Summary
Ce protocole décrit les modèles de souris xénogreffes et orthotopiques de la tumorigénèse thyroïdienne humaine comme plate-forme pour tester des traitements inhibiteurs à base de microARN. Cette approche est idéale pour étudier la fonction des ARN non codants et leur potentiel en tant que nouvelles cibles thérapeutiques.
Abstract
Les microARN (miARN) sont d'importants régulateurs de l'expression génique grâce à leur capacité à déstabiliser l'ARNm et à inhiber la traduction des ARNc cibles. Un nombre sans cesse croissant d'études ont identifié les miARN comme des biomarqueurs potentiels pour le diagnostic et le pronostic du cancer, ainsi que comme des cibles thérapeutiques, ajoutant une dimension supplémentaire à l'évaluation et au traitement du cancer. Dans le contexte du cancer de la thyroïde, la tumorigénèse résulte non seulement de mutations dans des gènes importants, mais aussi de la surexpression de nombreux miARN. En conséquence, le rôle des miARN dans le contrôle de l'expression des gènes thyroïdiens évolue comme un mécanisme important dans le cancer. Ici, nous présentons un protocole pour examiner les effets de la livraison miRNA-inhibiteur comme modalité thérapeutique dans le cancer thyroïde utilisant le xénogreffe humain de tumeur et les modèles orthotopic de souris. Après l'ingénierie des cellules tumorales thyroïdiennes stables exprimant le GFP et la luciferase, les cellules sont injectées dans les souris nues pour développer des tumeurs, qui peuvent être suivies par la bioluminescence. L'inhibition in vivo d'un miRNA peut réduire la croissance tumorale et réguler les cibles du gène miRNA. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer l'importance d'un miRNA déterminé in vivo, en plus d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Introduction
Le cancer de la thyroïde est une malignité endocrinienne avec une incidence croissante, bien qu'en termes généraux il ait un bon résultat1. Néanmoins, certains patients développent des formes agressives de la maladie qui sont incurables et les bases moléculaires sont mal comprises2.
Les miARN sont des ARN non codants de 22 nucléotides qui régulent l'expression des gènes dans de nombreux tissus, généralement par liaison de base-paire à la région non translationnelle de 3' (3'UTR) des ARN de messager cible (ARNM), déclenchant la dégradation de l'ARNm ou la répression translationnelle 3 (en) , 4. Il y a de plus en plus de preuves démontrant que la déréglementation de l'expression des microARN est une caractéristique du cancer, car ces molécules modulent la signalisation proliférante, la migration, l'invasion et la métastasie, et peuvent fournir une résistance à l'apoptose 5,6. Ces dernières années, de nombreuses études ont identifié les miARN comme des biomarqueurs potentiels pour le diagnostic et le pronostic du cancer ainsi que des cibles thérapeutiques7, fournissant une nouvelle dimension à l'évaluation et au traitement du cancer.
miRNAs ont pris le devant de la scène en oncologie moléculaire humaine en tant que moteurs clés des néoplasmes thyroïdiens humains8,9,10,11,12. Parmi les miRNAs up-regulated, miR-146b est fortement surexprimé dans les tumeurs de carcinome thyroïde papillaire (PTC) et a été montré pour augmenter de manière significative la prolifération cellulaire, et pour être associé à l'agressivité et au pronostic lamentable6, 12 Ans, états-unis , 13 (en) , 14 (en) , 15. En outre, miR-146b régule plusieurs gènes thyroïdiens impliqués dans la différenciation12, et aussi des gènes suppresseurs de tumeurs importants tels que PTEN16 et DICER117. Malgré leur importance dans la biologie du cancer, la thérapie contre le cancer à base de miARN en est encore à ses premiers stades, et très peu d'études ont abordé le cancer de la thyroïde - la plus fréquente des tumeurs endocriniennes18. Ici nous décrivons un protocole utilisant deux modèles différents de souris avec des tumeurs d'origine humaine, dans lequel l'administration d'un miRNA-inhibiteur synthétique (antagomiR) qui inhibe spécifiquement un miRNA cellulaire peut bloquer la croissance de tumeur. Nous avons d'abord employé un modèle commun de xénogreffe, et l'administration intratumorale locale d'une croissance diminuée de tumeur antagomiR mesurée comme réduction de la bioluminescence de tumeur16. Parce que l'établissement de modèles de souris robustes imitant la progression des tumeurs humaines est essentiel pour développer des approches thérapeutiques uniques, l'implantation orthotopique de tumeurs humaines primaires est une plate-forme plus précieuse pour la validation clinique de nouveaux médicaments que modèles d'implantation sous-cutanée. Ainsi, afin de mieux évaluer le potentiel thérapeutique de l'antagomiR, nous avons utilisé un modèle de souris orthotopic avec la livraison systémique dans la circulation sanguine, obtenant les mêmes résultats.
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Protocol
L'expérimentation animale a été réalisée conformément au droit communautaire européen (86/609/CEE) et au droit espagnol (R.D. 1201/2005), avec l'approbation du Comité d'éthique du Consejo Superior de Investigaciones Cient-ficas (CSIC, Espagne).
1. Inoculation de flanc des cellules et traitement antagomiR intratumoral
- Préparation cellulaire
- Ingénieur d'une lignée de cellules cancéreuses de la thyroïde humaine Cal62 (KRASG12R et p53A161D mutations) pour surexprimer une construction transgénique qui exprime constitutivement GFP et luciferase (CMV-Firefly Luc-IRES-eGFP). Sélectionnez les cellules transgéniques par résistance aux antibiotiques ou en triant les cellules GFP-positives avec cytométrie de flux.
- Cultivez les cellules du milieu de l'aigle modifié (DMEM) modifié de Dulbecco, complétées par de la pénicilline, de la streptomycine et 10 % du sérum bovin fœtal (SGF) à 37 oC et 5 % de CO2.
- Suspendre 1 x 106 cellules dans 50 'L de phosphate tamponné salin (PBS) à 4 oC.
- Inoculation cellulaire sur les flancs des souris
- Mélanger les cellules avec la même quantité de matrice de membrane de sous-sol. Par exemple, ajouter 1 x 106 cellules dans 50 OL de PBS à 50 oL de matrice membranaire du sous-sol (voir Tableau des matériaux)et mélanger délicatement.
note: - Injecter 100 L de l'échantillon (cellules dans la matrice de membrane de PBS et sous-sol) sous-cutané dans le flanc gauche des souris immunodéficientes BALB/c nu/nu de 6 semaines à l'aide d'une seringue à insuline de 1 mL avec une aiguille de 27 G 1/2 (0,4x13 mm).
- Mélanger les cellules avec la même quantité de matrice de membrane de sous-sol. Par exemple, ajouter 1 x 106 cellules dans 50 OL de PBS à 50 oL de matrice membranaire du sous-sol (voir Tableau des matériaux)et mélanger délicatement.
- Traitement antagomiR intratumoral.
- Suspendre l'antagomiR (voir Tableau des matériaux)ou le contrôle négatif dans 500 l'eau distillée sans RNase.
- Avant l'injection, préparer 2 nmol de l'antagomiR ou le contrôle avec un réactif de livraison in vivo (voir Tableau des matériaux) pour chaque injection.
- Mélanger d'abord la solution antagomiR (voir Tableau des matériaux) et le tampon de complexation (voir Tableau des matériaux) dans un rapport 1:1. Par exemple, ajoutez 80 l de solution d'inhibiteur de miRNA (16 nmol) à 80 'L de mémoire tampon de complexation (inclus dans le kit de réactif de livraison in vivo, voir Tableau des matériaux).
- Apportez le réactif de livraison in vivo à la température ambiante. Ajouter 160 l à un tube de 1,5 ml et ajouter immédiatement 160 l de solution antagomiR diluée. Remettre le réactif restant à -20 oC. Si nécessaire, conserver le réactif à 4 oC jusqu'à une semaine après la décongélation.
- Vortex immédiatement (10 s) pour assurer la complexation du réactif-antagomiR de livraison in vivo.
- Incuber le mélange réactif-antagomiR in vivo pendant 30 min à 50 oC. Centrifuger le tube brièvement pour récupérer l'échantillon.
- Diluer le complexe 6 fois en ajoutant 1360 L de PBS pH 7.4 et bien mélanger.
- Procédez à la livraison in vivo du complexe réactif-antagomiR (8 souris/condition), ou entreposez le complexe à 4 oC pendant une semaine avant l'injection. Injecter 200 L intratumoraux dans chaque tumeur (2 nmol d'antagomiR).
REMARQUE : Le volume et la quantité de l'antagomiR sont indépendants du volume de tumeur.
- Effectuez le traitement 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi) pendant 2 semaines.
- Analyse de la croissance tumorale
- Injecter 50 oL d'une solution de 40 mg/mL de substrat D-luciferin (voir Tableau des matériaux)sous-cutané à chaque point de temps avec une seringue de 1 ml avec une aiguille de 27 G 1/2'' (0,4 mm x 13 mm).
- À 8 min après injection, anesthésier les souris à l'aide de 3% d'isoflurane mélangé à de l'oxygène. Évaluer le niveau d'anesthésie par réflexe de pédale (pince ment aux orteils fermes) et ajuster la livraison anesthésique le cas échéant pour maintenir l'avion chirurgical.
- Appliquer onduleur ophtalmique sur les deux yeux pour prévenir la dessiccation.
- Imagez le signal bioluminescent avec un logiciel d'imagerie in vivo (voir Tableau des matériaux).
REMARQUE: Calipers peut également être utilisé pour mesurer le volume de tumeur et la croissance de la tumeur. - Une fois que les signaux de bioluminescence sont obtenus, analyser la croissance tumorale en comparant les deux traitements et déterminer l'importance à l'aide d'un test t. Pour analyser la variance au sein du groupe, utilisez le SEM.
- Injecter 50 oL d'une solution de 40 mg/mL de substrat D-luciferin (voir Tableau des matériaux)sous-cutané à chaque point de temps avec une seringue de 1 ml avec une aiguille de 27 G 1/2'' (0,4 mm x 13 mm).
- Excision de tumeur
- Sept jours après la fin du traitement antagomiR, sacrifiez les souris, excisiez la tumeur et extrayez la protéine et/ou l'ARN pour l'analyse future. Alternativement, sectionles les tumeurs et les fixer pour l'immunohistochimie.
2. Inoculation orthotopic thyroïde des cellules et traitement antagomiR systémique
- Préparation cellulaire
- Ingénieur d'une lignée de cellules cancéreuses de la thyroïde humaine Cal62 pour surexprimer une construction transgénique qui exprime constitutivement GFP et luciferase. Sélectionnez les cellules transgéniques par résistance aux antibiotiques ou en triant les cellules GFP-positives avec cytométrie de flux.
- Cultivez ces cellules dans le DMEM complétée s'il y a des antibiotiques (pénicilline et streptomycine) et 10 % de FBS à 37 oC et 5 % de CO2.
- Suspendre 1 x 105 cellules dans 5 'L de PBS.
- Inoculation cellulaire dans la glande thyroïde des souris
- Injecter 100 l d'analgésiques (buprénorphine) et 100 l d'antibiotiques (céphalosporine) sous-cutanés dans des souris BALB/c nu/nu de 7 semaines. Désinfecter le site d'injection avec de l'alcool.
- Injecter 5 ll de la solution cellulaire dans la glande thyroïde des souris.
- Anesthésiez la souris à l'aide de 3% d'isoflurane mélangé à de l'oxygène et placez-la sous un stéréomicroscope dans une armoire à débit stérile. Évaluer le niveau d'anesthésie par réflexe de pédale (pince ment aux orteils fermes) et ajuster la livraison anesthésique le cas échéant pour maintenir l'avion chirurgical.
- Appliquer onduleur ophtalmique sur les deux yeux pour prévenir la dessiccation.
- Pour chaque souris, désinfecter le cou avec de l'iodopovideone et faire une incision d'environ 2 cm dans la peau avec des ciseaux. Une fois ouvert, exposer le cou en déplaçant les glandes salivaires.
- Disséquer les muscles de la sangle à l'aide de forceps de dissection et/ou de ciseaux pour exposer la trachée et la glande thyroïde. À l'aide d'une seringue de 10 l microlitre injecter 5 l de la solution cellulaire dans le lobule thyroïdien droit, situé sur le côté du cartilage cricoid.
- Repositionnez les glandes salivaires et suturez l'incision avec de la soie à l'aide de sutures tressées, enduites et non absorbables.
- Ajouter l'iodopovidone à la zone de la plaie et placer la souris sur une couverture thermique pendant qu'elle se remet de l'anesthésie.
- Le lendemain, après la chirurgie, injectez subcutanéement analgésique (buprénorphine) et ajoutez 3 ml d'ibuprofène liquide (40 mg/ml) dans 250 ml d'eau potable pendant 1 semaine.
- AntagomiR systémique traitement
REMARQUE : Effectuez cette étape 2-3 semaines après l'injection cellulaire, lorsque le signal bioluminescent est détectable.- Suspendre le antagomiR ou le contrôle négatif dans l'eau distillée sans RNase.
- Avant l'injection, préparer 7 nmol de l'antagomiR ou le contrôle avec le réactif de livraison in vivo pour chaque injection.
- Pour l'antagomiR et la préparation in vivo de solution de réagent de livraison voir l'étape 1.3 mais ajoutez 7 nmol de l'inhibiteur de miRNA par souris.
- Administrer la solution par voie intraveineuse par injection rétro-orbitale du sinus veineux de la souris. Utilisez l'isoflurane pour induire l'anesthésie.
REMARQUE : Évaluer le niveau d'anesthésie par réflexe de pédale (pincement ferme de l'orteil). - Traiter les souris 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi) pendant 2 semaines.
- Analyse de la croissance tumorale
- Déterminer le signal bioluminescent de tumeur deux fois par semaine pour calculer la croissance de tumeur.
- Injecter 50 OL d'une solution de 40 mg/mL de substrat D-luciferin à chaque moment par injection sous-cutanée.
- À 8 min après injection, anesthésier les souris à l'aide de 3% d'isoflurane mélangé à de l'oxygène et d'imager le signal bioluminescent avec un logiciel d'imagerie in vivo.
- Une fois que les signaux de bioluminescence sont obtenus, analyser la croissance tumorale en comparant les deux traitements et déterminer l'importance à l'aide d'un test t. Pour analyser la variance au sein du groupe, utilisez le SEM.
- Déterminer le signal bioluminescent de tumeur deux fois par semaine pour calculer la croissance de tumeur.
- Excision de tumeur
- Sept jours après la fin de la période de traitement antagomiR, sacrifiez les souris, excisiez la tumeur et extrayez la protéine et/ou l'ARN pour l'analyse future. Alternativement, sectionles les tumeurs et les fixer pour l'immunohistochimie.
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Representative Results
Nous avons utilisé deux modèles différents de souris pour déterminer si la neutralisation d'un miRNA pourrait supprimer la croissance de tumeur. En conséquence, les cellules de Cal62-luc de tumeur humaine de tumeur ont été sous-cutanéement injectées dans les flancs des souris nues pour produire un modèle xénographe. Après deux semaines, des tumeurs ont été établies et pourraient être mesurées avec des étriers. À ce moment-là, des souris ont été injectées intratumoralement avec l'inhibiteur miR-146b, ou un contrôle approprié, et le volume de tumeur a été suivi pendant deux semaines supplémentaires (figure 1A). Comme le montre la figure 1B, la croissance des tumeurs injectées par voie intramorale avec l'inhibiteur miR-146b (anti-146b) (n-8) a été considérablement supprimée en ce qui concerne le groupe témoin négatif (n-4) ou le groupe témoin salin (non montré). les miARN sont une caractéristique importante de la régulation des gènes, car ils régulent plusieurs ARNm cibles. En conséquence, les oncomiRs sont des régulateurs importants des gènes suppresseurs de tumeur. Ce protocole permet l'analyse des niveaux d'expression intratumorale de ces gènes, qui peuvent être testés après le traitement avec l'inhibiteur miRNA. En outre, les niveaux de certains marqueurs de prolifération peuvent également être étudiés, illustrés par l'expression inférieure de l'antigène nucléaire proliférant de cellules (PCNA) dans les tumeurs antagomiR-traitées que dans les tumeurs témoins -(figure 2). Aussi la récupération des miRNA-cibles peuvent être étudiées par l'analyse de l'ARN ou de la protéine extraite de tumeur, comme illustré par l'expression plus élevée de PTEN dans les tumeurs traitées antagomiR (anti-146b) (figure 2). Collectivement, ces données révèlent que l'inhibition in vivo d'un miRNA est efficace et peut être exploitée thérapeutiquement pour le traitement du cancer de la thyroïde.
Pour mieux évaluer le potentiel thérapeutique d'un inhibiteur de miRNA et améliorer le modèle de souris, nous avons produit un modèle orthotopic, dans lequel les cellules de Cal62-luc de tumeur humaine ont été directement ensemencées dans le lobe thyroïde droit des souris nues. Après 3 semaines, les tumeurs thyroïdiennes ont été établies, comme démontré par des signaux de bioluminescence dans le cou des souris et par l'analyse brute de tissu et l'immunohistochemistry, avec l'hématoxylin et l'éosine et la coloration de GFP des cellules, respectueusement. Comme le montre la figure 3, les cellules épithéliales entourant le colloïde démontrent l'architecture du follicule thyroïdien de la souris. Les cellules GFP-positives entrecoupées avec les follicules, démontrant sans équivoque que les cellules humaines de Cal62 ont été injectées correctement et prolifèrent dans la thyroïde de souris. Une fois que les tumeurs ont été formées, nous avons injecté 13 souris par voie intraveineuse avec l'inhibiteur miR-146b (n-8) ou un contrôle approprié (n-5), et le volume de tumeur a été suivi pendant deux semaines supplémentaires (figure 4A). Nous avons constaté que la croissance de tumeur a été sensiblement diminuée dans le groupe antagomiR-traité systémique (figure 4B). Notamment, l'expression du jeune miR-146b-cible DICER1 dans la tumeur primaire a été augmentée après le traitement anti-miR-146b (Figure 5). Ces données démontrent que l'inhibition de l'expression endogène de miRNA et donc la restauration de ses gènes cibles pourraient être employées comme thérapie dans le cancer thyroïde16,17.
Figure 1. L'inhibiteur miR-146b altère la croissance établie de tumeur thyroïde humaine. Les cellules exprimant cal62-luciferase (Cal62-luc) ont été injectées sous-cutanée. Après que des xénogreffes aient été établies, un miR-inhibiteur synthétique (anti-146b) (n-8) ou un contrôle négatif (n-4) a été administré intratumoralement. (A) Chronologie. (B) Gauche : L'image montre le signal bioluminescent de point de terminaison des tumeurs traitées imageavec le logiciel in vivo d'imagerie. Droite : Le graphique montre l'augmentation de l'éclat tumoral aux temps indiqués dans les xénogreffes du début du traitement avec l'inhibiteur du miARN (gris foncé) ou le contrôle négatif (gris). (C) Représentation de l'augmentation de rayonnement de point de terminaison des tumeurs traitées. Les valeurs représentent la moyenne de seM. Lt;0.01. Figure adaptée de Ramarez-Moya et coll.16. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. L'expression de protéine de PCNA diminue et l'expression de protéine de PTEN augmente dans les tumeurs miR-146b-inhibiteur-traitées. La protéine des tumeurs traitées avec le contrôle ou l'inhibiteur de miR-146b a été obtenue pour le blotting occidental avec des anticorps au PCNA ou au PTEN. Figure adaptée de Ramarez-Moya et coll.16. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3. Follicules thyroïdiens intratumoraux de souris dans le modèle orthotopic. Coloration avec l'hématoxyline et l'éosine (panneau supérieur) et ou un anticorps à GFP (panneau inférieur) des tumeurs de souris orthotopiques 28 jours après l'inoculation avec des cellules GFP-positives de Cal62-luc. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4. L'inhibiteur miR-146b altère la croissance établie de tumeur thyroïde humaine. Des cellules exprimant Cal62-luciferase (Cal62-luc) ont été injectées dans la glande thyroïde des souris. Après que les tumeurs aient été établies (3 semaines), un miRNA-inhibiteur synthétique (anti-146b) (n-8) ou un contrôle négatif (n-5) a été administré systémiquement. (A) Chronologie. (B) Gauche : L'image montre le signal bioluminescent de point de terminaison des tumeurs traitées imageavec le logiciel in vivo d'imagerie. Droite : Le graphique montre l'augmentation de l'éclat tumoral aux heures indiquées à partir du début du traitement avec l'inhibiteur miRNA (bleu) ou le contrôle négatif (vert). (C) Représentation de l'augmentation de rayonnement de point de terminaison des tumeurs traitées. Les valeurs représentent la moyenne de seM. Figure adaptée de Ramarez-Moya et coll.17. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5. L'expression de protéine de DICER1 augmente dans les tumeurs miR-146b-inhibiteur-traitées. Immunohistochemistry avec un anticorps DEDIC1 dans les tumeurs orthotopiques après traitement avec miR-146b-inhbitor ou contrôle. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Cet article décrit une méthode pour étudier la fonction in vivo d'un miRNA afin de mieux comprendre son rôle dans l'initiation et la progression de tumeur, et son potentiel en tant que cible thérapeutique dans le cancer thyroïde. Les modèles de xénogreffe de tumeur décrits ici sont basés sur l'utilisation des cellules qui peuvent être suivies par leur signal de bioluminescence, permettant la mesure de la croissance de tumeur in vivo sous l'influence d'un traitement. En outre, nous décrivons l'utilisation d'un traitement miRNA-basé pour le cancer thyroïde, qui est actuellement dans les premiers stades.
Nous avons d'abord testé la faisabilité d'un miRNA comme cible thérapeutique à l'aide d'un modèle sous-cutané de xénogreffe, dans lequel des cellules tumorales thyroïdiennes ont été injectées sur les flancs de souris immunodéficientes. Nous avons ensuite injecté intratumoralement l'antagomiR. Ce modèle peut être utilisé pour plusieurs types de cancer pour tester l'importance de miARN spécifiques ou oncomiRs in vivo dans les cellules cancéreuses humaines. Les avantages de cette technique sont qu'il est relativement simple à effectuer et aussi rapide, avec une souffrance animale minimale. Un inconvénient majeur de la technique, cependant, est qu'elle n'imite pas étroitement la condition humaine parce que les cellules sont injectées sous-cutanée et non dans l'organe d'origine. Pour surmonter cette limitation, nous avons employé un modèle plus robuste en effectuant l'implantation orthotopic chirurgicale des cellules bioluminescentes de tumeur thyroïde dans la thyroïde des souris. Bien que cette technique soit plus compliquée et plus longue, elle permet l'étude de la croissance tumorale dans son environnement « indigène », la thyroïde. Une force de cette méthode est qu'elle permet l'étude de la dissémination tumorale de cellules comme métastes, habituellement dans les poumons, qui peuvent être évaluées avec le logiciel in vivo d'imagerie. Une autre force est que la livraison systémique de l'antagomiR imite un traitement humain potentiel et permet l'analyse de la réponse thyroïdienne. En outre, l'injection systémique de l'antagomiR n'a pas causé d'effets indésirables sur les animaux, comme les paramètres tels que les niveaux de glucose sérique ou la morphologie du foie n'ont pas été modifiés17.
Il y a quelques étapes critiques. Dans le modèle de souris orthotopique, l'injection des cellules tumorales devrait être effectuée avec précision dans la glande thyroïde et non dans le tissu voisin. Ainsi, il est nécessaire de démontrer avec immunohistochimie que l'architecture thyroïdienne est maintenue et que les cellules injectées ont infiltré la thyroïde et ne sont pas présentes avec la glande. En outre, pour les modèles xénogreffe sénogreffe et orthotopic, la taille des tumeurs dans les différents groupes d'animaux devrait être semblable au début du traitement afin de suivre un modèle de croissance semblable dans tous les cas. Enfin, il est important de démontrer que l'expression des cibles en aval du microARN (dans notre cas miR-146b) est modifiée après le traitement antagomiR
Comme une application future possible de ce modèle, les cellules patientes pourraient être injectées dans des modèles de souris afin d'analyser comment l'inhibition d'un miRNA pourrait affecter la croissance tumorale d'un patient spécifique, une approche utile pour la précision et la médecine personnalisée basée sur Miarn.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants à Raquel Arocha Riesco pour son aide dans le traitement et les soins des souris. Nous remercions le Dr J. Blanco (Institut catalan pour la chimie avancée-CSIC) et le Dr E. Mato (Institut de Reserca de l'Hospital de la Santa Creu i Sant Pau) Barcelone (Espagne) pour avoir offert respectivement les cellules CMV-Firefly luc-IRES-EGFP et Cal62-Luc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AntagomiR: mirVana miRNA inhibitor | Thermo Fisher | 4464088 | In Vivo Ready |
| Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration | Corning | #354248 | |
| DICER antibody | Abcam | ab14601 | IHQ: 1/100 |
| In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 Reagent | Thermo Fisher | IVF3005 | |
| In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1 | Thermo Fisher | 4464077 | In Vivo Ready |
| PCNA antibody | Abcam | ab92552 | WB: 1/2,000 |
| PTEN antibody | Santa Cruz | sc-7974 | WB: 1/1,000 |
| XenoLight D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent Substrate | PerkinElmer | 122799 | Diluted in PBS |
References
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