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Immunology and Infection

Identificazione dei fattori nucleolari durante la replicazione dell'HIV-1 attraverso l'immunoprecipitazioni del rev e la spettrometria di massa

Published: June 26, 2019 doi: 10.3791/59329
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 3, 1, 1,2
1Molecular and Cellular Biology Department, Beckman Research Institute at the City of Hope, 2Irell & Manella Graduate School of Biological Sciences, 3Department of Molecular Immunology, Beckman Research Institute and the City of Hope

Summary

Qui descriviamo l'immunoprecipitazioni Rev in presenza di replicazione HIV-1 per la spettrometria di massa. I metodi descritti possono essere utilizzati per l'identificazione dei fattori nucleolari coinvolti nel ciclo infettivo dell'HIV-1 e sono applicabili ad altri modelli di malattia per la caratterizzazione di percorsi poco studiati.

Abstract

Il ciclo infettivo HIV-1 richiede interazioni virali delle proteine con i fattori dell'ospite per facilitare la replicazione, l'imballaggio e il rilascio virali. Il ciclo infettivo richiede ulteriormente la formazione di complessi proteici virali/ospiti con RNA HIV-1 per regolare lo splicing e consentire il trasporto nucleocitoplasmatico. La proteina HIV-1 Rev realizza l'esportazione nucleare di mRNA HIV-1 attraverso la multimerizzazione con obiettivi cis-recidivi intronici - l'elemento di risposta Rev (RRE). Un segnale di localizzazione nucleolare (NoLS) esiste all'interno del COOH-terminus del motivo ricco di arginina Rev (ARM), permettendo l'accumulo di complessi Rev/RRE nel nucleolo. I fattori nucleolari sono ipotizzati per sostenere il ciclo infettivo dell'HIV-1 attraverso varie altre funzioni oltre a mediare l'esportazione nucleare indipendente dall'mRNA e lo splicing. Descriviamo un metodo di immunoprecipitazioni del Rev di tipo selvaggio (WT) rispetto alle mutazioni nucleolare Rev (mutazioni Rev nucleolari e Rev-NoLS) in presenza di replicazione HIV-1 per la spettrometria di massa. Fattori nucleolari implicati nel trasporto nucleocitoplasmatico (nucleophosmin B23 e nucleolin C23), così come i fattori di giunzione cellulare, perdono l'interazione con Rev in presenza di mutazioni Rev-NoLS. Vari altri fattori nucleolari, come la casella SnoRNA C/D 58, sono identificati per perdere l'interazione con le mutazioni Rev, ma la loro funzione nel ciclo di replicazione dell'HIV-1 rimane sconosciuta. I risultati qui presentati dimostrano l'uso di questo approccio per l'identificazione di fattori nucleolari virali/ospiti che mantengono il ciclo infettivo dell'HIV-1. I concetti utilizzati in questo approccio sono applicabili ad altri modelli di malattie e virali che richiedono la caratterizzazione di percorsi poco studiati.

Introduction

Il nucleolo è postulato come il terreno di interazione di vari fattori cellulari e virali necessari per la replicazione virale. Il nucleolo è una struttura complessa suddivisa in tre diversi comparti: il compartimento fibrillare, il compartimento fibrillare denso e il compartimento granulare. La proteina HIV-1 Rev si localizza specificamente all'interno di compartimenti granulari; Tuttavia, il motivo di questo modello di localizzazione è sconosciuto. In presenza di mutazioni a punto singolo all'interno della sequenza NoLS (mutazioni Rev 4, 5 e 6), Rev mantiene un modello nucleolare e in precedenza ha dimostrato di salvare la replica HIV-1HXB2, tuttavia, con una minore efficienza rispetto al WT Rev1 . Tutte le mutazioni monopunto non sono in grado di sostenere il ciclo infettivo dell'HIV-1NL4-3. In presenza di più mutazioni monopunto all'interno della sequenza NoLS (mutazioni Rev-NoLS 2 e 9), Rev è stato osservato per disperdersi in tutto il nucleo e il citoplasma e non è stato in grado di salvare la replica HIV-1HXB2 1. L'obiettivo di questo studio proteomica è quello di decifrare i fattori nucleolari e cellulari non nucleolari coinvolti nella via infettiva HIV-1 mediata da Rev. Le condizioni di immunoprecipitazioni del rev sono ottimizzate attraverso l'interazione con il nucleolare B23 fosforproteina, che in precedenza ha dimostrato di perdere l'interazione con Rev in presenza di mutazioni nucleolare.

I fattori cellulari Rev sono stati ampiamente studiati in passato; tuttavia, questo è stato fatto in assenza di patogenesi virale. Una proteina, in particolare, che è caratterizzata in questo studio attraverso l'interazione del rev durante la replicazione HIV-1 è la fosforproteina nucleolare B23 - chiamata anche nucleofosmina (NPM), numatrina o NO38 negli anfibi2,3, 4. B23 è espresso come tre isoformi (NPM1, NPM2 e NPM3) - tutti membri della famiglia chaperone nucleare nucleophosmin/nucleoplasmin5,6. Lo chaperone molecolare NPM1 funziona nell'assemblaggio corretto dei nucleosomi, nella formazione di complessi di acido proteico/nucleico coinvolti nelle strutture di ordine superiore della cromatina7,8,e nella prevenzione dell'aggregazione e misfolding delle proteine bersaglio attraverso un dominio di base N-terminale (residui 1-120)9. La funzionalità NPM1 si estende alla genesi del ribosoma attraverso il trasporto di particelle preribosomiche tra il nucleo e il citoplasma10,11, l'elaborazione dell'RNA preribosomico nella sequenza distanziale trascritto internamente 12,13, e arrestando l'aggregazione nucleolare delle proteine durante l'assemblaggio ribosomiale14,15. NPM1 è implicato nell'inibizione dell'apoptosi16 e nella stabilizzazione dei soppressori tumorali ARF17,18 e p5319, rivelando il suo duplice ruolo come fattore oncogenico e soppressore tumorale. NPM1 partecipa alle attività cellulari di stabilità del genoma, replicazione centrosome e trascrizione. NPM1 si trova nei nucleoli durante l'interfase del ciclo cellulare, lungo la periferia cromosomica durante la mitosi, e nei corpi prenucleolari (PNB) alla conclusione della mitosi. NPM2 e NPM3 non sono ben studiati come NPM1, che subisce livelli di espressione alterati durante la malignità20.

NPM1 è documentato nell'shuttling nucleocitoplasmatica di varie proteine nucleari/nucleolare attraverso un NES interno e NLS9,21 ed è stato precedentemente segnalato per guidare l'importazione nucleare di HIV-1 Tat e Rev proteine. In presenza di proteine di fusione B23-binding-dominio-z-galactosidasi, Tat si smarrisce all'interno del citoplasma e perde l'attività di trasattivazione; questo dimostra una forte affinità di Tat per B232. Un altro studio ha stabilito un complesso stabile Rev/B23 in assenza di mRNA contenenti RRE. In presenza di mRNA RRE, Rev dissocia da B23 e si lega preferibilmente all'HIV RRE, portando allo spostamento di B2322. Non è noto dove, a livello subnucleare, si verificano la trasattivazione tat e il processo di scambio rev di B23 per l'HIV mRNA. Entrambe le proteine sono postulate per entrare contemporaneamente nel nucleolo attraverso l'interazione B23. Si prevede il coinvolgimento di altre proteine cellulari ospiti nella via nucleolare dell'HIV. I metodi descritti in questa indagine proteomica aiuteranno a chiarire l'interazione del nucleolo con i fattori cellulari ospiti coinvolti durante la patogenesi HIV-1.

L'indagine proteomica è stata avviata attraverso l'espressione delle mutazioni a punto singolo del Rev NoLS (M4, M5 e M6) e delle sostituzioni multiple di arginine (M2 e M9) per la produzione HIV-1hXB2. In questo modello, una linea cellulare HeLa che esprime stabilmente HIV-1HXB2 (HLfB) carente di Rev viene trasinata da mutazioni nucleolari WT Rev e Rev contenenti un tag flag alla fine del 3'. La presenza di WT Rev permetterà la replicazione virale nella cultura HLfB, rispetto alle mutazioni Rev-NoLS che non salvano la carenza di Rev (M2 e M9), o consentirà la replicazione virale, ma non in modo efficiente come WT Rev (M4, M5 e M6)1. Il lisato cellulare viene raccolto 48 h più tardi dopo la proliferazione virale in presenza di espressione Rev e sottoposto a immunoprecipitazioni con un buffer di lissi è ottimizzato per l'interazione Rev/B23. Viene descritta l'ottimizzazione del buffer di lisi utilizzando concentrazioni di sale variabili e i metodi di eluizione delle proteine per HIV-1 Rev vengono confrontati e analizzati in gel SDS-PAGE macchiati d'argento o macchiati di Coomassie. Il primo approccio proteomico prevede l'analisi diretta di un campione eluito da Espressi WT Rev, M2, M6, e M9 da spettrometria di massa tandem. Un secondo approccio con il quale gli eluati di WT Rev, M4, M5 e M6 sono stati sottoposti a un processo di estrazione gel viene confrontato con il primo approccio. Viene analizzata l'affinità peptide alle mutazioni Rev-NoLS rispetto a WT Rev e viene visualizzata la probabilità di identificazione delle proteine. Questi approcci rivelano potenziali fattori (nucleolari e nonnucleolari) che partecipano al trasporto e giunzione di mRNA HIV-1 con Rev durante la replicazione dell'HIV-1. Nel complesso, le condizioni di lisi cellulare, IP, e di eluizione descritte sono applicabili alle proteine virali di interesse per la comprensione dei fattori cellulari ospiti che attivano e regolano le vie infettive. Questo è applicabile anche allo studio dei fattori dell'ospite cellulare necessari per la persistenza di vari modelli di malattia. In questo modello proteomico, HIV-1 Rev IP è ottimizzato per l'interazione B23 per chiarire i fattori nucleolari coinvolti nell'attività di shuttling nucleocitoplasmatica e nell'attacco mRNA HIV-1. Inoltre, possono essere sviluppate linee cellulari che esprimano stabilmente modelli di malattie infettive che sono carenti per le proteine chiave di interesse, simile alla linea cellulare HLfB, per studiare le vie infettive di interesse.

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Protocol

1. Cultura cellulare

  1. Mantenere l'HLfB nel mezzo modificato di Dulbecco Eagle's Aquila (DMEM) integrato con 10% di siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-glutamine e pirvate di sodio da 1 mM all'interno di piastre da 100 mm trattate con coltura tissutale. Mantenere le colture cellulari a 37 gradi centigradi in un'incubatrice umidificata fornita con 5% di CO2. Passare le cellule confluenti a una densità di cellule di 1 x 106 cellule / mL.
  2. Eliminare i supporti di coltura cellulare. Sciacquare delicatamente le cellule con 10 mL di 1x di salina con buffer fosfato (PBS). Rimuovere ed eliminare il 1x PBS senza interrompere il livello della cella.
  3. Aggiungere 2 mL di 1x soluzione trypsin-EDTA alle cellule. Sbottare il piatto per rivestire il monostrato e incubare a 37 gradi centigradi all'interno di una camera umidizzata per 5 min.
  4. Toccare saldamente il lato del piatto con il palmo della mano per staccare le cellule. Risospendere le cellule staccate in 8 mL di supporti di coltura freschi. Girare le cellule a 400 x g per 5 min.
  5. Eliminare i mezzi di coltura senza interrompere il pellet cellulare. Risospendere il pellet cellulare in 10 mL di supporti di coltura freschi. Sottocultura 1 mL di cellule concentrate con 9 mL di supporti di coltura freschi all'interno di piastre da 100 mm trattate con coltura tissutale.
    NOTA: per ogni mutazione Rev-NoLS, le piastre di coltura HLfB o HeLa da 3x 100 mm producono un numero sufficiente di proteine listi per l'analisi delle macchie occidentali e la spettrometria di massa. Aggiungere piastre aggiuntive per un controllo positivo WT Rev e un controllo negativo. Il volume delle cellule delle impostazioni secondarie richiederà l'ottimizzazione con l'uso di diversi tipi di cellule.

2. Espressione delle mutazioni di Rev-NoLS-3'flag durante la replicazione dell'HIV-1

  1. Aumentare la coltura delle cellule HLfB a una densità di cellule di 2 x 106 cellule/mL. Preparare 4 mL di sospensione del fosfato di calcio per ogni piastra di 100 mm come segue.
    1. Etichettare due tubi da 15 mL come 1 e 2. Aggiungere 2 mL di 2x HBS (0,05 M HEPES, 0,28 M NaCl e 1,5 mM Na2HPO4 [pH 7.12]) al tubo 1. Aggiungere TE 79/10 (1 mM Tris-HCl e 0,1 mM EDTA [pH 7.9]) al tubo 2. Il volume di TE 79/10 è 1.760 mL - il volume del DNA.
    2. Aggiungere 20 g di plasmide contenente la mutazione di interesse Rev-NoLs-3'flag al tubo 2 e mescolarne il contenuto attraverso la sospensione. Aggiungere 240 luna di 2 M CaCl2 al tubo 2 e mescolare di nuovo attraverso la sospensione.
    3. Trasferire la miscela di tubo 2 al tubo 1 dropwise, mescolando delicatamente. Lasciare che la sospensione si sieda a temperatura ambiente per 30 min.
  2. Aggiungere 1 mL di sospensione dropwise a ciascuna delle colture a 3 celle, piastre da 100 mm mentre girano delicatamente il supporto. Riportare le piastre all'incubatrice e lasciare la miscela di trasfezione per 6 h. Sostituire la miscela di trasfezione con 10 mL di supporti di coltura freschi e incubare le cellule per 42 h.

3. Raccolta di lisato proteico virale

  1. Eliminare il supporto cellulare 48 h posttrafezione. Mettere ogni piastra da 100 mm su un letto di ghiaccio. Etichettare i tubi da 15 mL per ogni campione di mutazione Rev-NoLS e posizionare i tubi sul ghiaccio.
  2. Sciacquare delicatamente le cellule con 10 mL di 1x PBS prefreddo senza interrompere lo strato cellulare. Eliminare il 1x PBS. Aggiungere 3 mL di buffer di lisi (50 mM Tris-HCl [pH 8.0], 137 mM NaCl e 1% di detersivo X-100 [vedi la Tabella dei Materiali]), trattato con cocktail inibitore della proteasi, a ciascuna delle piastre da 100 mm.
  3. Utilizzare un raschietto di celle per interrompere il livello della cella. Inclinare la piastra e raschiare delicatamente e raccogliere le cellule in una piscina. Raccogliere il lisato cellulare utilizzando una micropipetta 1.000 L e mescolare i lisati delle cellule da ciascuna delle tre piastre da 100 mm nel tubo preetichettato da 15 mL.
  4. Incubare il lisato cellulare sul ghiaccio per 15 min, vortice ogni 5 min. Centrifugare il lisato cellulare a 15.000 x g per 5 min.
  5. Raccogliere il supernatante proteico senza interrompere il pellet di detriti cellulari e trasferirlo in un altro tubo sterile da 15 mL. Ottenere la concentrazione di lisato proteico virale utilizzando il metodo Bradford (vedi sezione 4).
  6. Salvare un'aliquota del campione di input (20 g) per l'analisi dell'immunoblot occidentale. Aggiungere 2x buffer campione (20% glicerolo, 0.02% blu bromofenolo, 125 mM Tris-Cl [pH 6,8], 5% SDS e 10% 2-mercaptoetanolo) al volume finale. Far bollire a 95 gradi centigradi per 10 min, e conservare il campione di ingresso a -20 gradi centigradi.

4. Il saggio DiBradford

NOTA: Preparare l'albumina del siero bovino 10x (BSA) da 100x stock BSA prima di generare curve standard proteiche.

  1. Acqua in tubi di microcentrismo per i seguenti vuoti e standard: Vuoto : 800 l; Standard 1 : 2 mg/mL, 798 l; Standard 2 - 4 mg/mL, 796 l; Standard 3 - 6 mg/mL, 794 l; Standard 4 - 8 mg/mL, 792 l; Standard 5 - 10 mg/mL, 790 - L. Aliquota 10x BSA nei seguenti standard designati: Standard 1 - 2 -L; Standard 2 - 4 l; Standard 3 : 6 L; Standard 4 : 8 l; Standard 5 : 10 l.
  2. Preparare una miscela di campioni di proteine mescolando 795 ll di acqua con 5 campioni di proteine. Aggiungere 200 l di reagente di tintura di prova proteica (vedere la Tabella dei materiali) a ogni campione vuoto, standard e proteico. Vorticare brevemente i campioni per una miscela uniforme e incubare a temperatura ambiente (18-20 gradi centigradi) per 5 min.
  3. Trasferire i campioni vuoti, standard e proteici in cuvette. Misurare le concentrazioni proteiche a un OD di 595 nm.

5. Coimmunoprecipitazionazione della bandiera Rev-NoLS-3'

  1. Risciacquare 25 l di perline di gel di affinità M2 (si veda la Tabella dei Materiali) con 500 - L di list, trattato con cocktail inibitore della proteasi. Risciacquare più perline di gel di affinità per ogni campione di mutazione e controlli.
    NOTA: Preparare un numero sufficiente di perline di gel di affinità M2 per due gel (50 gradi centigradi) - uno per l'analisi dell'immunoblot occidentale e l'altro per la colorazione proteica e la spettrometria di massa.
  2. Girare a 820 x g per 2 min a 4 gradi centigradi. Togliete il super-acletterante. Risciacquare 2x di più.
  3. Aggiungere la proteina virale lisata (1 mg/mL in 5 mL di volume totale) alle perline di affinità M2 prerinse. Regolare il volume totale utilizzando il buffer di lisi.
  4. Incubare la reazione per 3 h, ruotando a 4 gradi centigradi. Centrifugare le perline di affinità M2/proteina virale lisa a 820 x g per 1 min.
  5. Raccogliere il supernatante e salvare un campione post-IP (20 g) per l'analisi immunoblot occidentale. Misurare la concentrazione proteica del lisato post-IP. Raccogliere 20 g per l'immunoblotting occidentale.
  6. Aggiungere il buffer di esempio 2x al volume finale. Far bollire a 95 gradi centigradi per 10 min, e conservare il campione post-IP a -20 gradi centigradi.
  7. Sciacquare le perle M2 con 750 gradi l- di lisi tampone e lavare le perline su un rotatore a 4 gradi centigradi per 5 min. Centrifugare le perline M2 a 820 x g e scartare il supernatante.
  8. Ripetere i passaggi 5.7 per altri due fumi su un rotatore a 4 gradi centigradi per 5 min. Dopo il terzo lavaggio, rimuovere eventuali tracce di tampone di lisi dal complesso M2 perline/co-IP utilizzando una lunga punta di caricamento gel.
    NOTA: Pizzicare l'estremità della punta di caricamento gel con pinzette piatte prima di rimuovere eventuali tracce del buffer di lisi. Ciò impedirà l'interruzione e l'assorbimento delle perline M2.
  9. Risospendere le perline M2 in 55 - L di 2 x buffer di carico. Far bollire il campione a 95 gradi centigradi per 10 min.
  10. Caricare 25 l di eluate su due gel SDS-PAGE separati (uno per immunoblotting occidentale e l'altro per la colorazione Coomassie).

6. Preparazione di gel SDS-PAGE

  1. Lanciare due gel di risoluzione SDS-acrilamide 15% mescolando i seguenti reagenti in un tubo da 50 mL (ad un volume finale di 40 mL, sufficiente per quattro gel): 4,16 mL di acqua ultrapura, 15 mL del 40% di acrilammide:bisacrylamide (29:1), 10 mL di 1,5 M-HCl (8,5 M-HCl). , 400 -L del 10% di SDS, 400 -L di 10% di perdino di ammonio e 40 l di TEMED.
  2. Mescolare il gel di risoluzione invertendo il tubo da 50 mL più volte. Pipette la miscela di gel di risoluzione in un apparato gel occidentale prepulato (quattro gel - tre per immunoblotting occidentale e uno per la colorazione Coomassie/argento).
  3. Delicatamente pipette abbastanza acqua per coprire lo strato superiore della miscela di gel. Lasciare che il gel di risoluzione sia polimerizzato.
  4. Versare lo strato d'acqua dal gel di risoluzione, utilizzando un delicato tergicristallo compito (vedi la tabella dei materiali) per assorbire l'acqua in eccesso.
  5. Lanciare due gel di impilamento SDS-acrilamide 5% mescolando i seguenti reagenti in un tubo da 50 mL (ad un volume finale di 20 mL, sufficienti per quattro gel): 11,88 mL di acqua ultrapura, 2,5 mL del 40% di acrilammide:bisacrilamide (29:1), 5,2 mL di 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) , 200 -L del 10% di SDS, 200 -L di 10% di perdino di ammonio e 20 L di TEMED.
  6. Mescolare il gel di impilamento invertendo il tubo da 50 mL più volte. Pipette la miscela di gel impilamento sopra il gel di risoluzione alla parte superiore dell'apparato.
  7. Inserire un pettine a cassetta di gel contenente il numero appropriato di corsie nel gel di impilamento. Assorbire qualsiasi overflow della miscela di gel utilizzando un tergicristallo compito delicato (vedere la Tabella dei Materiali). Lasciare che il gel di impilamento sia completamente polimerizzato.
  8. Inondare l'apparato gel occidentale con 1x tampone da corsa occidentale (5x concentrazione: 250 mM Tris-Cl [pH 8.3], 1,92 M glicina, 0.5% SDS e 10 mM EDTA).
  9. Estrarre delicatamente il pettine della cassetta del gel dal gel di impilamento. Lasciare che il buffer di corsa occidentale 1x riempia i pozzi di carico. Lavare ogni pozzo con 1x buffer in esecuzione occidentale utilizzando una siringa prima di caricare i campioni.
  10. Caricare i campioni di immunoblot occidentali in ogni gel corrispondente (campioni di ingresso, campioni coimmunoprecipitati e campioni post-IP). Caricare i marcatori proteici gel occidentali.
  11. Caricare i campioni coimmunoprecipitati per la colorazione Coomassie/argento in un altro gel. Caricare i marcatori proteici gel occidentali.
  12. Collegare l'apparato gel in esecuzione a una fonte di alimentazione ed eseguire i gel a 100 V fino a quando il colorante di carico raggiunge il gel di risoluzione. Aumentare la tensione a 140 V fino a quando il colorante di carico raggiunge il fondo del gel di risoluzione.

7. Trasferimento macchia occidentale

  1. Smontare l'apparato gel occidentale. Affettare e scartare il gel di impilamento, lasciando intatto il gel di risoluzione.
  2. Trasferire delicatamente i gel di risoluzione in un vassoio pulito riempito con tampone di trasferimento occidentale (25 mM Tris, 194 mM glicine, 0.005% SDS, 20% metanolo) e immergerli per 15 min.
  3. Assemblare l'apparato di trasferimento del gel come segue.
    1. Tagliare tre membrane di trasferimento PVDF e sei pezzi di carta da filtro (vedere la tabella dei materiali) alle dimensioni del gel di risoluzione.
    2. Immergere la membrana PVDF in metanolo per 5 min. Idrataino in acqua per 5 min.
    3. Posizionare la cassetta del supporto del gel in una teglia di vetro riempita parzialmente con tampone di trasferimento occidentale, con il lato nero sul fondo.
    4. Posizionare un cuscinetto di schiuma imbevuto di tampone di trasferimento occidentale contro il lato nero della cassetta del supporto del gel.
    5. Sormontare un pezzo di carta da filtro nel buffer di trasferimento occidentale e posizionarlo sulla parte superiore del tampone di schiuma. Posizionare il gel di risoluzione sopra la carta da filtro.
      NOTA: Posizionare il gel di risoluzione nell'orientamento di carico corretto per essere trasferito alla membrana PVDF.
    6. Posizionare una membrana di trasferimento PVDF sopra il gel di risoluzione. Sormontare un pezzo di carta da filtro con buffer di trasferimento occidentale e posizionarlo sulla parte superiore della membrana di trasferimento PVDF.
    7. Posizionare un altro cuscinetto di schiuma imbevuto di tampone di trasferimento occidentale sulla carta da filtro. Piegare con cura il lato bianco della cassetta del supporto gel sulla parte superiore del pad di schiuma imbevuta. Bloccare saldamente la cassetta.
    8. Posizionare la cassetta del supporto del gel nell'assemblaggio dell'elettrodo dell'apparato di trasferimento. Ripetere i passaggi 7.3.4-7.3.8 per ogni gel di risoluzione rimanente.
    9. Riempire il serbatoio dell'apparato di trasferimento con il buffer di trasferimento occidentale. Inserire un'asta di agitazione nel serbatoio dell'apparato.
    10. Posizionare il serbatoio dell'apparecchio sopra una piastra di mescolare. Regolare l'impostazione di agitazione a 5-6, assicurandosi che la barra di agitazione non sia bloccata o colpendo le cassette del supporto del gel.
    11. Collegare l'apparecchio di trasferimento del gel a una fonte di alimentazione e trasferire il gel a 100 V per 1 h a 4 gradi centigradi.

8. Immunoblotting

  1. Rimuovere la cassetta del supporto del gel e posizionare il lato nero contro una teglia di vetro pulito. Aprire la cassetta e scartare con cura il tampone di schiuma e filtrare la carta. Contrassegnare un angolo della membrana PVDF per identificare l'orientamento di caricamento corretto. Mantenere la membrana bagnata.
    NOTA: La membrana PVDF può essere essiccata all'aria e conservata in un contenitore pulito e sigillato. Reidratare la membrana ripetendo i passi 7.3.2.
  2. Posizionare la membrana in 100 mL di soluzione di blocco (5% latte, 1x TBS e 0,1% Tween 20). Bloccare la membrana dondolo delicato a temperatura ambiente (18-20 gradi centigradi) per 1 h.
  3. Tagliare la membrana sopra il marcatore proteico 25 kDa. Posizionare la parte superiore della membrana, contenente bande proteiche superiori a 25 kDa, in soluzione di blocco contenente B23 mouse monoclonal IgG1 (1:500 diluizione). Bloccare durante la notte, dondolando a 4 gradi centigradi.
  4. Posizionare la parte inferiore della membrana, contenente bande proteiche inferiori a 25 kDa, in soluzione di blocco contenente M2 mouse monoclonal IgG1 (1:1,000 diluizione, vedere la Tabella dei materiali). Bloccare durante la notte, dondolando a 4 gradi centigradi.
  5. Lavare la membrana 3x per 10 min in 25 mL di soluzione di lavaggio occidentale (1x TBS, 0,1% Tween 20) su una piattaforma a dondolo.
  6. Incubare le membrane in capra-anti-topo IgG1-HRP (1:5.000 diluizione) diluito in soluzione di blocco per 1 h a temperatura ambiente. Lavare la membrana 3x per 10 min in 25 mL di soluzione di lavaggio occidentale su una piattaforma di dondolo.
  7. Preparare la chemiluminescenza substrato di battesimo occidentale. Utilizzare una micropipetta p1000 per aggiungere il substrato alla membrana.
  8. Sviluppare ogni membrana nel substrato di chemiluminescenza occidentale per 5 min. Rimuovere la membrana dal substrato. Assorbire il substrato in eccesso utilizzando un tergicristallo delicato (vedere la Tabella dei Materiali).
  9. Posizionare la membrana in una protezione del foglio pulita attaccata all'interno di una cassetta. Prendere la cassetta in una stanza buia e inserire un foglio di pellicola nella cassetta. Bloccare la cassetta in posizione e incubare per 5-15 min. Rimuovere il film dalla cassetta e svilupparlo.

9. Colorazione Coomassie

  1. Smontare l'apparato gel occidentale. Affettare e scartare il gel di impilamento, lasciando intatto il gel di risoluzione. Trasferire delicatamente il gel di risoluzione in un vassoio pulito riempito con 25 mL di acqua ultrapura.
  2. Incubare il gel su una piattaforma a dondolo per 15 min. Scartare l'acqua ultrapura e ripetere la fase di lavaggio 2 volte di più.
    NOTA: Se le bolle SDS rimangono dopo le fasi di lavaggio, il gel può essere lavato in acqua ultrapura durante la notte. SDS residua può causare un'elevata colorazione di fondo del gel.
  3. Mescolare il reagente di macchie Coomassie invertendo la bottiglia (vedere la Tabella dei Materiali). Mettere 100 mL di giacco di macchie di Coomassie per coprire il gel di risoluzione e incubare il gel su una piattaforma di dondolo per 1 h. Scartare il reagente di macchie di Coomassie e lavare il gel in acqua deionizzata su una piattaforma a dondolo per 15 min.
  4. Scartare l'acqua deionizzata. Ripetere il passaggio di lavaggio 2 volte di più. Continuare a lavare il gel fino a quando non viene osservata la risoluzione desiderata delle bande proteiche.

10. Colorazione argento

  1. Smontare l'apparato gel occidentale. Affettare e scartare il gel di impilamento, lasciando intatto il gel di risoluzione. Trasferire delicatamente il gel di risoluzione in un vassoio pulito riempito con 25 mL di acqua ultrapura.
  2. Incubare il gel su una piattaforma a dondolo per 15 min. Scartare l'acqua ultrapura e ripetere la fase di lavaggio 2 volte di più.
    NOTA: Se le bolle SDS rimangono dopo le fasi di lavaggio, il gel può essere lavato in acqua ultrapura durante la notte. SDS residua può causare un'elevata colorazione di fondo del gel.
  3. Fissare il gel in 30% di etanolo:10% soluzione di acido acetico (6:3:1 acqua:etanolo:acido acetico) durante la notte a temperatura ambiente. Lavare il gel in una soluzione di etanolo al 10% per 5 min a temperatura ambiente. Sostituire la soluzione di etanolo e lavare per altri 5 min.
  4. Preparare la soluzione di lavoro del sensitista del kit di macchie d'argento Pierce Silver mescolando un'una parte di sensibilizzazione con 500 parti di acqua ultrapura (50 l l di sensibilità con 25 mL di acqua ultrapura). Incubare il gel di risoluzione nella soluzione di lavoro sensibile per 1 min. Lavare il gel in acqua ultrapura per 1 min, sostituire l'acqua e lavare nuovamente il gel per 1 min.
  5. Preparare la soluzione di lavoro delle macchie mescolando un esaltatore di macchie d'argento in una parte con 50 parti di colorazione d'argento (500 l di esaltatore con 25 mL di macchia d'argento). Incubare il gel in soluzione di lavoro macchia per 30 min.
  6. Preparare la soluzione di lavoro dello sviluppatore mescolando 1 parte di esaltatore di macchie d'argento con 50 parti di sviluppo macchia d'argento (500 l di potenziatore con 25 mL di sviluppatore). Preparare la soluzione del 5% dell'acido acetico come soluzione di arresto. Lavare il gel con acqua ultrapura per 1 min, sostituire l'acqua e lavare il gel per un ulteriore 1 min.
  7. Sostituire l'acqua con la soluzione di lavoro dello sviluppatore e incubare fino a quando l'intensità della banda proteica desiderata è risolta (5 min). Sostituire la soluzione di lavoro dello sviluppatore con la soluzione di arresto e incubare per 10 min.

11. Riduzione in gel, alchilazione e digestione delle bande gel macchiate di Coomassie

  1. Tagliare le bande gel dal gel con una lama di rasoio pulita. Tagliare ogni banda di gel a cubetti di circa 5 mm e metterli in un tubo di microcentrifuga pulito da 0,5 ml.
  2. Destain i pezzi di gel coprendoli con bicarbonato di ammonio da 100 mm in 1:1 acetonitrile:acqua a temperatura ambiente per 15 min. Scartare il sovrinnava. Ripetere questo passaggio.
  3. Asciugare i pezzi di gel per 5 min in una centrifuga sottovuoto. Ridurre le proteine coprendo i pezzi di gel essiccati con 10 mM dithiothreitol in bicarbonato di ammonio da 100 mM e incubandoli per 1 h a 56 gradi centigradi.
  4. Pipette fuori qualsiasi supernatante. Alkylate le proteine coprendo i pezzi di gel con 100 mM di iodoacetamide in acqua e incubandole per 1 h a temperatura ambiente al buio.
  5. Pipette fuori il supernatante e ridurre i pezzi di gel coprendoli con acetonitrile e scuotendoli delicatamente a temperatura ambiente per 15 min. Pipette fuori dal supernatante e reswell i pezzi di gel coprendoli con 100 mM di bicarbonato di ammonio e scuotendoli delicatamente a temperatura ambiente per 15 min.
  6. Ripetere il passaggio 11.5. Asciugare i pezzi di gel per 5 min in una centrifuga sottovuoto.
  7. Coprire i pezzi di gel con una trypsin a 50 ng/SL di grado di sequenziamento modificata (vedi la Tabella dei Materiali) in bicarbonato di ammonio da 100 mM. Lasciare gonfiare il gel per 5 min; poi, pipette fuori qualsiasi soluzione rimanente. Coprire i pezzi di gel con bicarbonato di ammonio da 100 mm e consentire loro di risfare completamente, aggiungendo ulteriori 100 mM di bicarbonato di ammonio in modo che i pezzi di gel siano completamente coperti.
  8. Incubare i pezzi di gel durante la notte a 37 gradi centigradi. Interrompere la reazione aggiungendo 1/10 del volume del 10% di acido formica in acqua. Raccogliere il supernatante da ogni tubo.
  9. Estrarre i pezzi di gel coprendoli con l'1% di acido formico nel 60% acetonitrile e incubandoli per 15 min con agitazione delicata.
  10. Ridurre il volume dei supernatanti combinati a meno di 20 anni in una centrifuga sottovuoto, facendo attenzione a evitare di asciugare completamente i supernatanti. Aggiungere l'1% di acido formica per riportare il volume totale a 20.

12. cromatografia liquida/spettrometria di massa

NOTA: i campioni sono stati analizzati utilizzando uno spettrometro di massa dotato di ultra HPLC, una sorgente di nanospray e una colonna (vedere la Tabella dei materiali). I solventi A e B sono rispettivamente dello 0,1% dell'acido formionello nell'acqua e nell'acetonitrile.

  1. Caricare le proteine digerite in fiale autocampionate in polipropilene ad alto recupero. Caricare le fiale nel gestore campione di un sistema UPLC.
  2. Iniettare 6 l di ogni campione. Caricare ogni campione sulla colonna di intrappolamento del nanotile per 1,5 min a 8 l/min, utilizzando il 99% solvente A/1% solvente B.
  3. Eluire i peptidi nello spettrometro di massa con un gradiente lineare dal 3% al 35% del solvente B superiore a 30 min, seguito da un gradiente dal 35% al 50% del solvente B superiore a 4 min e dal 50% al 90% del solvente B su 1 min. Mantenere il 90% di acetonitonile per 3 min; quindi ridurre il %B di nuovo al 3% oltre 5 min.
  4. Acquisire dati di specifiche di massa profilo ioio positivo in modalità risoluzione (risoluzione 20.000). Acquisire dati da 100 a 2.000 Da ad una velocità di una scansione ogni 0,6 s. Acquisire dati in modalità MSE alternando scansioni senza energia di collisione e scansioni con energia di collisione elevata.
  5. Per l'energia di collisione elevata, aumentare l'energia di collisione nella cella Trappola da 15 V a 40 V. Acquisire una scansione di massa di blocco ogni 30 s, utilizzando lo ione da 2 dollari di [Glu1]-Fibrinopeptide B come massa di blocco. Acquisire un file di dati utilizzando un'iniezione vuota di solvente A, utilizzando lo stesso metodo di acquisizione tra ogni coppia di campioni per controllare il riporto.

13. Analisi dei dati per la spettrometria di massa

  1. Copiare i file dei risultati della spettrometria di massa nel computer che esegue una piattaforma di ricerca proteomica quantitativa e qualitativa (ad esempio, ProteinLynx Global Server). L'analisi dei dati richiede un utilizzo intensivo della CPU e deve essere eseguita in un computer di analisi dei dati separato e ad alte prestazioni.
  2. Creare un nuovo progetto per i dati. Creare una nuova piastra microtitera che rappresenta la piastra autocampionatore. Assegnare i campioni nella stessa posizione nella piastra del microtitero della loro posizione nell'autocampionatore.
  3. Assegnare ogni parametro di elaborazione campione. I parametri da utilizzare sono la larghezza del picco cromatico automatico e la risoluzione MSTOF; soglia a bassa energia, 100 conteggi; soglia di energia elevata, 5 conteggi; soglia di intensità, 500 conteggi.
  4. Assegnare ogni campione di parametri del flusso di lavoro. I parametri da utilizzare sono database, swissProt umani concatenati e HIV, con sequenze invertite; tolleranza automatica di peptidi e frammenti; min frammento ios) corrisponde al peptide, 3; corrispondenze di ioni min per proteina, 7; corrispondenze di peptidi min per proteina, 1; reagente di digerire primario, trypsin; scissione mancate, 1; reagenti modificatori fissi, carbamidomethyl C; reagenti modificatori di variabile, ossidazione M; tasso di scoperta falso, 100.
  5. Selezionare gli esempi e scegliere Elabora dati non elaborati più recenti. Al termine della ricerca, selezionare gli esempi e scegliere Esporta dati in scaffold (versione 3). Aprire Scaffold, creare un nuovo file e importare ogni file esportato dalla piattaforma proteomica come nuovo biocampione utilizzando la quantitazione iografica precursore.
  6. Una volta importati tutti i file, passare alla schermata Carica e analizza dati. Selezionare lo stesso database utilizzato per i dati di ricerca e importazione utilizzando il punteggio LFDR e il raggruppamento di proteine standard a livello di esperimento. Impostare le opzioni di visualizzazione su Probabilità di identificazione delleproteine, la soglia della proteina al 20%, il numero minimo di peptidi su 1 e la soglia del peptide allo 0% durante l'analisi.

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Representative Results

Le mutazioni di arginina monopunto e multipunto Rev-NoLS, corrispondenti a una varietà di modelli di localizzazione subcellulare, sono state esaminate nellaloro capacità di interagire con i fattori dell'host cellulare rispetto a WT Rev. vettore sono stati espressi nella cultura HLfB. I complessi proteici sono stati elaborati dal lisa totale delle cellule e macchiati con reagente di macchie d'argento. Rev-NoLS-3'flag è rilevabile (circa 18 kDa) in tre diverse condizioni del buffer di lisi contenenti varie concentrazioni di NaCl (137 mM, 200 mM e 300 mM) nella figura 1. B23 era rilevabile (37 kDa) nel buffer di lisi contenente una minore concentrazione di sale (137 mM, corsie 2–4), appena rilevabile nel buffer di lisi contenente 200 mM NaCl e non rilevabile nel buffer di lisi contenente un'alta concentrazione di sale (300 mM NaCl). Nella figura 2, il flag WT Rev-3'flag, Rev-NoLS M1-3'flag e il vettore pcDNA-flag sono stati espressi nelle impostazioni cultura HLfB. I complessi proteici sono stati elaborati da listi cellulari totali preparati a due condizioni di tampone di lisi (137 mM e 200 mM NaCl). M2 mouse monoclonale IgG1 è stato utilizzato nel rilevamento dell'espressione Rev-3'flag da lysates di cella. Il rilevamento B23 era ottimale nel buffer di lisi contenente 137 mM NaCl con WT Rev-3'flag (input e IP di controllo della barra degli altri dati) ma ha perso l'affinità con il flag Rev-NoLS M1-3'. L'affinità B23 con WT Rev-3'flag è diminuita con una maggiore concentrazione di sale nel buffer di lisi contenente 200 mM NaCl. pcDNA controllo negativo non ha prodotto l'immunorilevamento non specifico in ingresso e il IP di z-flag-Rev di tutte le condizioni del buffer di lisi.

Le condizioni di elusione sono state ottimizzate per l'IP Rev-NoLS-3'flag in Figura 3. WT Rev-3'flag e pcDNA-flag vettore sono stati espressi nella cultura HLfB. I complessi proteici sono stati elaborati da lismi cellulari totali ed eluiti utilizzando tre diverse condizioni per sradicare lo sfondo a catena leggera e pesante (25 e 50 kDa) - 2 volte buffer di carico del campione a 37 s per 15 min, 2x buffer di carico campione a 95 gradi centigradi per 3 min, e 3x bandiera peptid Il Rev NoLS-3'flag (18 kDa) era più rilevabile dopo l'eluizione attraverso l'ebollizione nel buffer di carico del campione 2x. B23 (37 kDa) è stato rilevabile in due condizioni: un'incubazione di 37 gradi centigradi nel buffer di carico del campione 2x per 15 min e 95 s incubazione nel buffer di carico del campione 2x per 3 min.

M2 (nucleare/nucleolar nella localizzazione, non funzionale nella produzionedi HXB2 HIV-1), M6 (nucleolar in schema, funzionale nella produzione HIV-1hXB2) e M9 (disperso nel citoplasma/nucleo, non funzionale nella produzione virale) sono stati espresso nella cultura HLfB. I complessi proteici sono stati elaborati dal lisato totale delle cellule, eluito attraverso un'incubazione di 95 gradi centigradi in 2x buffer di carico del campione per 3 min, e risolto in reagente di macchie d'argento (Figura 4). WT Rev è stato rilevabile dopo la reazione della bandiera IP. Anche Rev-NoLS M2, M6 e M9 erano rilevabili a 18 kDa. Le bande corrispondenti alla proteina B23 sono state osservate al marcatore 37 kDa. I complessi proteici sono stati ulteriormente osservati in ogni corsia corrispondente alle reazioni IP di WT Rev, M2, M6, M9 e pcDNA controllo negativo dello sfondo. Le listicome proteine sono state analizzate mediante immunorilevamento per la bandiera-Rev e il B23. Sono stati espressi un ralto di wT Rev e livelli moderati di M6 (input di flag z) e rilevabili dopo l'IP della bandiera (IP di flag-Rev, Figura 5). M2 e M9 non sono stati altamente espressi da 20 g di ingresso di lisato proteico, ma rilevabili a bassa intensità dopo bandiera IP da 5 mg di lisato proteico. pcDNA controllo negativo non ha dato immunodetection non specifico in ingresso e zo-flag-Rev IP. L'affinità B23 con WT Rev è stata osservata dopo la reazione della bandiera IP (Co-IP B23). L'affinità B23 è stata leggermente osservata con M2 (due mutazioni a punto singolo R48,50G) e M6 (mutazione a punto singolo R50G). L'affinità B23 è stata persa in presenza di tre mutazioni monopunto di M9 (R46,48,50G) all'interno di Rev-NoLS.

I lisati totali delle mutazioni immunoprecipitate di WT Rev e Rev-NoLS-3'flag (4, 5, 6 e 8) sono stati elaborati, macchiati con reagente Coomassie e visualizzati in confronto alle diluizioni seriali BSA (pannello destro). Rev-NoLS-3'flag è rilevabile (12,5-25 g) in presenza e assenza di mutazioni a 18 kDa (Figura 6). I complessi proteici elaborati dalle reazioni IP della bandiera WT Rev-3, dalle mutazioni di Rev-NoLS-3'flag (M4, M5 e M6) di controllo negativo sono stati visualizzati nei gel SDS-PAGE macchiati con il reagente Coomassie (Figura7). WT Rev (WT1 e WT2) è stato rilevabile dopo la reazione della bandiera IP a 18 kDa. Le mutazioni Di Rev-NoLS sono state leggermente rilevabili dopo l'espressione nella reazione hLfB e bandiera IP. pcDNA controllo negativo non ha prodotto sfondo non specifico a 18 kDa.

Lisati immunoprecipitati preparati da WT Rev-3'flag, M2, M6, M9, e il controllo negativo pcDNA-flag (mostrato figura 4) sono stati analizzati da spettrometria di massa tandem. La probabilità di identificazione delle proteine (in percentuale) viene visualizzata per il confronto delle interazioni proteiche che si verificano con ogni mutazione Rev-NoLS-localizzazione nucleolare rispetto a WT Rev (Tabella1). Le proteine cellulari, alcune delle quali sono nucleolare nel modello di localizzazione (isoformi ribosomici, fattore di avvio della traduzione eucarome 48, snoRNA C/D box 58B e nucleofosmina B23), sono state identificate come partner di legame diretto/indiretto di WT Rev. fattori hanno perso l'affinità di legame con M2 (due mutazioni a punto singolo R48,50G), M6 (mutazione a punto singolo R50G) e M9 (tre mutazioni monopunto R46,48,50G), simili al controllo negativopDNA. Ogni corsia del gel macchiato di Coomassie nella Figura 6 è stato elaborato per la spettrometria di massa tandem (Tabella 2). L'affinità peptide alle mutazioni Rev-NoLS è stata analizzata e visualizzata utilizzando la probabilità di identificazione delle proteine (in percentuali). Una varietà di proteine cellulari, alcune delle quali sono nucleolari nel modello di localizzazione (nucleolina C23, nucleofosmina B23 e proteina di assemblaggio nucleosomere), sono state identificate come fattori di legame di proteine dirette/indirette del Rev WT. identificate per il binding con M4, M5 e M6. I fattori di trasporto ARHGEF1 (rho guanine nucleotide factor 1) e TBC1D24 (famiglia di dominio TCB1, membro 24) sono stati persi in affinità in presenza di mutazioni Rev-NoLS. Sono stati inoltre osservati fattori di giunzione hnRNPC (proteina ribonucleare ceterogenea C) e PNN (pinina, proteina associata a desmosoma) per legarsi al Rev WT Rev, che ha perso l'interazione con le mutazioni nucleolarere monopunto Rev.

Figure 1
Figura 1 : Ottimizzazione delle condizioni di lisi cellulare per il co-IP Rev-3'flag durante la produzione di HIV-1. WT Rev-NoLS-3'flag e controllo negativo pcDNA-flag condizioni IP sono stati ottimizzati in tre diverse concentrazioni NaCl (137 mM, 200 mM e 300 mM) nel buffer di lisi. Come osservato attraverso la colorazione dell'argento, 137 mM NaCl era la concentrazione ottimale di sale per l'immunoprecipitazioni Rev e il legame B23. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Ottimizzazione delle condizioni di lisi per l'immunorilevamento Rev-3'flag co-IP e B23 durante la produzione di HIV-1. WT Rev-NoLS-3'flag, M1-3'flag e controllo negativo pcDNA-flag IP condizioni sono state ottimizzate in due diverse concentrazioni NaCl (137 mM e 200 mM) nel buffer di lisi. Come osservato attraverso l'immunodetection, 137 mM NaCl era la concentrazione ottimale di sale per l'immunoprecipitazioni Rev e il legame B23. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Ottimizzazione della eluzionitura co-IP Rev-3'flag durante la produzione di HIV-1, visualizzata dalla colorazione argento. I complessi proteici sono stati elaborati da lisciati cellulari totali preparati durante WT Rev-3'flag e pcDNA-flag IP. Sono state testate tre diverse condizioni di elusione: 2 volte il buffer di carico del campione a 37 gradi centigradi per 15 min, 2 x buffer di carico del campione a 95 gradi centigradi per 3 min e il peptide 3x bandiera a 4 gradi centigradi per 30 min. Le condizioni ottimali di eluizione di WT Rev si sono verificate dopo il periodo di incubazione di 15 min in 2 x buffer di carico del campione a 37 gradi centigradi e dopo il periodo di incubazione di 3 min in buffer di carico del campione 2x a 95 gradi centigradi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Immunoprecipitazioni delle mutazioni 2, 6 e 9 del Rev-3'flag durante la produzione di HIV-1. Complessi proteici che legati direttamente/indirettamente con WT Rev, M2 (R48,50G), M6 (R50G), M9 (R46,48,50G) e controllo negativo pcDNA-flag in presenza di replicaZIONE HIV-1 sono mostrati in un gel SDS-PAGE macchiato d'argento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 : Co-IP Rev-3'flag delle mutazioni 2, 6 e 9 per l'immunorilevamento B23 durante la produzione di HIV-1. Le terapie proteiche e le reazioni IP preparate da WT Rev, M2, M6, M9, e controllo negativo pcDNA-flag nella Figura 4 sono state ulteriormente analizzate per immunorilevamento per z-flag-Rev e B23. WT Rev ed espressione mutante, così come l'interazione con la proteina nucleocitoplasmatica B23, sono osservati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6 : Quantificazione delle mutazioni di Rev-NoLS 4, 5, 6 e 8 dopo la reazione IP del flag . Le reazioni IP di HLfB che esprimono WT Rev e nucleolar-localizzazione M4 (R46G), M5 (R48G), M6 (R50G), M8 (ZRQ) e controllo negativo pcDNA-flag sono state misurate per la concentrazione di proteine utilizzando diluizioni seriali BSA. Per ogni campione è stata osservata una concentrazione proteica di 12,5-25 g. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7 : Immunoprecipitazioni di mutazioni Rev-NoLS di localizzazione nucleolari 4, 5 e 6 durante la produzione di HIV-1. Vengono mostrati il gel SDS-PAGE con macchie di coomassie contenenti complessi proteici immunoprecipitati di WT Rev (1 e 2), M4, M5 e M6. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Proteine identificate Peso molecolare WT Rev M2 (in modo M6 (in inglese) M9 (in e
particella di riconoscimento del segnale 14kDa (proteina omologa del RNA Alu) 15 kDa 95% 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie
proteina ribosomica S3A 30 kDa 95% 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie
fattore di avvio della traduzione eucaostica 4B 69 kDa 95% 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie
proteina ribosomica L31 14 kDa 91% 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie
proteina ribosomica L12 18 kDa 93% 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie
proteina ribosomica L22 15 kDa 91% 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie
piccolo RNA nucleolare, c/d scatola 58B 15 kDa 87% 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie
dito di zinco, dominio CCHC contenente 11 185 kDa 87% 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie
proteina LIM legante actin 1 79 kDa 79% 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie
proteina ribosomica S13 17 kDa 78% 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie
nucleofosmina (nucleolare fosforproteina B23, numatrin) 33 kDa 73% 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie

Tabella 1: Identificazione dei fattori dell'host cellulare che interagiscono con WT Rev durante la produzione di HIV-1. Gli eluati proteici preparati da WT Rev, M2, M6 e M9 sono stati analizzati direttamente dalla spettrometria di massa in tandem. Le interazioni proteiche che sono direttamente/indirettamente legate a WT Rev contro M2, M6 e M9 sono riepilogate per probabilità di identificazione delle proteine (in percentuali).

Proteine identificate Peso molecolare M4 (in questo stato del sistema M5 M6 (in inglese) Wt pCDNA (informazioni in stato inquesto e in
proteina poli(A) legante, citoplasma 1 61 kDa 98% 0 (in vie 100% 100% 0 (in vie
shock termico 70kDa proteina 1B 70 kDa 100% 100% 100% 100% 0 (in vie
proteina ribosomica L7 29 kDa 91% 0 (in vie 100% 100% 0 (in vie
istone cluster 1, H1e 22 kDa 0 (in vie 0 (in vie 100% 100% 0 (in vie
proteina ribosomica L4 48 kDa 95% 0 (in vie 100% 100% 0 (in vie
proteina ribosomica L13 24 kDa 99% 0 (in vie 100% 100% 0 (in vie
componente complemento 1, q proteina legante sottocomponente 31 kDa 100% 100% 100% 100% 0 (in vie
Proteina legante scatola Y 1 36 kDa 0 (in vie 0 (in vie 100% 100% 0 (in vie
proteina assemblaggio nucleosomiana 1-like 1 45 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 100% 0 (in vie
proteina ribosomica L8 28 kDa 89% 36% 100% 100% 0 (in vie
proteina ribosomica L18 22 kDa 27% 0 (in vie 100% 100% 0 (in vie
shock termico 70kDa proteina 8 71 kDa 5% 99% 100% 100% 0 (in vie
proteina ribosomica L19 23 kDa 10% 0 (in vie 81% 100% 0 (in vie
proteina ribosomica L27 16 kDa 92% 0 (in vie 100% 100% 0 (in vie
proteina ribosomica L7a 30 kDa 0 (in vie 0 (in vie 100% 100% 0 (in vie
proteina ribosomica L24 18 kDa 0 (in vie 0 (in vie 100% 99% 0 (in vie
tubulina, beta classe I 50 kDa 92% 69% 100% 100% 0 (in vie
proteina ribosomica L6 33 kDa 0 (in vie 0 (in vie 100% 100% 0 (in vie
shock termico 70kDa proteina 9 (mortalin) 74 kDa 33% 99% 100% 100% 0 (in vie
proteina ribosomica S2 31 kDa 87% 0 (in vie 100% 100% 0 (in vie
caseina chinasi 2, alfa 1 polipeptide 45 kDa 0 (in vie 0 (in vie 50% 100% 0 (in vie
proteina ribosomica L14 23 kDa 0 (in vie 0 (in vie 81% 100% 0 (in vie
proteina ribosomica, grande, P0 34 kDa 0 (in vie 0 (in vie 100% 100% 0 (in vie
istone cluster 1, H1b 23 kDa 0 (in vie 0 (in vie 73% 100% 0 (in vie
shock termico 70kDa proteina 5 (proteina regolata dal glucosio) 72 kDa 99% 0 (in vie 100% 100% 0 (in vie
proteina ribosomica S4, legata all'X 30 kDa 0 (in vie 0 (in vie 100% 100% 0 (in vie
proteina ribosomica S20 13 kDa 98% 94% 99% 99% 0 (in vie
proteina ribosomica L28 16 kDa 0 (in vie 0 (in vie 100% 99% 0 (in vie
proteina ribosomica S14 16 kDa 0 (in vie 0 (in vie 100% 100% 0 (in vie
proteina ribosomica S3A 30 kDa 0 (in vie 0 (in vie 100% 100% 0 (in vie
proteina ribosomica L21 19 kDa 0 (in vie 0 (in vie 100% 100% 0 (in vie
dito di zinco CCCH-tipo, antivirale 1 101 kDa 0 (in vie 0 (in vie 97% 100% 0 (in vie
istone cluster 1, H1c 21 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 98% 0 (in vie
proteina ribosomica L36 12 kDa 0 (in vie 0 (in vie 100% 100% 0 (in vie
proteina ribosomica S18 18 kDa 90% 0 (in vie 100% 100% 0 (in vie
modulatore di apoptosi 1 40 kDa 42% 88% 34% 0 (in vie 0 (in vie
proteina ribosomica L17 21 kDa 0 (in vie 0 (in vie 100% 100% 0 (in vie
proteina ribosomica S26 13 kDa 91% 0 (in vie 99% 98% 0 (in vie
proteina ribosomica L32 18 kDa 0 (in vie 0 (in vie 48% 100% 0 (in vie
proteina ribosomica L35 15 kDa 0 (in vie 0 (in vie 97% 100% 0 (in vie
proteina ribosomica L29 18 kDa 0 (in vie 0 (in vie 57% 94% 0 (in vie
proteina ribosomica S9 23 kDa 0 (in vie 0 (in vie 100% 100% 0 (in vie
ribonucleoproteina nucleare eterogenea H1 (H) 51 kDa 98% 0 (in vie 100% 100% 0 (in vie
proteina ribosomica S8 22 kDa 0 (in vie 0 (in vie 78% 100% 0 (in vie
proteina ribosomica L10 25 kDa 0 (in vie 0 (in vie 100% 100% 0 (in vie
proteina ribosomica L23a 18 kDa 0 (in vie 0 (in vie 68% 100% 0 (in vie
proteina ribosomica S6 29 kDa 0 (in vie 0 (in vie 100% 100% 0 (in vie
proteina ribosomica L31 14 kDa 0 (in vie 0 (in vie 95% 100% 0 (in vie
proteina ribosomica S13 17 kDa 0 (in vie 0 (in vie 100% 99% 0 (in vie
proteina ribosomica L10a 25 kDa 45% 0 (in vie 81% 100% 0 (in vie
proteina poli(A) legante, citoplasma 4 (forma inducibile) 70 kDa 0 (in vie 0 (in vie 100% 100% 0 (in vie
transmembrana emp24 settore di trasporto delle proteine contenente 1 25 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 100% 0 (in vie
Proteina legante EBNA1 2 35 kDa 0 (in vie 0 (in vie 69% 100% 0 (in vie
conservato elica-loop-elica onnipresente chinasi 85 kDa 74% 92% 65% 83% 0 (in vie
proteina ribosomica L12 18 kDa 0 (in vie 0 (in vie 57% 100% 0 (in vie
proteina ribosomica S24 15 kDa 0 (in vie 0 (in vie 100% 100% 0 (in vie
proteina A di dominio shock freddo 40 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 100% 0 (in vie
proteina ribosomica L27a 17 kDa 0 (in vie 0 (in vie 89% 99% 0 (in vie
ribonucleoproteina nucleare eterogenea F 46 kDa 0 (in vie 0 (in vie 99% 99% 0 (in vie
proteina ribosomica L11 20 kDa 0 (in vie 0 (in vie 99% 100% 0 (in vie
proteina ribosomica L26-like 1 17 kDa 0 (in vie 0 (in vie 100% 100% 0 (in vie
caseina chinasi 2, polipeptide alfa primo 41 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 100% 0 (in vie
tubulina, alfa 1a 50 kDa 33% 0 (in vie 100% 0 (in vie 0 (in vie
proteina ribosomica L3 46 kDa 0 (in vie 0 (in vie 86% 94% 0 (in vie
proteina ribosomica mitocondriale L15 33 kDa 0 (in vie 0 (in vie 100% 99% 0 (in vie
nucleolina 77 kDa 0 (in vie 0 (in vie 25% 100% 0 (in vie
proteina ribosomica mitocondriale S21 11 kDa 0 (in vie 0 (in vie 93% 94% 0 (in vie
KRR1, componente di sottounità piccola (SSU) processoma, omologa (lievito) 44 kDa 89% 0 (in vie 76% 99% 0 (in vie
proteina ribosomica mitocondriale S7 28 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 100% 0 (in vie
canale cloruro, sensibile ai nucleotidi, 1A 22 kDa 0 (in vie 0 (in vie 97% 86% 0 (in vie
ciclone B3 158 kDa 0 (in vie 0 (in vie 67% 49% 0 (in vie
nucleoine legame proteina-come 3 (nucleolar) 61 kDa 0 (in vie 0 (in vie 99% 98% 0 (in vie
proteina ribosomica mitocondriale S23 22 kDa 0 (in vie 0 (in vie 100% 50% 0 (in vie
proteina ribosomica mitocondriale S22 41 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 99% 0 (in vie
nucleofosmina (nucleolare fosforproteina B23, numatrin) 33 kDa 0 (in vie 0 (in vie 52% 97% 0 (in vie
proteina ribosomica S19 16 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 99% 0 (in vie
dehydrogenasi gliceraldeide-3-fosfato 36 kDa 0 (in vie 0 (in vie 100% 0 (in vie 0 (in vie
istone cluster 1, H2bg 14 kDa 0 (in vie 0 (in vie 53% 72% 0 (in vie
proteina ribosomica S23 16 kDa 0 (in vie 0 (in vie 68% 0 (in vie 0 (in vie
Rho guanine nucleotide fattore di scambio (GEF) 1 104 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 94% 0 (in vie
proteina associata alla morte 3 46 kDa 0 (in vie 0 (in vie 87% 87% 0 (in vie
proteina ribosomica mitocondriale S6 14 kDa 0 (in vie 0 (in vie 52% 84% 0 (in vie
proteina ribosomica L39 6 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 87% 0 (in vie
proteina ribosomica mitocondriale S28 21 kDa 0 (in vie 0 (in vie 85% 99% 0 (in vie
istone cluster 1, H4h 11 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 93% 0 (in vie
proteina ribosomica mitocondriale L43 23 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 97% 0 (in vie
proteina ribosomica S15 17 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 85% 0 (in vie
proteina ribosomica S12 15 kDa 0 (in vie 0 (in vie 68% 39% 0 (in vie
proteina ribosomica L35a 13 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 96% 0 (in vie
proteina ribosomica mitocondriale L38 45 kDa 0 (in vie 0 (in vie 42% 98% 0 (in vie
proteina ribosomica mitocondriale S14 15 kDa 0 (in vie 0 (in vie 45% 76% 0 (in vie
fosphodiesterase 5A, specifico cGMP 95 kDa 14% 0 (in vie 0 (in vie 72% 0 (in vie
proteina ribosomica L15 24 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 56% 0 (in vie
ribonucleoproteina nucleare eterogenea C (C1/C2) 22 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 100% 0 (in vie
proteina ribosomica mitocondriale S16 11 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 92% 0 (in vie
proteina ribosomica S15a 15 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 91% 0 (in vie
neurexina 2 185 kDa 0 (in vie 50% 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie
candidato alla suscettibilità all'autismo 2 139 kDa 0 (in vie 0 (in vie 46% 0 (in vie 0 (in vie
proteina ribosomica mitocondriale L17 20 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 92% 0 (in vie
fattore di giunzione 3a, sottounità 1, 120kDa 89 kDa 0 (in vie 0 (in vie 56% 89% 0 (in vie
Famiglia di dominio La ribonucleoproteina, membro 1 116 kDa 0 (in vie 0 (in vie 65% 66% 0 (in vie
leprecan-like 2 62 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 68% 0 (in vie
proteina ribosomica L18a 21 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 86% 0 (in vie
proteina ribosomica L23 15 kDa 0 (in vie 0 (in vie 60% 47% 0 (in vie
transmembrana emp24 settore di trasporto delle proteine contenente 9 27 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 78% 0 (in vie
particella di riconoscimento del segnale 72kDa 75 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 100% 0 (in vie
lectin, galactoside-legante, solubile, 3 26 kDa 0 (in vie 71% 28% 0 (in vie 0 (in vie
proteina ribosomica mitocondriale L1 37 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 69% 0 (in vie
H1 histone, membro X 22 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 96% 0 (in vie
caseina chinasi 2, polipeptide beta 25 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 89% 0 (in vie
famiglia di portatori di sodio 4, cotrasporto di bicarbonato di sodio, membro 7 118 kDa 82% 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie
Dominio di ripetizione WD 13 54 kDa 0 (in vie 81% 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie
fattore di allungamento della trascrizione A (SII), 3 17 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 38% 0 (in vie
proteina ribosomica S16 16 kDa 0 (in vie 0 (in vie 75% 0 (in vie 0 (in vie
Proteina del corpo nucleare SP140 92 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 64% 0 (in vie
otoferlina 227 kDa 62% 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie
trasporto golgi 1B 15 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 33% 0 (in vie
proteina ribosomica mitocondriale S34 26 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 33% 0 (in vie
proteina ribosomica L30 13 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 49% 0 (in vie
proteina LIM legante actin 1 96 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 43% 0 (in vie
guanina nucleotide legame proteina-come 2 (nucleolar) 84 kDa 40% 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie
proteina legante lioproteina ad alta densità 141 kDa 0 (in vie 0 (in vie 34% 0 (in vie 0 (in vie
deaminasi di adenosina, specifica dell'RNA, B2 81 kDa 0 (in vie 0 (in vie 28% 0 (in vie 0 (in vie
cistatina E/M 17 kDa 0 (in vie 27% 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie
proteina dito di zinco 786 80 kDa 0 (in vie 0 (in vie 23% 0 (in vie 0 (in vie
pleckstrin homologia-come dominio, famiglia B, membro 1 145 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 95% 0 (in vie
proteina fosforasi metilesterase 1 44 kDa 0 (in vie 0 (in vie 94% 0 (in vie 0 (in vie
janus chinasi e microtubuli che interagiscono proteine 2 95 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 94% 0 (in vie
particella di riconoscimento del segnale 68kDa 67 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 93% 0 (in vie
Famiglia di dominio TBC1, membro 24 63 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 89% 0 (in vie
proteina ribosomica mitocondriale L27 16 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 89% 0 (in vie
proteina ribosomica mitocondriale L2 24 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 88% 0 (in vie
proteina ribosomica mitocondriale S2 33 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 87% 0 (in vie
Dominio di ripetizione Pentatricopeptide 3 79 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 84% 0 (in vie
proteina ribosomica, grande, P2 12 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 76% 0 (in vie
DEhydrogenasi IMP (inosina 5'-monofosfato) 2 56 kDa 0 (in vie 0 (in vie 76% 0 (in vie 0 (in vie
tubulina, beta classe 4B IVb 50 kDa 0 (in vie 0 (in vie 76% 0 (in vie 0 (in vie
proteina ribosomica mitocondriale L23 19 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 74% 0 (in vie
proteina ribosomica mitocondriale S31 45 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 74% 0 (in vie
galactoso-3-O-sulfotransferase 1 49 kDa 74% 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie
soppressore della varietà 4-20 omolog 1 (Drosophila) 99 kDa 0 (in vie 72% 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie
proteina ribosomica mitocondriale S25 20 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 70% 0 (in vie
dominio ribosomal L1 contenente 1 55 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 70% 0 (in vie
famiglia con somiglianza di sequenza 110, membro D 29 kDa 69% 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie
proteina ribosomica L36a-like 12 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 66% 0 (in vie
cerebellina 4 precursore 22 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 64% 0 (in vie
N-acetylglucosamine-1-fosfato transferasi, subunità alfa e beta 144 kDa 64% 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie
RAD51 omolog B (S. cerevisiae) 38 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 64% 0 (in vie
regolatore di allungazione della trascrizione 1 124 kDa 63% 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie
homeobox A1 15 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 62% 0 (in vie
proteina di trasferimento del fosforide 49 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 62% 0 (in vie
Rho GTPase attivante proteina 33 137 kDa 0 (in vie 0 (in vie 54% 0 (in vie 0 (in vie
proteina ribosomica mitocondriale S18B 29 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 52% 0 (in vie
reticulum endolasmico aminopeptidase 2 106 kDa 51% 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie
motivo tripartito contenente 28 89 kDa 0 (in vie 50% 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie
immatura trascrizione carcinoma colon 1 24 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 50% 0 (in vie
AT ricco dominio interattivo 1A (SWI-like) 242 kDa 0 (in vie 0 (in vie 49% 0 (in vie 0 (in vie
proteina ribosomica mitocondriale S17 15 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 48% 0 (in vie
pinina, proteina associata desmosome 82 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 48% 0 (in vie
la proteina fosforasi, dipendente da Mg2/Mn2, 1G 59 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 45% 0 (in vie
G dominio patch e ankyrin ripete 1 39 kDa 45% 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie
proteina ribosomica mitocondriale L3 39 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 44% 0 (in vie
inerbato da benzimidazoles 3 omologi (lievito) 37 kDa 0 (in vie 44% 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie
Ripetizioni WD e tetratricopeptide 1 76 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 44% 0 (in vie
proteina disulfide isomerase famiglia A, membro 2 58 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 42% 0 (in vie
kazrin, periplakin proteine interagenti 86 kDa 0 (in vie 41% 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie
dominio coiled-coil-helix-coiled-coil-helix contenente 2 16 kDa 0 (in vie 0 (in vie 40% 0 (in vie 0 (in vie
proteina shock termico 90kDa alfa (citosolico), classe A membro 1 85 kDa 0 (in vie 0 (in vie 40% 0 (in vie 0 (in vie
retinite pigmentosa GTPase regolatore 83 kDa 0 (in vie 0 (in vie 40% 0 (in vie 0 (in vie
CTD (dominio carboxy-terminale, RNA polymerase II, polipeptide A)
fosfosa, sottounità 1		 104 kDa 0 (in vie 39% 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie
proteina ribosomica mitocondriale L37 48 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 39% 0 (in vie
C2CD2-like 76 kDa 0 (in vie 38% 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie
DnaJ (Hsp40) omolog, sottofamiglia C, membro 6 106 kDa 0 (in vie 0 (in vie 38% 0 (in vie 0 (in vie
proteina ribosomica mitocondriale L51 15 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 38% 0 (in vie
bystin-like 50 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 38% 0 (in vie
proteina associata alla huntingtina 1 76 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 37% 0 (in vie
proteina dito di zinco 263 77 kDa 0 (in vie 36% 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie
ciclo di divisione cellulare e regolatore di apoptosi 1 133 kDa 0 (in vie 0 (in vie 34% 0 (in vie 0 (in vie
cheproteina tirosina, fosfolasi non-recettore di tipo 13
(APO-1/CD95 (Fas)-associata al fosfoso)		 256 kDa 0 (in vie 0 (in vie 34% 0 (in vie 0 (in vie
Dominio KRAB-A contenente 2 56 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 31% 0 (in vie
attivazione del cointegratore di segnale 1 sottounità complessa 2 28 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 31% 0 (in vie
proteina centrosomica 76kDa 74 kDa 0 (in vie 30% 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie
polimerasi (RNA) III (DNA diretto) polipeptide C (62kD) 61 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 30% 0 (in vie
5-idrossitripptamina (serotonina) recettore 6 47 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 29% 0 (in vie
Recettore delle cellule T alfa joining 56 2 kDa 0 (in vie 26% 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie
biorientamento dei cromosomi nella divisione cellulare 1-like 330 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 25% 0 (in vie
Associazione Ras e domini DIL 114 kDa 0 (in vie 0 (in vie 25% 0 (in vie 0 (in vie
Dominio di ripetizione WD 66 130 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 24% 0 (in vie
cromosoma 6 frame di lettura aperto 25 13 kDa 0 (in vie 0 (in vie 22% 0 (in vie 0 (in vie
proteina transmembrana 177 34 kDa 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie 21% 0 (in vie
cellula precursore neurale espressa, sviluppo down-regolato 4-like 101 kDa 0 (in vie 20% 0 (in vie 0 (in vie 0 (in vie

Tabella 2: Identificazione dei fattori dell'ospite cellulare complessa con mutazioni Di Rev nucleolari 4, 5 e 6 durante la produzione di HIV-1. Il gel SDS-PAGE macchiato di Coomassie in Figura 6 è stato elaborato per la spettrometria di massa tandem. I risultati dell'interazione proteica di WT Rev contro le mutazioni nucleolare M4, M5 e M6 sono riepilogati dalla probabilità di identificazione delle proteine (in percentuale).

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Discussion

Sono state valutate le analisi spettrometriche di massa che confrontano le mutazioni Rev-NoLS e WT Rev in presenza di HIV-1 per comprendere i fattori nucleolari coinvolti nel ciclo di replicazione virale. Ciò identificherebbe i componenti nucleolari necessari per l'infettività virale. Nucleolar B23 ha un'alta affinità con Rev-NoLS e funziona nella localizzazione nucleolare del Rev3 e del trasporto nucleocitoplasmatico di mRNA HIV legati al Rev222. L'affinità di B23 con mutazioni Rev-NoLS, che conteneva sostituzioni di arginine singole o multiple, è stata valutata attraverso l'immunoprecipitazioni di Rev-3'flag durante la produzione virale (Figura 2; WT e mutazioni M2, M6 e M9). L'affinità B23 alle mutazioni Di Vela A singolo punto M4, M5 e M6 sono state esaminate in precedenza in presenza di replicaHIV-1. Nello studio precedente, ip eluati di M4, M5, e M6 sono stati sottoposti a immunoblotting occidentale con un anticorpo specifico per la bandiera z per Rev e B23 affinità1. Sullo sfondo delle mutazioni a punto singolo di Rev, l'affinità di legame B23 è stata significativamente ridotta. B23 ha mantenuto l'affinità con WT Rev durante la replica HIV. Si prevede che le mutazioni a punto singolo indotte all'interno di Rev-NoLS diminuiranno l'affinità di legame con altri fattori cellulari che facilitano il legame e il trasporto dell'HIV mRNA. Le mutazioni a punto singolo e multiplo di Rev-NoLS in questo modello abolirono l'affinità nucleoforosmina B23 con Rev, indicando un'interruzione dell'shuttling nucleocitoplasmatica e del trasporto di mRNA HIV. È probabile che i fattori nucleolari (nucleolina C23 e proteina di assemblaggio nucleomino 1), i fattori di trasporto (ARHGEF1 e TCB1D24) e i fattori di giunzione (hnRNPC e PNN) siano coinvolti nel ciclo infettivo dell'HIV-1 attraverso l'interazione con i complessi proteici Rev. La Tabella 1 e la Tabella 2 rivelano vari altri fattori cellulari, sia nucleolari che non nucleolari nel modello, che sono potenzialmente coinvolti nel ciclo di replicazione dell'HIV-1 attraverso il Rev. Il fattore nucleolare - snoRNA C/D box 58, implicato in snoRNA l'elaborazione, il trasporto dello snoRNA al nucleolo, e la metilazione 2'-O-metilazione dell'RNA ribosomico - è stata identificata ma la funzione di questa proteina nel ciclo di replicazione dell'HIV-1 rimane sconosciuta. I ruoli specifici di questi fattori cellulari nel ciclo infettivo HIV-1 sono attualmente in fase di studio.

I risultati qui presentati dimostrano l'uso di questo approccio per l'identificazione di fattori nucleolari virali/ospiti che mantengono il ciclo infettivo dell'HIV-1. I fattori nucleolari virali/ospiti che partecipano ad altri modelli di malattia potrebbero essere identificati utilizzando questo approccio. È inoltre probabile che un fattore nucleolare possa coinvolgere ruoli multifunzionali in vari modelli di malattia. Per esempio, B23 è stato implicato nel trasporto di proteine virali nucleolare, assemblaggio virale, encapsidazione, replicazione e latenza in altri modelli infettivi virali. B23 è caratterizzato nelle interazioni con NoLS di fattori cellulari per il trasporto nucleocitoplasmatico - fattore di crescita p120 (aminoacidi 40-57)23 e C23 processore pre-rRNA (aminoacidi 540–628)24. B23 è anche documentato per interagire con il virus linfotropico dei linfotropici tcino-t umano (HTLV-1) proteina Rex (acidi 1-22)25, HIV-1 Tat (aminoacidi 49-57)2e HIV-1 Rev (aminoacidi 37-47)26. Il genoma del virus dell'encefalite giapponese (JEV) codifica una proteina centrale nucleolare-localizzazione, attraverso la quale gli amminoacidi Gly42 e Pro43 interagiscono con la regione N-terminale di B23 durante l'infezione da JEV, con conseguente trasporto di proteine del nucleo virale/B23 in il nucleo27. Il genoma dell'RNA a filamento singolo del virus dell'epatite B (HBV) è composto parzialmente da DNA a doppio filamento, che codifica una proteina centrale nucleolare. La proteina del nucleo HBV si associa al nucleolina e al B23 nel nucleolus28; B23 è stato dimostrato nell'assemblaggio HBV attraverso l'interazione con il dominio della proteina N-terminale di base. In particolare, gli amminoacidi B23 259-294 si legano al dominio N-terminale della proteina centrale HBV per consentire l'encapsidazione virale29. Il virus dell'epatite D (HDV) a RNA a senso negativo e a filamento singolo esprime l'antigene HDVAg in due isoforme; i piccoli ausili isoformi nella replicazione dell'RNA, e la grande isoforme facilita l'assemblaggio virale. La replicazione dell'RNA avviene all'interno del nucleolo e richiede l'interazione B23 con HDVAg30,31. L'infezione da HDV causa un upregulation di B23, che interagisce principalmente con il piccolo isoforme HDVAg e meno con il grande isoforme HDVAg. Le interazioni avvengono attraverso il piccolo dominio HDVAg NLS, attraverso il quale B23 lega e raggiunge l'accumulo nucleare. Dopo la cancellazione del sito di legame HDV a B23, la replica dell'RNA è stata compromessa. HdVAg è stato indicato per co-localizzare con B23 e nucleolina nel nucleolus. È stato scoperto che Nucleolin possedeva proprietà trascrizionali come repressore32,rivelando il nucleolo come compartimento per la regolazione della replica HDV. B23 è anche coinvolto nella latenza del genoma dell'herpesvirus associato al sarcoma di Kaposi (KSHV). Proteina latente KSHV - v-cyclin - con cinasi CDK6 ospite, fosforilati B23 a Thr199, facilitando l'interazione B23 con l'antigene nucleare associato alla latenza33. L'antigene nucleare associato alla latenza agisce per prevenire la replica litetica virale. L'esaurimento di B23 porta alla riattivazione di KSHV, rivelando B23 come regolatore della latenza KSHV. La funzione B23 nel ciclo di replicazione dell'HIV-1 è caratterizzata nell'attività di trasporto nucleocitoplasmatica di Tat e Rev, e non è noto se B23 possa indurre latenza durante l'infezione da HIV. Il coinvolgimento di B23 nella replicazione, nell'encapsidazione e nell'assemblaggio dell'HIV-1 è attualmente sconosciuto.

L'adattamento di questo metodo ad altri modelli di malattia richiederebbe molto sforzo e tempo per la generazione di backicile infettive carenti di proteine espresse nelle linee cellulari appropriate. Il vantaggio di questa spina dorsaleHXB2 HIV-1 carente di Rev è la capacità di esaminare le mutazioni Rev-NoLS in presenza della spina dorsale virale completa, dei fattori infettivi virali e dei fattori ospiti coinvolti nel ciclo di replica HIV-1. Altri studi hanno esaminato la funzione nucleolare del Rev in assenza dell'intero sistema infettivo HIV-1. La caratterizzazione completa delle vie infettive e della malattia deve includere ambienti rappresentativi che supportino il decorso naturale della progressione della malattia. Sono stati condotti e confrontati due diversi tipi di analisi nella capacità di identificare fattori nucleolari. La tabella 1 elenca i fattori che sono rimasti associati a WT Rev come risultato dell'analisi della spettrometria di massa diretta dell'eluato proteico. Questa analisi ha prodotto diversi fattori noti di HIV-1 Rev. Questo metodo diretto è stato confrontato con un altro processo che ha comportato l'estrazione di proteine separate all'interno di gel SDS-PAGE e l'analisi della spettrometria di massa di tali proteine. Questo secondo metodo ha prodotto una varietà di fattori noti e potenziali che sono legati al complesso proteico Rev, ma mancava delle seguenti proteine precedentemente identificate nella Tabella 1: particella di riconoscimento del segnale 14 kDa, avvio della traduzione eucacale fattore 4B, proteina ribosomica L22, piccolo nucleolar RNA C/D scatola 58B, e zinco dito CCHC dominio contenente 11. In definitiva, il metodo superiore scelto per le analisi della spettrometria di massa in questo protocollo ha comportato l'estrazione di peptidi dai gel SDS-PAGE. Il primo metodo diretto includeva 2x buffer campione nell'eluato blu senza bromofenolo; i restanti componenti del buffer del campione 2x potrebbero interferire con il trattamento completo della provetterina e potrebbero produrre peptidi incompleti per l'analisi della spettrometria di massa. Il secondo metodo indiretto è stato in grado di purificare i peptidi trattati con la trypsina da potenziali contaminanti di SDS-PAGE.

I metodi di preparazione della spettrometria di massa qui descritti potrebbero essere utilizzati per l'identificazione di interventi terapeutici per sradicare l'infezione da HIV-1 attraverso il targeting del Rev. attività dominante-negativa e utilizzato nell'arresto della funzione Rev. Le caratteristiche negative dominanti di interesse per l'arresto funzionale di Rev sono le seguenti: affinità di legame Rev/RRE; rilocalizzazione del multilalarw WT Rev attraverso la multimerizzazione con mutanti Rev; perdita di affinità con i principali fattori cellulari coinvolti nel trasporto e giunzione dell'mRNA HIV-1. Si potrebbe esaminare la multimerizzazione della rev-NoLS con WT Rev. Si prevede che le mutazioni negative dominanti in questo modello si multimerizzeranno con WT Rev e sposteranno modelli nucleolari verso il nucleo e il citoplasma, portando ad un arresto funzionale del reverendo. La spettrometria di massa potrebbe essere utilizzata per identificare la perdita di fattori cellulari chiave coinvolti nello splicing e nel trasporto dell'mRNA HIV-1. L'identificazione delle interazioni mancanti con WT Rev come risultato della coespressione con mutazioni Rev-NoLS dominanti-negative rivelerebbe il coinvolgimento di percorsi specifici dei nucleolari nella patogenesi HIV-1. In alternativa, le particelle virali HIV-1NL4-3 generate sullo sfondo delle mutazioni Rev-NoLS potrebbero essere studiate per tutti i fattori cellulari confezionati. I fattori cellulari e virali confezionati all'interno delle particelle virali possono essere ulteriormente identificati attraverso la spettrometria di massa. Questo rivelerebbe la presenza di fattori nucleolari all'interno delle particelle virali e il ruolo dei fattori nucleolari identificati nell'infezione virale. I metodi descritti sono applicabili ad altri modelli virali e di malattia per l'identificazione e la caratterizzazione di percorsi poco studiati. Ciò consentirebbe lo sviluppo di interventi terapeutici contro le malattie in base alle quali sono disponibili trattamenti limitati.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori riconoscono Dr. Barbara K. Felber e Dr. George N. Pavlakis per la cultura aderente HLfB fornito dal National Institutes of Health (NIH) AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, National Institute of Allergy and Infectious Infectious Malattie (NIAID), NIH. Gli autori riconoscono anche le fonti finanziarie fornite dal NIH, Grants AI042552 e AI029329.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Fisher Chemical A38S-212
Acetonitrile Fisher Chemical A955-500
Acrylamide:Bisacrylamide BioRad 1610158
Ammonium bicarbonate Fisher Chemical A643-500
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich 7727-54-0
ANTI-Flag M2 affinity gel Sigma-Aldrich A2220
anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG Sigma-Aldrich F3165
BioMax MS film Carestream 8294985
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL Bio-Rad 5000006
B23 mouse monoclonal IgG Santa Cruz Biotechnologies sc-47725
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Carnation non-fat powdered milk Nestle N/A
Cell scraper ThermoFisher Scientific 179693PK
C18IonKey nanoTile column Waters 186003763
Corning 100-mm TC-treated culture dishes Fisher Scientific 08-772-22
Dithiothreitol Thermo Scientific J1539714
1 x DPBS Corning 21-030-CVRS
ECL Estern blotting substrate Pierce 32106
Ethanol, 200 proof Fisher Chemical A409-4
FBS Gibco 16000044
Formic Acid Fisher Chemical A117-50
GelCode blue stain reagent ThermoFisher 24590
Glycerol Fisher Chemical 56-81-5
goat-anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz Biotechnologies sc-2005
Iodoacetamide ACROS Organics 122270050
KimWipe delicate task wiper Kimberly Clark Professional 34120
L-glutamine Gibco 25030081
Methanol Fisher Chemical 67-56-1
NanoAcuity UPLC Waters N/A
Pierce Silver Stain Kit Thermo Scientific 24600df
15-mL Polypropylene conical tube Falcon 352097
Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa Thermo Scientific 26616
Protease inhibitor cocktail Roche 4693132001
Purified BSA New England Biolabs B9001
PVDF  Western blotting membrane Roche 3010040001
Sodium Pyruvate Gibco 11360070
10 x TBS Fisher Bioreagents BP2471500
TEMED BioRad 1610880edu
Triton X-100 detergent solution BioRad 1610407
Trizaic source Waters N/A
trypsin-EDTA Corning 25-051-CIS
Tween 20 BioRad 1706531
Synapt G2 mass spectrometer Waters N/A
Whatman filter paper Tisch Scientific 10427813

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Immunologia e Infezione Numero 148 Replicazione HIV-1 rev Immunoprecipitazioni Spettrometria di massa nucleolus B23
Identificazione dei fattori nucleolari durante la replicazione dell'HIV-1 attraverso l'immunoprecipitazioni del rev e la spettrometria di massa
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