 더 나은 용 매 화 조건을 제공 하는 것이 좋습니다.
  2. 최대 전력에서 5 초 버스트와 전자 레인지의 작동을 시작 합니다. 각 버스트를 짧게 한 후 문을 열고 조심 스럽게 침전을 방지 하 고 부유 혼합물을 유지 하기 위해 바이 알을 소용돌이.
  3. 상기 혼합물 및/또는 용액이 상기 바이 알의 일부를 함유 하는 용액에 대해 직접 적외선 온도계로 측정 될 때, 적어도 130 ° c의 온도를 얻을 때까지이 마이크로파 공정을 반복 한다. 모든 고체 입자가 완전히 용 해 되어 더 이상 보이지 않는 때까지이 과정을 반복 합니다.
    참고: 바이 알과 용액을 때때로 냉각 하는 것이 좋습니다, 특히 제제가 높은 rSSp의 농도가 있는 경우. 200 ° c를 초과 하는 온도는 바이 알 씰 실패의 위험을 증가 시킵니다. 특별 한 주의가 또한 유리병 억제 실패를 초래 하는 물개에 접촉에서 과열 된 혼합물/해결책을 방지 하기 위하여 주어져야 합니다.
  4. RSSp 혼합물을 용액에 성공적으로 용 매 화 시킨 후 용액 및 바이 알 캡의 온도를 개방 하기 전에 100 ° c (끓는점) 이하로 냉각 시켰다.

3. 하이드로 겔

  1. 마이크로웨이브에서 제거한 후 용액 으로부터 하이드로 겔을 제조 하 고이를 냉각 및 설정할 수 있도록 한다. 완전히 냉각 되도록 하기 전에 하이드로 겔을 특정 형상으로 주조 하십시오.
    참고: 다른 Rssp는 하이드로 겔로 전환 하기 위해 다양 한 양의 시간이 필요 합니다. 예를 들어, MaSp2 같은 서 열은 MaSp1 유사 서 열에 비해 더 빠르게 하이드로 겔을 형성 하는 경향이 있다. 단백질 농도, 염도 및 pH는 또한 하이드로 겔로의 전이 속도에 직접적으로 영향을 미친다.

4. 스폰지

  1. 1 차 용 매 화 용액을 먼저 허용 하 여 rSSp 스폰지를 준비 하 여 하이드로 겔을 형성 한다.
  2. 하이드로 겔을 수조에 놓고이 목욕을-20°c의 냉동 실에 놓고 목욕이 완전히 얼어 붙을 때까지 기다리십시오.
  3. 25 ° c에서 냉동 및 해 동 으로부터 동결 된 하이드로 겔 및 수조를 제거 하 여 스폰지 형성 과정을 완료 한다. 결과 스폰지는 이제 해 동 된 물에서 제거 할 수 있습니다.

5. lyogel

  1. 형성 된 하이드로 젤을 수 욕 유무에 관계 없이 직접 동결 하 고 동결 된 하이드로 겔 샘플을 동결 건조 기로 이송 하 여 rSSp lyogel을 준비 합니다.
  2. 수 분 승화가 발생 한 용기 로부터 최종 동결 건조 된 겔 물질을 제거 한다.

6. 필름 및 코팅

  1. 다음 세 가지 방법 중 하나를 사용 하십시오: 솔루션 주조, 용액 분무 또는 딥 코팅으로 rSSp의 필름 또는 코팅을 생성 합니다.
    1. 가용 화 된 실크 용액을 원하는 형상의 PDMS 형태로/상으로 캐스팅 한다.
    2. 200 µ L의 필름 용액을 붓고 확산 하 고이를 테스트 또는 치료를 위해 PDMS 기판에서 벗 겨 내기 전에 건조 시키십시오.
    3. 이러한 건조를 허용 한 후, 기계적 시험을 위해 형성 된 필름을 제거 하거나 기계적 성질을 향상 시키기 위해 필름을 후 처리 한다.
  2. 기판 으로부터 제거 될 수 없는 코팅 또는 필름을 제조 하기 위해, 스프레이 또는 딥 코팅을 사용 하 여 박막 층을 생성 한다.
    참고: 코트 스프레이,이 프로토콜은 마스터에 어 브러시 모델 페인트 분무기와 성공을 발견 했다.
    1. 선택한 기판을 가용 화 된 rSSp에 간단히 결합 하 고 건조 후에 반복 하 여 원하는 두께를 달성 함으로써 딥 코팅을 형성 합니다.
    2. 최종 코팅의 일관성과 효과를 높이기 위해 딥 코트를 적용 하기 전에 초기 스프레이 코트를 수행 하십시오.

7. 접착제

참고: 접착제의 형성은 다음 방법 중 하나를 통해 달성 된다.

  1. 가용 화 된 rSSp를 기판에 직접 추가한 다음 용액 상단에 두 번째 기판을 적용 합니다. 조각을 함께 단단히 고정 한 다음 최소 온도 25°c의 최소 온도로 16 시간 동안 오븐에서 샘플을 건조 시키십시오.
  2. 또는 스프레이 코팅으로 두 개의 기판 표면을 분무 한 다음 기판을 함께 고정 합니다.
  3. 딥을 통해 rSSp를 적용 하 여 기판을 코팅 하 고 기판을 부착 하는 방법도 제조 및 접착에 사용 될 수 있다.

8. 습식 방적 섬유

  1. 가용 화 된도 프 용액을 Luer 로크 팁이 있는 동심 주사기에 19G의 글라이드 바늘로 로드 합니다. 기포를 배출 하 고도 프가 주사기의 Luer Lok 끝에 앉도록 하십시오.
  2. 1/16 인치 OD 및 10/32 원뿔에 대 한 PEEK 튜브의 일체형 손가락 꽉 피팅에 PEEK 튜브, 내부 직경 0.01 인치 이상 25mm를 삽입 합니다. 이 피팅을 Luer-록 암 어댑터의 PEEK 튜빙에 부착 합니다.
    1. 로드 된 주사기에 설정 된 19 게이지 바늘을 교체 합니다.
  3. 응고 욕에 사용 하기 위해 99% 순수이 소 프로 판 올로 크고 깨끗 한 유리 욕을 채우십시오.
    1. 스트레칭 godets 아래에 있는 스트레칭 목욕을 채우십시오. 첫 번째 스트레치 욕조에 증류수와 20:80이 소 프로 판 올: 증류수를 두 번째 스트레칭 욕조에 80:20이 소 프로 판 올이 있습니다.
  4. 상기 첫 번째 고 데는 응고 욕 후 제 1 고 뎃과 동일한 속도로 회전 하 게 되는 고 뎃 연신 시스템을 설정 한다.
    1. 스트레치 배스 1, 미들 어퍼 고 뎃, 스트레치 배스 2의 첫 번째 밑단의 속도를 동일한 속도로 조정 하 여 첫 번째 스트레칭을 시작 합니다. 이 속도는 초기 파이버 제거 속도 보다 2 배 빠릅니다.
    2. 두 번째 스트레칭을 시작 하는 최종 밑단의 속도를 조정 하 여 스트레칭 목욕 2, 마지막 상단 밑단, 그리고 같은 속도로 와인 더. 이 속도는 첫 번째 스트레치에 사용 되는 속도 또는 초기 섬유 제거 속도의 4 배 만큼 빠르게 2 배가 됩니다.
    3. 섬유를 미 끄 러 지는 것을 유지 하기 위해 중간 godets의 외부에 니트 릴 장갑을 놓으십시오.
  5. 응고 욕에 용액을 천천히 돌출 시키기 시작 합니다. 자동 시스템에서는 압출 속도가 10mm/s의 제거 속도와 일치 하도록 설정 합니다.
    1. 얇은 금속 걸이 또는 집게로 사용 하 여 목욕에서 섬유를 당기기 전에 섬유 압출이 균일 해질 수 있습니다. 목욕에서 섬유를 제거 확인 PEEK 튜브 팁 사이에 루프를 생성 하 고, 섬유는 목욕을 떠나는 경로.
  6. 섬유는 스트레칭 화장실에 잠겨 있지만, 스풀에 가기 전에 스트레칭 목욕 사이의 공기에 건조 등의 일련의 godets를 통해 검색 된 섬유를 안내 합니다. 이 건조는 높은 배치 중간 godets에 의해 달성 된다.
    참고: 섬유 제거 율 및/또는 압출 율은 응고 욕 바닥에 섬유를 풀링 하지 않고 충분 한 응고 시간을 허용 하기 위해 단백질 농도, 첨가제 및 단백질 유형에 따라 조정 해야 합니다.
  7. 테이프를 사용 하 여 와인 더 메커니즘에 스풀에 완전히 뻗어 섬유를 연결 합니다.

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Representative Results

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설명 된 rSSp 가용 화 방법 으로부터, 도 1에 보이는 바와 같이 다양 한 재료 형태가 달성 될 수 있다. 가용 화의 방법은 종래의 전자 렌지에 의해 생성 된 열 및 압력을 rSSp 및 물 현 탁 액에 적용 하는 것 이다. 중요 한 온도와 압력이 달성 되 면 단백질은 가용 화 될 것입니다. 이 가용 화 rSSp 솔루션에서 필요한 조건은 하이드로 겔, 라이 겔, 스폰지, 접착제, 코팅, 필름 및 섬유의 일곱 가지 재료 형태로 제공 됩니다. 하이드로 겔은 가용 화 rSSp가 냉각 되 고 자연적으로 자기 연관을 할 수 있도록 함으로써 제조 됩니다. 하이드로 겔을 동결 건조 하 여 lyogel을 제조 한다. 스폰지 재료는 물에 침 지 하면서 하이드로 겔을 동결 하 여 형성 된다. 필름은 가용 화 된 rSSp를 PDMS 표면 (및 다른 암 활성화 표면)에 캐스팅 하 고 건조 시켜 제조할 수 있습니다. PDMS를 사용 하면 사후 처리 또는 분석을 위해 필름을 쉽게 분리할 수 있습니다. 코팅 및 접착제는 스프레이 또는 딥 방법 또는 스프레이와 딥의 조합을 사용 하 여 생성 됩니다. 섬유는 응고 욕으로 압출 하 고 후 스핀 스트레치 욕조에 원시 섬유를 순차적으로 스트레칭 하 여 가장 광범위 한 처리를 필요로 한다. 섬유는 응고 욕에 단독으로 압출 하 여 생성 될 수 있다. 그러나, 섬유에서 최고의 기계적 능력은 포스트 스핀 스트레치 욕조에 스트레칭이 필요 합니다,7,8,9.

Figure 1
그림 1: 수성 용 매 화 및 rSSp 재료. RSSp를 이용한 열 및 압력의이 가용 화 방법을 사용 하 여 공식화 된 재료의 대표 사진 물에 용 매 화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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재조합 거미 실크 단백질이 정제 된 후에는 물질 형성에 사용 될 수 있는 용액으로 제조 되어야 한다. 동결 건조 된 거미 실크 단백질을 물과 혼합 하 고이 혼합물을 마이크로파 조사에 노출 시 킴으로써, 열 및 압력을 발생 시키고, rSSp 용액을 제조할 수 있다. RSSp 가용 화의 간단 하 고 효율적인 방법으로 다양 한 재료 형태를 생산할 수 있습니다. 각 재료는 원하는 결과와 특성을 달성 하기 위해 고유 하 게 준비 및 처리 되어야 합니다. 초기 제형, 형성 조건 및/또는 처리 매개 변수에 대 한 경미한 변경으로 각 재료는이 방법을 사용 하 여 쉽게 조정할 수 있습니다. 여기에 제시 된 것 보다 더 많은 양식이 있으며 현장에서 다른 사람에의 한 추가 조사를 통해 이러한 재료는이 기술을 사용 하 여 새로운 재료 형태를 탐구 하기 위해 계속 진화 할 것입니다.

용액이 주로 물과 단백질로 구성 되는 경우 (첨가제는 겔 화를 지연 시키고 용액의 안정성을 향상 시키기 위해 이용 될 수 있음) 생물학적 활성 성분으로 기능화 할 가능성이 크게 향상 됩니다. HFIP 기반 rSSp 솔루션과 비교 합니다. 항생제, 항균 제, 헤 파 린,은 나노 입자 및 세포 접착성을 위한 인 테 그린을 포함 하는 다양 한 구성 요소가 dopes 및 따라서 재료 형태에 포함 되어 있습니다. 첨가제 이외에도, 다양 한 크기, 서 열, 본성 및 공급원의 여러 재조합 거미 실크 단백질이이 방법에 성공적으로 용 매 화 되 고이 프로토콜에 기재 된 물질의 형성에 사용 된다.

이 방법에서 용 매 화 되는 것이 아니라 rSSp에 대 한 이러한 가용 화의 유용성을 더욱 확대 하지만, 용액을 멸 균 하 여 바이 알 또는 챔버 내부의 온도 및 압력이 충분히 높게 제공 된다는 것 이다. 이러한 솔루션 수 있으며 배양을 오염 없이 세포 배양에 직접 찍은.

이러한 물질을 생체 내 시스템으로 직접 가져와야 하는 경우, 내 독 소 수준을 해결 해야 합니다. 내 독 소를 파괴 하는 삼중 오토 클레이 브 방법은 레벨이 나 그 아래에 권장 되는 0.25 EU/mL가 최근10 개보고 되었습니다. 오토 클레이 브는 내 독 소를 파괴 하는 데 유용 하지만, 그 압력과 온도는 일반적으로6일에 시도한 rssp 샘플의 모든 용 매 화물에 필요한 임계 온도 또는 압력에 도달 하지 못합니다. 이는 용 매를 완료 하는 데 필요한 빼거나 또는 온도/압력 반응 기를 필요로 합니다.

고유 하 게, 내 독 소의 제거 및 열 및 압력을 사용 하는 물질의 용 매 화는 결과 물질 형태4,5,6의 단백질 또는 기계적 능력을 저하 하지 않는다. 그것은 가능성이 너무 높은 압력 및/또는 온도 및 단백질의 기계적 능력 및/또는 파괴의 저하를 초래 하는 열과 압력의 너무 많은 주기를 얻기의 팁 포인트는 것을 인식. 이 팁은 rssp의 종류와 사용 되는 rSSp의 길이에 따라 달라질 수 있습니다. 그러나, 용 매 화이 기본 방법으로, 여러 스카우트 용 매 성 실험은 특정 단백질에 필요한 적절 한 용 매 온도와 압력을 묘사 하기 위해 짧은 순서로 수행 할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 이해관계의 충돌을 선언 하지 않습니다.

Acknowledgments

저자 들은 유타 과학 기술 연구 (USTAR) 이니셔티브의 자금을 기꺼이 인정 하 고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3 mL Syringe with Luer-Lok Tip BD 309657 Other size syringes can be used but to keep the tips on, it is advised to use luer-lok tips
4 mL culture vial, clear with rubber lined cap Wheaton 225142 Minimum dope volume is 1mL, max is 2mL
8 mL culture vial, clear with rubber lined cap Wheaton 225144 Minimum dope volume is 2mL, max is 4mL
99% Isopropyl Alcohol, Reagent ACS/USP Grade Pharmco-Aaper 231000099
Freezone 4.5 Plus Labconco 7386030 Freeze Dryer
Luer Adapter Female Luer x 10-32 Female, Tefzel (ETFE) IDEX P-629
Microwave Magic Chef HMD1110B 120V, 60Hz AC; 1000 watts; 1.1 cu. ft. capacity; with glass turn table
One-Piece Fingertight 10-32 Coned, for 1/16" OD IDEX F-120X
PEEK Tubing 1/16" OD x 0.010" ID IDEX 1531B
Sprayer: Master Airbrush Master Airbrush TC-60

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References

  1. Huemmerich, D., et al. Primary Structure Elements of Spider Dragline Silks and Their Contribution to Protein Solubility. Biochemistry. 43, (42), 13604-13612 (2004).
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열과 압력을 이용한 수성 용 매 화를 통한 재조합 거미 실크의 재료 형성
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Jones, J. A., Harris, T. I., Bell, B. E., Oliveira, P. F. Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure. J. Vis. Exp. (147), e59318, doi:10.3791/59318 (2019).More

Jones, J. A., Harris, T. I., Bell, B. E., Oliveira, P. F. Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure. J. Vis. Exp. (147), e59318, doi:10.3791/59318 (2019).

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