여기서, 우리는 수용 성 재조합 거미 실크 단백질 용액 및 그 용액 으로부터 형성 될 수 있는 물질 형태를 생산 하는 프로토콜을 제시 한다.
Abstract
많은 거미 들이 일곱 종류의 실크를 생산 합니다. 6 개의 실크는 거미에 의해 생성 된 형태로 섬유입니다. 이 섬유는 수용 성이 없습니다. 거미 실크의 놀라운 기계적 성질을 재현 하기 위해, 거미는 영토와 식인 것으로 서 이종의 호스트에서 생산 되어야 합니다. 거미 실크의 합성 유사 체는 또한 수 용액에 불용 성 경향이 있다. 따라서, 재조합 거미 실크 연구의 많은 비율은 물질의 대규모 생산에 해로운 유기 용 매에 의존. 우리 그룹의 방법은 이러한 재조합 거미 실크의 용 매를 물에 강제로. 놀랍게도 이러한 열과 압력 방법을 사용 하 여 이러한 단백질을 제조할 때 필름, 섬유, 스폰지, 하이드로 겔, lyogel 및 접착제를 포함 한 재조합 거미 실크 단백질 (rSSp)의 동일한 용액 으로부터 다양 한 물질 형태를 제조할 수 있습니다. 본 문서는 서 면 재료 및 방법 만으로는 보다 쉽게 이해 되는 방식으로 용 매 화 rSSp 및 재료 형태를 생산 하는 것을 보여줍니다.
Introduction
거미 실크는 강도, 탄력성 및 생체 적합성의 인상적인 조합에 대 한 재료 과학자의 관심을 얻고 있다. 섬유를 다시 만드는 것은 전통적으로 연구의 추력 이었다. 이러한 노력은 재조합 거미 실크 단백질 (rSSp) 물에 대 한 용해성 뿐만 아니라 전통적인 용 매 화 기술 (차오 트로픽 제 및 세제)의 무 능력으로 수성 용 매를 달성 함으로써 방해를 받았습니다. 또한 rssp의 용 매 화 버전을 위해 개발 된 기술은 모든 rssp 변형에서 작동 하지 않으며, 종종 단백질 손실1,2를 초래 하는 상당한 조작 및 시간이 필요 합니다. 이는 주로 섬유를 형성 하는 용 매로 서 1, 1, 3, 3 hexafluoroisopropanol (HFIP)를 사용 하는 분야에서, 그리고 다른 한정 된 물질 형태를 초래 하였다. 모든 알려진 rSSp가 HFIP에 용 해 되어 각 연구 그룹 간의 데이터 균일성을 제공 한다는 이점이 있습니다. 단점은 HFIP가 건강 문제와 환경적 고려 사항으로 인해 규모가 비싸고 실용적이 지 않은 독성 용 매 라는 점입니다.
Rssp 용 매 화에 대 한 신규 한 접근법이 개발 되어, rSSp 용 매가 선택적으로 작동 하는 가혹한 유기 용 제 HFIP 및 기타 기술 들 사이의 기술적 간극이 브릿지 되었다. 특정가 열 및 압력의 조합은 rSSp와 물의 현 탁 액에 적용 되었습니다. 결과는 100%의 용 매 화 및 rSSp의 회수 뿐만 아니라 고 단백질 농도와도 같습니다. 다양 한 물질 형태가 hfip 또는 다른 유기 용 매를 사용 하 여 달성할 수 없었던 이들 제제 로부터 가능 하다 고 결정 되었다3,5,6. 이러한 접근법의 목적은 정제 및 건조 된 재조합 거미 단백질을 수 용액에 효율적이 고 용이 하 게 가용 화 하 여 다양 한 재료 형태의 생산을 위해 활용 하는 것 이다.
섬유, 필름, 코팅, 접착제, 하이드로 겔, lyogels, 마이크로 스피어 및 스폰지 물질은 모두이 방법을 사용 하 여 동일한 수성 rSSp 솔루션에서 쉽게 accomplishable. 추가 rSSp 뿐만 아니라 다른 단백질과 함께이 방법의 지속적인 진화는 새로운 물질 형태와 대체 단백질 정제 및 가용 화로 이어질 수 있습니다.
Protocol
1. 동결 건조 된 단백질 주식에서 재조합 거미 실크 혼합물 준비 원하는 재료 형성에 필요한 제제 및 체적을 결정 합니다. 일반적인 제제의 범위는 최대 15% (w/v)입니다. 이 선택 항목을 사용 하 여 적절 한 rSSp, 농도 및 비율을 계산 합니다. 다음의 각각의 제형을 사용 하 여이 프로토콜에 기재 된 각각의 물질을 제조 한다. 하이드로 겔/스폰지/l a 겔 6% 50:50 MaSp1: MaSp2; 필름 코팅 5% 80:20 MaSp…
Representative Results
설명 된 rSSp 가용 화 방법 으로부터, 도 1에 보이는 바와 같이 다양 한 재료 형태가 달성 될 수 있다. 가용 화의 방법은 종래의 전자 렌지에 의해 생성 된 열 및 압력을 rSSp 및 물 현 탁 액에 적용 하는 것 이다. 중요 한 온도와 압력이 달성 되 면 단백질은 가용 화 될 것입니다. 이 가용 화 rSSp 솔루션에서 필요한 조건은 하이드로 겔, 라이 겔, 스폰지, 접?…
Discussion
재조합 거미 실크 단백질이 정제 된 후에는 물질 형성에 사용 될 수 있는 용액으로 제조 되어야 한다. 동결 건조 된 거미 실크 단백질을 물과 혼합 하 고이 혼합물을 마이크로파 조사에 노출 시 킴으로써, 열 및 압력을 발생 시키고, rSSp 용액을 제조할 수 있다. RSSp 가용 화의 간단 하 고 효율적인 방법으로 다양 한 재료 형태를 생산할 수 있습니다. 각 재료는 원하는 결과와 특성을 달성 하기 위해 고…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자 들은 유타 과학 기술 연구 (USTAR) 이니셔티브의 자금을 기꺼이 인정 하 고 싶습니다.
Materials
3 mL Syringe with Luer-Lok Tip
BD
309657
Other size syringes can be used but to keep the tips on, it is advised to use luer-lok tips
4 mL culture vial, clear with rubber lined cap
Wheaton
225142
Minimum dope volume is 1mL, max is 2mL
8 mL culture vial, clear with rubber lined cap
Wheaton
225144
Minimum dope volume is 2mL, max is 4mL
99% Isopropyl Alcohol, Reagent ACS/USP Grade
Pharmco-Aaper
231000099
Freezone 4.5 Plus
Labconco
7386030
Freeze Dryer
Luer Adapter Female Luer x 10-32 Female, Tefzel (ETFE)
IDEX
P-629
Microwave
Magic Chef
HMD1110B
120V, 60Hz AC; 1000 watts; 1.1 cu. ft. capacity; with glass turn table
Jones, J. A., Harris, T. I., Bell, B. E., Oliveira, P. F. Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure. J. Vis. Exp. (147), e59318, doi:10.3791/59318 (2019).