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Immunology and Infection

Identificación de factores nucleolares durante la replicación del VIH-1 a través de la inmunoprecipitación de rev y la espectrometría de masas

doi: 10.3791/59329 Published: June 26, 2019

Summary

Aquí describimos la inmunoprecipitación Rev en presencia de replicación del VIH-1 para espectrometría de masas. Los métodos descritos pueden utilizarse para la identificación de factores nucleolares implicados en el ciclo infeccioso VIH-1 y son aplicables a otros modelos de enfermedades para la caracterización de vías poco estudiadas.

Abstract

El ciclo infeccioso VIH-1 requiere interacciones virales con proteínas con factores de huésped para facilitar la replicación viral, el empaquetado y la liberación. El ciclo infeccioso requiere además la formación de complejos proteicos virales/huésped con ARN VIH-1 para regular el empalme y permitir el transporte nucleocitolasmático. La proteína HIV-1 Rev logra la exportación nuclear de ARNM VIH-1 a través de la multimerización con objetivos de acción cisintrónicos - el elemento de respuesta Rev (RRE). Existe una señal de localización nucleolar (NoLS) dentro del coOH-terminus del motivo rico en arginina Rev (ARM), permitiendo la acumulación de complejos Rev/RRE en el nucleolus. Se especula con factores nucleolares para apoyar el ciclo infeccioso del VIH-1 a través de varias otras funciones, además de mediar la exportación nuclear independiente del ARNm y el empalme. Describimos un método de inmunoprecipitación de Rev de tipo salvaje (WT) en comparación con las mutaciones nucleolares Rev (deleción y mutaciones Rev-NoLS de un solo punto) en presencia de replicación del VIH-1 para espectrometría de masas. Los factores nucleolares implicados en el transporte nucleocitotoplasm (nucleophosmin B23 y nucleolin C23), así como los factores de empalme celular, pierden la interacción con Rev en presencia de mutaciones Rev-NoLS. Se identifican otros factores nucleolares, como el esnoRNA C/D 58, para perder la interacción con las mutaciones de Rev, pero su función en el ciclo de replicación del VIH-1 sigue siendo desconocida. Los resultados presentados aquí demuestran el uso de este enfoque para la identificación de factores nucleolares virales/anfitriones que mantienen el ciclo infeccioso VIH-1. Los conceptos utilizados en este enfoque son aplicables a otros modelos virales y de enfermedades que requieren la caracterización de vías poco estudiadas.

Introduction

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El núcleo se postula como el suelo de interacción de varios factores de huésped celular y virales necesarios para la replicación viral. El núcleo es una estructura compleja subdividida en tres compartimentos diferentes: el compartimento fibrilar, el compartimento fibrilar denso y el compartimento granular. La proteína HIV-1 Rev se localiza específicamente dentro de compartimentos granulares; sin embargo, se desconoce la razón de este patrón de localización. En presencia de mutaciones de un solo punto dentro de la secuencia NoLS (mutaciones de Rev 4, 5 y 6), Rev mantiene un patrón nucleolar y se ha demostrado previamente para rescatar la replicación del VIH-1HXB2, sin embargo, con una eficiencia reducida en comparación con WT Rev1 . Todas las mutaciones de un solo punto son incapaces de sostener el ciclo infeccioso VIH-1NL4-3. En presencia de múltiples mutaciones de un solo punto dentro de la secuencia NoLS (mutaciones De Rev-NoLS 2 y 9), se ha observado que Rev se dispersa por todo el núcleo y el citoplasma y no ha podido rescatar la replicación del VIH-1HXB2 1. El objetivo de este estudio proteómico es descifrar factores celulares nucleolares y no nucleolares involucrados en la vía infecciosa VIH-1 mediada por Rev. Las condiciones de inmunoprecipitación de Rev se optimizan mediante la interacción con la fosfoproteína nucleolar B23, que previamente se ha demostrado que pierde la interacción con Rev en presencia de mutaciones nucleolares.

Los factores celulares Rev han sido ampliamente estudiados en el pasado; sin embargo, esto se ha hecho en ausencia de patogénesis viral. Una proteína, en particular, que se caracteriza en este estudio a través de la interacción Rev durante la replicación del VIH-1 es la fosfoproteína nucleolar B23 - también llamada nucleofosmina (NPM), numatrina, o NO38 en anfibios2,3, 4. B23 se expresa como tres isoformas (NPM1, NPM2 y NPM3) - todos los miembros de la familia de chaperosina nuclear de nucleophosmin/nucleoplasmina5,6. El chaperosón molecular NPM1 funciona en el montaje adecuado de nucleosomas, en la formación de complejos proteicos/ácidos nucleicos implicados en las estructuras de alto orden de cromatina7,8, y en la prevención de la agregación y el desdoblamiento erróneo de las proteínas diana a través de un dominio del núcleo N-terminal (residuos 1-120)9. La funcionalidad NPM1 se extiende a la génesis ribosoma a través del transporte de partículas preribosomales entre el núcleo y el citoplasma10,11, el procesamiento del ARN preribosomal en la secuencia del espaciador transcrito interno 12,13, y la detención de la agregación nucleolar de proteínas durante el ensamblaje ribosomal14,15. NPM1 está implicado en la inhibición de la apoptosis16 y en la estabilización de los supresores tumorales ARF17,18 y p5319,revelando su doble papel como factor oncogénico y supresor tumoral. NPM1 participa en las actividades celulares de estabilidad del genoma, replicación centrosoma y transcripción. NPM1 se encuentra en nucleólidos durante la interfase del ciclo celular, a lo largo de la periferia cromosómica durante la mitosis, y en cuerpos prenucleolares (PNB) al final de la mitosis. NPM2 y NPM3 no están tan bien estudiados como NPM1, que sufre niveles alterados de expresión durante la neoplasia maligna20.

NPM1 está documentado en el cierre nucleocitotoplasmático de varias proteínas nucleares/nucleolares a través de un NES interno y NLS9,21 y se informó previamente para impulsar la importación nuclear de proteínas VIH-1 Tat y Rev. En presencia de las proteínas de fusión B23-binding-domain---galactosidase, Tat localiza erróneamente dentro del citoplasma y pierde la actividad de transactivación; esto demuestra una fuerte afinidad de Tat para B232. Otro estudio estableció un complejo estable Rev/B23 en ausencia de ARNm que contienen RRE. En presencia de ARNm RRE, Rev se disocia de B23 y se une preferentemente al VIH RRE, lo que conduce al desplazamiento de B2322. Se desconoce dónde, a nivel subnuclear, se lleva a cabo la transactivación de Tat y el proceso de intercambio de Rev de B23 por ARNm del VIH. Ambas proteínas se postulan para entrar en el nucleolus simultáneamente a través de la interacción B23. Se espera la participación de otras proteínas celulares del huésped en la vía nucleolar del VIH. Los métodos descritos en esta investigación proteómica ayudarán a dilucidar la interacción del nucleol con los factores celulares del huésped involucrados durante la patogénesis del VIH-1.

La investigación proteómica se inició a través de la expresión de mutaciones de un solo punto Rev NoLS (M4, M5 y M6) y múltiples sustituciones de arginina (M2 y M9) para la producción de VIH-1HXB2. En este modelo, una línea celular HeLa que expresa establemente la VIH-1HXB2 (HLfB) deficiente de Rev está transllenada de mutaciones nucleolares WT Rev y Rev que contienen una etiqueta de bandera al final de los 3'. La presencia de WT Rev permitirá que se produzca replicación viral en el cultivo HLfB, en comparación con las mutaciones Rev-NoLS que no rescatan la deficiencia de Rev (M2 y M9), o permiten que se produzca la replicación viral, pero no tan eficientemente como WT Rev (M4, M5 y M6)1. El lisato celular se recoge 48 horas más tarde después de la proliferación viral en presencia de la expresión Rev y se somete a inmunoprecipitación con un tampón de lisis optimizado para la interacción Rev/B23. Se describe la optimización del tampón de lisis utilizando diferentes concentraciones de sal, y los métodos de elución de proteínas para HIV-1 Rev se comparan y analizan en geles SDS-PAGE teñidos de plata o coomassie. El primer enfoque proteómico implica el análisis directo de una muestra eluida de WT Rev, M2, M6 y M9 expresados por espectrometría de masas en tándem. Un segundo enfoque por el cual los eludos de WT Rev, M4, M5 y M6 se sometieron a un proceso de extracción de gel se compara con el primer enfoque. Se analiza la afinidad de péptidos con las mutaciones Rev-NoLS en comparación con WT Rev y se muestra la probabilidad de identificación de proteínas. Estos enfoques revelan factores potenciales (nucleolar y no nucleolar) que participan en el transporte y empalme de ARNm VIH-1 con Rev durante la replicación del VIH-1. En general, las condiciones de lisis celular, IP y elución descritas son aplicables a las proteínas virales de interés para la comprensión de los factores celulares del huésped que activan y regulan las vías infecciosas. Esto también es aplicable al estudio de los factores de huésped celular necesarios para la persistencia de varios modelos de enfermedad. En este modelo proteómico, HIV-1 Rev IP está optimizado para la interacción B23 a factores nucleolares dilucidos involucrados en la actividad de cierre nucleocitolasmático y la unión de ARNm VIH-1. Además, se pueden desarrollar líneas celulares que expresan establemente modelos de enfermedades infecciosas que son deficientes para las proteínas clave de interés, similara a la línea celular HLfB, para estudiar las vías infecciosas de interés.

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Protocol

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1. Cultivo celular

  1. Mantener HLfB en el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM de L-glutamina y 1 mM de piruvato sódico dentro de placas de 100 mm tratadas con cultivo de tejido. Mantener los cultivos celulares a 37oC en una incubadora humidificada suministrada con 5% de CO2. Paso de células confluentes a una densidad celular de 1 x 106 celdas/ml.
  2. Deseche los medios de cultivo celular. Enjuague suavemente las células con 10 ml de 1 solución salina con fosfato (PBS). Retire y deseche el 1x PBS sin interrumpir la capa de celda.
  3. Agregue 2 mL de 1x solución trypsin-EDTA a las células. Mece el plato para recubrir la monocapa e incubar a 37oC dentro de una cámara humidificada durante 5 min.
  4. Toque firmemente el lado del plato con la palma de la mano para separar las células. Resuspenda las células separadas en 8 ml de medios de cultivo fresco. Gire las células a 400 x g durante 5 min.
  5. Deseche los medios de cultivo sin interrumpir el pellet celular. Resuspenda el pellet celular en 10 ml de medios de cultivo fresco. Subcultivo 1 ml de células concentradas con 9 ml de medios de cultivo fresco dentro de placas de 100 mm tratadas con cultivo de tejido.
    NOTA: Para cada mutación Rev-NoLS, las placas de cultivo HLfB o HeLa de 3x 100 mm producirán suficiente lisado proteico para el análisis de manchas occidentales y espectrometría de masas. Agregue placas adicionales para un control positivo WT Rev y un control negativo. El volumen de celda de subcultivo requerirá optimización con el uso de diferentes tipos de celda.

2. Expresión de mutaciones de la bandera Rev-NoLS-3 durante la replicación del VIH-1

  1. Aumente el cultivo celular HLfB a una densidad celular de 2 x 106 células/ml. Prepare 4 ml de suspensión de ADN de fosfato cálcico para cada placa de 100 mm de la siguiente manera.
    1. Etiquetar dos tubos de 15 ml en 1 y 2. Añadir 2 mL de 2x HBS (0,05 M HEPES, 0,28 M NaCl y 1,5 mM Na2HPO4 [pH 7.12]) al tubo 1. Añadir TE 79/10 (1 mM Tris-HCl y 0,1 mM EDTA [pH 7.9]) al tubo 2. El volumen de TE 79/10 es 1.760 mL - el volumen de ADN.
    2. Añadir 20 g de plásmido que contiene la mutación Rev-NoLs-3'flag de interés al tubo 2 y mezclar su contenido a través de la resuspensión. Añadir 240 l de 2 M CaCl2 al tubo 2 y mezclar de nuevo a través de la resuspensión.
    3. Transfiera la mezcla del tubo 2 al tubo 1 en sentido de gota, mezclando suavemente. Deje que la suspensión se situya a temperatura ambiente durante 30 min.
  2. Añadir 1 ml de la suspensión con gotas a cada uno de los cultivos de 3 celdas, placas de 100 mm mientras se arremolina suavemente el medio. Devolver las placas a la incubadora y dejar la mezcla de transfección durante 6 h. Reemplazar la mezcla de transfección por 10 ml de medios de cultivo fresco e incubar las células durante 42 h.

3. Recolección de lisato de proteína viral

  1. Deseche el medio celular 48 h después de la transfección. Coloque cada placa de 100 mm sobre un lecho de hielo. Etiquete los tubos de 15 ml para cada muestra de mutación Rev-NoLS y coloque los tubos en hielo.
  2. Enjuague suavemente las células con 10 ml de PBS 1x preenfriado sin interrumpir la capa celular. Deseche el 1x PBS. Añadir 3 ml de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl [pH 8.0], 137 mM NaCl y 1% de detergente X-100 [ver la Tabla de Materiales]),tratado con cóctel inhibidor de proteasa, a cada una de las placas de 100 mm.
  3. Utilice un rascador de celdas para interrumpir la capa de celda. Incline la placa y raspe suavemente y reúna las células en una piscina. Recoger el lisado celular utilizando un micropipeta de 1.000 ml y mezclar los lysates celulares de cada una de las tres placas de 100 mm en el tubo preetiquetado de 15 ml.
  4. Incubar el lisado celular sobre hielo durante 15 minutos, vórtice cada 5 min. Centrifuge el lisado celular a 15.000 x g durante 5 min.
  5. Recoger el sobrenadante proteico sin interrumpir el pellet de desechos celulares y transferirlo a otro tubo estéril de 15 ml. Obtener la concentración de lisato de proteína viral utilizando el método Bradford (ver sección 4).
  6. Guarde una alícuota de la muestra de entrada (20 g) para el análisis de inmunoblot occidental. Agregue 2x tampón de muestra (20% glicerol, 0.02% azul bromofenol, 125 mM Tris-Cl [pH 6.8], 5% SDS, y 10% 2-mercaptoetanol) al volumen final. Hervirla a 95oC durante 10 min y guardar la muestra de entrada a -20oC.

4. Ensayo bradford

NOTA: Prepare 10x albúmina sérica bovina (BSA) a partir de 100x BSA stock antes de generar curvas estándar de proteínas.

  1. Agua alícuota en tubos de microcentrífuga para los siguientes espacios en blanco y estándares: En blanco a 800 l; Estándar 1 a 2 mg/ml, 798 ml; Estándar 2 a 4 mg/ml, 796 l; Estándar 3 a 6 mg/ml, 794 l; Estándar 4 x 8 mg/ml, 792 l; Estándar 5 a 10 mg/ml, 790 l. Aliquot 10x BSA en las siguientes normas designadas: Estándar 1 a 2 l; Estándar 2 a 4 l; Estándar de 3 a 6 l; Estándar 4 x 8 l; Estándar de 5 a 10 l.
  2. Preparar una mezcla de muestras de proteínas mezclando 795 ml de agua con 5 ml de muestras de proteínas. Añadir 200 ml de reactivo de colorante de ensayo de proteína (ver la Tabla de Materiales)a cada muestra de color blanco, estándar y proteico. Vortex las muestras brevemente para una mezcla uniforme e incubar a temperatura ambiente (18-20 oC) durante 5 min.
  3. Transfiera las muestras de blanco, estándares y proteínas a cubetas. Mida las concentraciones de proteínas a una Do de 595 nm.

5. Coinmunoprecipitación de Rev-NoLS-3'flag

  1. Enjuague 25 ml de perlas de gel de afinidad M2 (ver la Tabla de Materiales)con 500 ml de tampón de lisis, tratado con cóctel inhibidor de proteasa. Enjuague más perlas de gel de afinidad para cada muestra de mutación y controles.
    NOTA: Preparar suficientes perlas de gel de afinidad M2 para dos geles (50 l) - uno para el análisis de inmunoblot occidental y el otro para la tinción de proteínas y espectrometría de masas.
  2. Girar a 820 x g durante 2 min a 4oC. Retire el sobrenadante. Enjuague 2 veces más.
  3. Añadir lisato de proteína viral (1 mg/ml en 5 ml de volumen total) a las perlas de afinidad M2 preenjuagadas. Ajuste el volumen total utilizando el búfer de lisis.
  4. Incubar la reacción durante 3 h, girando a 4oC. Centrifugar las perlas de afinidad M2/leja de proteína viral a 820 x g durante 1 min.
  5. Recoger el sobrenadante y guardar una alícuota de la muestra post-IP (20 g) para el análisis de inmunoblot occidental. Mida la concentración proteica del lisado post-IP. Recoger 20 g para inmunoblotting occidental.
  6. Agregue 2x búfer de muestra al volumen final. Hervirla a 95oC durante 10 min y guardar la muestra post-IP a -20oC.
  7. Enjuague las perlas M2 con 750 ml de tampón de lisis y lave las perlas en un rotador a 4 oC durante 5 minutos.
  8. Repita los pasos 5.7 para dos lavados más en un rotador a 4 oC durante 5 min. Después del tercer lavado, retire cualquier rastro de tampón de lisis del complejo de perlas M2/co-IP usando una punta larga de carga de gel.
    NOTA: Pellizque el extremo de la punta de carga de gel con pinzas planas antes de eliminar cualquier cantidad traza del tampón de lisis. Esto evitará la interrupción y la toma de las cuentas M2.
  9. Resuspenda las perlas M2 en 55 ml de búfer de carga 2x. Hervir la muestra a 95 oC durante 10 min.
  10. Cargar 25 ml de eluido en dos geles SDS-PAGE separados (un gel para inmunoblotting occidental y el otro para la tinción de Coomassie).

6. Preparación de geles SDS-PAGE

  1. Convierte dos geles de resolución de 15% SDS-acrilamida mezclando los siguientes reactivos en un tubo de 50 ml (a un volumen final de 40 ml, suficiente para cuatro geles): 4,16 ml de agua ultrapura, 15 ml de acrilamida 40%:bisacrilamida (29:1), 10 ml de 1,5 M Tris-HCl (pH 8.8) , 400 s de 10% de SDS, 400 ml de 10% de persulfato de amonio y 40 ml de TEMED.
  2. Mezclar el gel de resolución invirtiendo el tubo de 50 ml varias veces. Pipetear la mezcla de gel de resolución en un aparato de gel occidental prelimpiado (cuatro geles - tres para la inmunoblotting occidental y uno para la tinción de Coomassie /plata).
  3. Pipetear suavemente suficiente agua para cubrir la capa superior de la mezcla de gel. Deje que el gel de resolución se polimerice.
  4. Vierta la capa de agua del gel de resolución, utilizando un limpiaparabrisas de tarea delicada (ver la Tabla de Materiales)para absorber el exceso de agua.
  5. Lanzar dos geles de apilamiento de 5% SDS-acrilamida mezclando los siguientes reactivos en un tubo de 50 ml (a un volumen final de 20 ml, suficiente para cuatro geles): 11,88 ml de agua ultrapura, 2,5 ml de 40% acrilamida:bisacrilamida (29:1), 5,2 ml de 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) , 200 s de 10% de SDS, 200 ml de 10% de persulfato de amonio y 20 ml de TEMED.
  6. Mezclar el gel de apilamiento invirtiendo el tubo de 50 ml varias veces. Pipetear la mezcla de gel de apilamiento por encima del gel de resolución en la parte superior del aparato.
  7. Coloque un peine de casete de gel que contenga el número adecuado de carriles en el gel de apilamiento. Absorber cualquier desbordamiento de la mezcla de gel utilizando un limpiaparabrisas de tarea delicada (ver la Tabla de Materiales). Deje que el gel de apilamiento se polimerice por completo.
  8. Inundar el aparato de gel occidental con 1 tampón de carrera occidental (5x concentración: 250 mM Tris-Cl [pH 8.3], 1.92 M glicina, 0.5% SDS, y 10 mM EDTA).
  9. Tire suavemente del peine de casete de gel del gel de apilamiento. Permita que el búfer de ejecución occidental 1x llene los pozos de carga. Enjuague cada pozo con 1 búfer de funcionamiento occidental utilizando una jeringa antes de cargar las muestras.
  10. Cargue las muestras de inmunoblot occidentales en cada gel correspondiente (muestras de entrada, muestras coinmunopreciadas y muestras post-IP). Cargue los marcadores de proteína de gel occidental.
  11. Cargue las muestras coinmunopreciadas para la tinción de Coomassie/plata en otro gel. Cargue los marcadores de proteína de gel occidental.
  12. Conecte el aparato de gel en funcionamiento a una fuente de alimentación y ejecute los geles a 100 V hasta que el tinte de carga llegue al gel de resolución. Aumente la tensión a 140 V hasta que el tinte de carga llegue a la parte inferior del gel de resolución.

7. Transferencia de la mancha occidental

  1. Desmontar el aparato de gel occidental. Cortar y desechar el gel de apilamiento, dejando el gel de resolución intacto.
  2. Transfiera suavemente los geles de resolución a una bandeja limpia llena de tampón de transferencia occidental (25 mM Tris, 194 mM de glicina, 0.005% SDS, 20% de metanol) y remoje durante 15 min.
  3. Montar el aparato de transferencia de gel de la siguiente manera.
    1. Corte tres membranas de transferencia PVDF y seis trozos de papel filtrante (ver la Tabla de Materiales)al tamaño del gel de resolución.
    2. Remoje la membrana PVDF en metanol durante 5 min. Hidratarla en agua durante 5 min. Coloque la membrana PVDF en el tampón de transferencia occidental hasta que esté lista para usar.
    3. Coloque el cassette del soporte de gel en una bandeja de vidrio llena parcialmente con tampón de transferencia occidental, con el lado negro en la parte inferior.
    4. Coloque una almohadilla de espuma empapada con tampón de transferencia occidental contra el lado negro del cassette del soporte de gel.
    5. Humedezca un pedazo de papel de filtro en el búfer de transferencia occidental y colóquelo encima de la almohadilla de espuma. Coloque el gel de resolución encima del papel de filtro.
      NOTA: Coloque el gel de resolución en la orientación de carga correcta que se transferirá a la membrana PVDF.
    6. Coloque una membrana de transferencia PVDF encima del gel de resolución. Humedezca un pedazo de papel de filtro con tampón de transferencia occidental y colóquelo encima de la membrana de transferencia PVDF.
    7. Coloque otra almohadilla de espuma empapada con tampón de transferencia occidental en la parte superior del papel de filtro. Doble cuidadosamente el lado blanco del cassette del soporte de gel en la parte superior de la almohadilla de espuma empapada. Bloquee el cassette firmemente.
    8. Coloque el cassette del soporte de gel en el conjunto del electrodo del aparato de transferencia. Repita los pasos 7.3.4-7.3.8 para cada gel de resolución restante.
    9. Llene el tanque del aparato de transferencia con el tampón de transferencia occidental. Coloque una varilla de agitación en el tanque del aparato.
    10. Coloque el tanque del aparato encima de una placa de agitación. Ajuste el ajuste de agitación a 5-6, asegurándose de que la barra de agitación no esté atascada ni golpeando los cassettes del soporte de gel.
    11. Conecte el aparato de transferencia de gel a una fuente de alimentación y transfiera el gel a 100 V durante 1 h a 4 oC.

8. Inmunoblotting

  1. Retire el cassette del soporte de gel y coloque el lado negro hacia abajo contra una bandeja para hornear de vidrio limpio. Abra el cassette y deseche cuidadosamente la almohadilla de espuma y el papel de filtro. Marque una esquina de la membrana PVDF para identificar la orientación de carga correcta. Mantenga la membrana húmeda.
    NOTA: La membrana PVDF se puede secar al aire y almacenarse en un recipiente limpio y sellado. Rehidrate la membrana repitiendo los pasos 7.3.2.
  2. Coloque la membrana en 100 ml de solución de bloqueo (5% de leche, 1x TBS y 0,1% De 20). Bloquear la membrana balanceando suavemente a temperatura ambiente (18-20 oC) durante 1 h.
  3. Corte a través de la membrana por encima del marcador de proteína de 25 kDa. Colocar la parte superior de la membrana, que contiene bandas proteicas de más de 25 kDa, en solución de bloqueo que contenga B23 ratón monoclonal IgG1 (1:500 dilución). Bloquear durante la noche, balanceándose a 4oC.
  4. Coloque la parte inferior de la membrana, que contiene bandas proteicas de menos de 25 kDa, en solución de bloqueo que contenga M2 ratón monoclonal IgG1 (1:1,000 dilución, ver la Tabla de Materiales). Bloquear durante la noche, balanceándose a 4oC.
  5. Lavar la membrana 3x durante 10 min en 25 mL de solución de lavado occidental (1x TBS, 0.1% Tween 20) en una plataforma de balanceo.
  6. Incubar las membranas de la cabra-anti-ratón IgG1-HRP (1:5,000 dilución) diluido en solución de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente. Lavar la membrana 3x durante 10 min en 25 ml de solución de lavado occidental en una plataforma de balanceo.
  7. Preparar el sustrato de hincha occidental de quimioluminiscencia. Utilice una micropimeta p1000 para añadir el sustrato a la membrana.
  8. Desarrollar cada membrana en sustrato de hinchazón occidental quimioluminiscencia durante 5 min. Retire la membrana del sustrato. Absorber el exceso de sustrato utilizando un limpiaparabrisas de tarea delicada (ver la Tabla de Materiales).
  9. Coloque la membrana en un protector de lámina limpia pegado al interior de un cassette. Lleve el cassette a una habitación oscura y coloque una hoja de película en el cassette. Bloquee el cassette en su lugar e incubar durante 5-15 min. Retire la película del cassette y desarrollela.

9. Tinción de coomassie

  1. Desmontar el aparato de gel occidental. Cortar y desechar el gel de apilamiento, dejando el gel de resolución intacto. Transfiera suavemente el gel de resolución a una bandeja limpia llena de 25 ml de agua ultrapura.
  2. Incubar el gel sobre una plataforma de balanceo durante 15 minutos. Use un balanceo suave para evitar que el gel de resolución se rompa. Deseche el agua ultrapura y repita el paso de lavado 2 veces más.
    NOTA: Si las burbujas SDS permanecen después de los pasos de lavado, el gel se puede lavar en agua ultrapura durante la noche. La SDS residual puede causar una alta tinción de fondo del gel.
  3. Mezclar el reactivo de manchas Coomassie invirtiendo la botella (ver la Tabla de Materiales). Colocar 100 ml de reactivo de manchas Coomassie para cubrir el gel de resolución e incubar el gel sobre una plataforma de mecedor durante 1 h. Deseche el reactivo de manchas Coomassie y lave el gel en agua desionizada en una plataforma de balanceo durante 15 minutos.
  4. Deseche el agua desionizada. Repita el paso de lavado 2 veces más. Continúe lavando el gel hasta que se observe la resolución deseada de las bandas proteicas.

10. Tinción de plata

  1. Desmontar el aparato de gel occidental. Cortar y desechar el gel de apilamiento, dejando el gel de resolución intacto. Transfiera suavemente el gel de resolución a una bandeja limpia llena de 25 ml de agua ultrapura.
  2. Incubar el gel sobre una plataforma de balanceo durante 15 minutos. Use un balanceo suave para evitar que el gel de resolución se rompa. Deseche el agua ultrapura y repita el paso de lavado 2 veces más.
    NOTA: Si las burbujas SDS permanecen después de los pasos de lavado, el gel se puede lavar en agua ultrapura durante la noche. La SDS residual puede causar una alta tinción de fondo del gel.
  3. Fijar el gel en 30% etanol:10% solución de ácido acético (6:3:1 agua:etanol:ácido acético) durante la noche. Lavar el gel en una solución de etanol al 10% durante 5 minutos a temperatura ambiente. Reemplace la solución de etanol y lave durante otros 5 minutos.
  4. Prepare la solución de trabajo sensibilizante del kit de manchas de plata Pierce mezclando un sensitizador de manchas de plata de una parte con 500 partes de agua ultrapura (50 l de sensibilizador con 25 ml de agua ultrapura). Incubar el gel de resolución en la solución de trabajo del sensibilizador durante 1 min. Lavar el gel en agua ultrapura durante 1 min, reemplazar el agua y lavar el gel de nuevo durante 1 min.
  5. Preparar la solución de trabajo de manchas mezclando un potenciador de manchas de plata de una parte con 50 partes de manchas de plata (500 l de potenciador con 25 ml de mancha de plata). Incubar el gel en solución de trabajo con manchas durante 30 min.
  6. Prepare la solución de trabajo para desarrolladores mezclando 1 parte del potenciador de manchas de plata con el desarrollador de manchas de plata de 50 partes (500 l de potenciador con 25 ml de desarrollador). Preparar 5% solución de ácido acético como solución de parada. Lavar el gel con agua ultrapura durante 1 min, reemplazar el agua y lavar el gel durante 1 min adicional.
  7. Sustituya el agua por la solución de trabajo del desarrollador e incubar hasta que se resuelva la intensidad de la banda de proteína deseada (5 min). Reemplace la solución de trabajo para desarrolladores con solución de parada e incubar durante 10 minutos.

11. Reducción en gel, alquilación y digestión de bandas de gel teñidas con Coomassie

  1. Corta las bandas de gel del gel con una cuchilla de afeitar limpia. Corte cada banda de gel en cubos de aproximadamente 5 mm y colóquelos en un tubo de microcentrífuga limpio de 0,5 ml.
  2. Destain las piezas de gel cubriéndolas con bicarbonato de amonio de 100 mM en 1:1 acetonitrilo: agua a temperatura ambiente durante 15 min. Deseche el sobrenadante. Repita este paso.
  3. Seque las piezas de gel durante 5 minutos en una centrífuga al vacío. Reduzca las proteínas cubriendo las piezas de gel seco con 10 mM de dititothreitol en bicarbonato de amonio de 100 mM e incubando durante 1 h a 56 oC.
  4. Quita cualquier sobrenadante. Alquilar las proteínas cubriendo las piezas de gel con yodoacetamida de 100 mM en agua e incubando durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
  5. Pipetear el sobrenadante y encoger las piezas de gel cubriéndolas con acetonitrilo y sacudiéndolos suavemente a temperatura ambiente durante 15 minutos. suavemente a temperatura ambiente durante 15 min.
  6. Repita el paso 11.5. Seque las piezas de gel durante 5 minutos en una centrífuga al vacío.
  7. Cubra las piezas de gel con trippsina modificada de grado de secuenciación de 50 ng/L (ver la Tabla de Materiales)en bicarbonato de amonio de 100 mM. Deje que el gel se hinche durante 5 min; entonces, pipetear cualquier solución restante. Cubrir las piezas de gel con bicarbonato de amonio de 100 mM y permitir que se vuelvan completamente hinchados, añadiendo bicarbonato de amonio adicional de 100 mM para que las piezas de gel estén completamente cubiertas.
  8. Incubar las piezas de gel durante la noche a 37oC. Detenga la reacción añadiendo 1/10 del volumen de ácido fórmico al 10% en agua. Recoger el sobrenadante de cada tubo.
  9. Extrae las piezas de gel cubriéndolas con un 1% de ácido fórmico en 60% de acetonitrilo e incubando durante 15 min con un suave temblor.
  10. Reduzca el volumen de los sobrenatantes combinados a menos de 20 ml en una centrífuga al vacío, mientras se cuida de evitar secar completamente los sobrenatos. Añadir un 1% de ácido fórmico para devolver el volumen total a 20 ml.

12. Cromatografía líquida/espectrometría de masas

NOTA: Las muestras se analizaron utilizando un espectrómetro de masas equipado con ultra HPLC, una fuente de nanospray y una columna (véase la Tabla de Materiales). Los disolventes A y B son 0,1% ácido fórmico en agua y acetonitrilo, respectivamente.

  1. Cargue las proteínas digeridas en viales de automuestreador de polipropileno de alta recuperación. Cargue los viales en el gestor de muestras de un sistema UPLC.
  2. Inyectar 6 l de cada muestra. Cargue cada muestra en la columna de reventado del nanofilo durante 1,5 min a 8 l/min, utilizando un disolvente A/1% de disolvente B al 99%.
  3. Eluir los péptidos en el espectrómetro de masas con un gradiente lineal de 3% a 35% de disolvente B sobre 30 min, seguido de un gradiente de 35% a 50% del disolvente B sobre 4 min y 50% a 90% del disolvente B sobre 1 min. Mantener 90% acetonitrilo durante 3 min; a continuación, reducir el %B de nuevo a 3% durante 5 min.
  4. Adquiera datos de especificaciones de masa de perfil de iones positivos en modo de resolución (resolución 20.000). Adquiera datos de 100 a 2.000 Da a una velocidad de un escaneo cada 0,6 s. Adquiera datos en modo MSE alternando escaneos sin energía de colisión y escaneos con energía de colisión elevada.
  5. Para la energía de colisión elevada, rampa de la energía de colisión en la célula de trampa de 15 V a 40 V. Adquirir un escaneo de masa de bloqueo cada 30 s, utilizando el +2 ion de [Glu1]-Fibrinopéptido B como la masa de bloqueo. Adquiera un archivo de datos utilizando una inyección en blanco del disolvente A, utilizando el mismo método de adquisición entre cada par de muestras para controlar el arrastre.

13. Análisis de datos para espectrometría de masas

  1. Copiar los archivos de resultados de espectrometría de masas en el equipo que ejecuta una plataforma de investigación proteómica cuantitativa y cualitativa (por ejemplo, ProteinLynx Global Server). El análisis de datos es muy intensivo en CPU y debe realizarse en un equipo de análisis de datos independiente de alto rendimiento.
  2. Cree un nuevo proyecto para los datos. Cree una nueva placa de microtíter que represente la placa del muestreador automático. Asigne las muestras a la misma posición en la placa de microtíter que su posición en el muestreador automático.
  3. Asigne cada parámetro de procesamiento de muestras. Los parámetros a utilizar son el ancho de pico cromatográfico automático y la resolución MSTOF; umbral de baja energía, 100 recuentos; umbral de energía elevada, 5 recuentos; umbral de intensidad, 500 recuentos.
  4. Asigne cada parámetro de flujo de trabajo de ejemplo. Los parámetros a utilizar son la base de datos, SwissProt humano concatenado y VIH, con secuencias invertidas; tolerancia automática a péptidos y fragmentos; min fragmento ion matches por péptido, 3; min fragmento ion matches por proteína, 7; partidos mínimos de péptidos por proteína, 1; reactivo de digestión primaria, trippsina; escotes perdidos, 1; reactivos modificadores fijos, carbamidomethyl C; reactivos modificadores variables, oxidación M; falsa tasa de descubrimiento, 100.
  5. Seleccione los ejemplos y elija Procesar datos sin procesar más recientes. Cuando finalice la búsqueda, seleccione los ejemplos y elija Exportar datos a scaffolding (versión 3). Abra Scaffold, cree un nuevo archivo e importe cada archivo exportado desde la plataforma proteómica como una nueva biomuestra utilizando la cuantificación de iones precursores.
  6. Cuando se hayan importado todos los archivos, vaya a la pantalla Cargar y analizar datos. Seleccione la misma base de datos utilizada para los datos de búsqueda e importación mediante la puntuación LFDR y la agrupación de proteínas estándar para todo el experimento. Establezca las opciones de visualización en Probabilidad de identificaciónde proteínas , el umbral de proteína en 20%, el número mínimo de péptidos a 1 y el umbral de péptido a 0% durante el análisis.

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Representative Results

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Las mutaciones de arginina de un solo punto y de punto múltiple Rev-NoLS, correspondientes a una variedad de patrones de localización subcelular, se examinaron en su capacidad de interactuar con los factores de host celular en comparación con WT Rev. WT Rev-3'flag y pcDNA-flag vector se expresaron en la cultura HLfB. Los complejos proteicos se procesaron a partir del lisado celular total y se teñiron con reactivo de manchas de plata. Rev-NoLS-3'flag es detectable (aproximadamente 18 kDa) en tres condiciones diferentes de tampón de lisis que contienen varias concentraciones de NaCl (137 mM, 200 mM y 300 mM) en la Figura1. B23 fue detectable (37 kDa) en tampón de lisis que contiene menor concentración de sal (137 mM, carriles 2-4), apenas detectable en tampón de lisis que contiene 200 mM de NaCl, e indetectable en tampón de lisis que contiene una alta concentración de sal (300 mM NaCl). En la Figura 2, WT Rev-3'flag, Rev-NoLS M1-3'flag y pcDNA-flag vector se expresaron en la cultura HLfB. Los complejos proteicos se procesaron a partir de lisados celulares totales preparados a partir de dos condiciones de tampón de lisis (137 mM y 200 mM naCl). M2 ratón monoclonal IgG1 se utilizó en la detección de la expresión de bandera Rev-3 a partir de lysates celulares. La detección B23 fue óptima en el búfer de lisis que contenía 137 mM NaCl con WT Rev-3'flag (entrada y IP de bandera-Rev) pero perdió afinidad con Rev-NoLS M1-3'flag. La afinidad B23 con el WT Rev-3' bandera disminuyó con una mayor concentración de sal en tampón de lisis que contiene 200 mM NaCl. el control negativo pcDNA no produjo inmunodetección inespecífica en la entrada y ip de la bandera-Rev de todas las condiciones de tampón de lisis.

Las condiciones de elución se optimizaron para Rev-NoLS-3'flag IP en la Figura 3. WT Rev-3'flag y pcDNA-flag vector se expresaron en la cultura HLfB. Los complejos proteicos se procesaron a partir de las lejas celulares totales y se eluyeron utilizando tres condiciones diferentes para erradicar el fondo de cadena ligera y pesada (25 y 50 kDa) - 2x tampón de carga de muestra a 37 oC durante 15 min, 2 x tampón de carga de muestra a 95 oC durante 3 min, y peptid de bandera 3x e a 4 oC durante 30 min. Rev NoLS-3'flag (18 kDa) fue más detectable después de la elución a través de la ebullición en 2x búfer de carga de muestra. B23 (37 kDa) fue detectable en dos condiciones: incubación de 37 oC en búfer de carga de muestras de 2x para incubación de 15 min y 95 oC en búfer de carga de muestra 2x durante 3 min.

M2 (nuclear/nucleolar en localización, no funcional en la producción de VIH-1HXB2), M6 (nucleolar en patrón, funcional en la producción de VIH-1HXB2) y M9 (disperso en el citoplasma/núcleo, no funcional en la producción viral) fueron expresada en la cultura HLfB. Los complejos proteicos se procesaron a partir del lisado celular total, se eluyó a través de la incubación de 95 oC en tampón de carga de muestras de 2x durante 3 min, y se resolvió en reactivo de manchas de plata (Figura4). WT Rev fue detectable después de la reacción del indicador IP. Rev-NoLS M2, M6 y M9 también fueron detectables a 18 kDa. Se observaron bandas correspondientes a la proteína B23 en el marcador de 37 kDa. Se observaron además complejos proteicos en cada carril correspondiente a las reacciones IP de control de fondo negativo WT Rev, M2, M6, M9 y pcDNA. Los leterías de proteínas se analizaron mediante inmunodetección para el valor de la bandera-Rev y B23. Abundante WT Rev y niveles moderados de M6 fueron expresados (entrada de bandera) y detectables después de la ip de la bandera (IP de la bandera-rev, figura5). M2 y M9 no se expresaron altamente a partir de 20 g de entrada de lisato proteico, pero detectables a baja intensidad después de la IP de bandera a partir de 5 mg de lisato proteico. el control negativo pcDNA no produjo inmunodetección inespecífica en la entrada y en la IP de la bandera-Rev. La afinidad B23 con el WT Rev se observó después de la reacción del indicador IP (co-IP B23). La afinidad B23 se observó ligeramente con M2 (dos mutaciones de un solo punto R48,50G) y M6 (mutación de un solo punto R50G). La afinidad B23 se perdió en presencia de tres mutaciones de un solo punto de M9 (R46,48,50G) dentro de Rev-NoLS.

Se procesaron lisatos totales de mutaciones de bandera inmunopreciada WT Rev y Rev-NoLS-3'(4, 5, 6 y 8), se teñiron con reactivo Coomassie y se visualizaron en comparación con las diluciones en serie de La BSA (panel derecho). Rev-NoLS-3'flag es detectable (12,5-25 g) en presencia y ausencia de mutaciones a 18 kDa (Figura6). Los complejos proteicos procesados a partir de reacciones IP de WT Rev-3'flag, mutaciones de bandera de Rev-NoLS-3 de localización nucleolar (M4, M5 y M6) y indicador pcDNAde control negativo se visualizaron en geles SDS-PAGE manchados con reactivo Coomassie (Figura7). WT Rev (WT1 y WT2) fue detectable después de la reacción del indicador IP a 18 kDa. Las mutaciones Rev-NoLS fueron ligeramente detectables después de la expresión en hlfB y la reacción de la bandera IP. pcDNA control negativo no produjo fondo inespecífico a 18 kDa.

Los levasados inmunoprecipitados preparados a partir de WT Rev-3'flag, M2, M6, M9, y el control negativo pcDNA-flag (mostrado en la Figura 4) fueron analizados por espectrometría de masas en tándem. La probabilidad de identificación de proteínas (en porcentajes) se muestra para la comparación de las interacciones proteicas que se producen con cada mutación Rev-NoLS de localización nucleolar frente a WT Rev (Tabla 1). Las proteínas celulares, algunas de las cuales son nucleolares en el patrón de localización (isoformas ribosomales, factor de iniciación de traducción eucariota 48, caja de esnoRNA C/D 58B y nucleofosmin B23), se identificaron como socios de unión directa/indirecta de WT Rev. factores perdieron afinidad de unión a M2 (dos mutaciones de un solo punto R48,50G), M6 (mutación de un solo punto R50G) y M9 (tres mutaciones de un solo punto R46,48,50G), similar al control negativo pcDNA. Cada carril del gel teñido con Coomassie en la Figura 6 se procesó para espectrometría de masas en tándem ( Tabla2). La afinidad de péptidos con mutaciones Rev-NoLS se analizó y se mostró utilizando la probabilidad de identificación de proteínas (en porcentajes). Una variedad de proteínas celulares, algunas de las cuales son nucleolares en patrón de localización (nucleolin A23, nucleophosmin B23 y proteína de ensamblaje de nucleoso), se identificaron como factores de unión a proteínas directas/indirectas de WT Rev. identificados para enlazar con M4, M5 y M6. Los factores de transporte ARHGEF1 (factor de intercambio de nucleótidos de rho guanina 1) y TBC1D24 (familia de dominio TCB1, miembro 24) se perdieron en afinidad en presencia de mutaciones Rev-NoLS. Además, se observó que los factores de empalme hnRNPC (proteína ribonuclear heterogénea C) y PNN (pinin, proteína asociada al desmósoma) se unían a WT Rev, que perdió la interacción con las mutaciones nucleolares de un solo punto Rev.

Figure 1
Figura 1 : Optimización de las condiciones de lisis celular para la co-IP Rev-3'flag durante la producción de VIH-1. WT Rev-NoLS-3'flag y control negativo pcDNA-flag IP condiciones fueron optimizados en tres diferentes concentraciones de NaCl (137 mM, 200 mM, y 300 mM) en tampón de lisis. Como se observó a través de la tinción de plata, 137 mM NaCl fue la concentración óptima de sal para la inmunoprecipitación Rev y la unión B23. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Optimización de las condiciones de lisis para la co-IP de la bandera Rev-3 y la inmunodetección B23 durante la producción de VIH-1. WT Rev-NoLS-3'flag, M1-3'flag, y el control negativo pcDNA-flag IP condiciones fueron optimizados en dos diferentes concentraciones de NaCl (137 mM y 200 mM) en tampón de lisis. Como se observó a través de la inmunodetección, 137 mM NaCl fue la concentración óptima de sal para la inmunoprecipitación Rev y la unión B23. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Optimización de la elución de co-IP Rev-3'flag durante la producción de VIH-1, visualizada por tinción de plata. Los complejos de proteínas se procesaron a partir de los lysaatos celulares totales preparados durante el WT Rev-3'flag y pcDNA-flag IP. Se probaron tres condiciones de elución diferentes: 2 x búfer de carga de muestras a 37 oC durante 15 min, 2 búfer de carga de muestra a 95 oC durante 3 min y péptido de bandera 3x a 4 oC durante 30 minutos. Las condiciones óptimas de elución de WT Rev se produjeron después del período de incubación de 15 minutos en 2x tampón de carga de muestra a 37 oC y después del período de incubación de 3 minutos en búfer de carga de muestra 2x a 95 oC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Inmunoprecipitación de las mutaciones de La bandera de Rev-3'2, 6 y 9 durante la producción de VIH-1. Los complejos proteicos que se unen directa/indirectamente con WT Rev, M2 (R48,50G), M6 (R50G), M9 (R46,48,50G) y control negativo pcDNA-flag en presencia de replicación VIH-1 se muestran en un gel SDS-PAGE teñido de plata. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Rev-3'flag co-IP de mutaciones 2, 6 y 9 para la inmunodetección B23 durante la producción de VIH-1. Los lelístas proteicos y las reacciones IP preparadas a partir de WT Rev, M2, M6, M9 y control negativo pcDNA-flag en la Figura 4 fueron analizados mediante inmunodetección para el valor de la bandera-Rev y B23. SE observan WT Rev y la expresión mutante, así como la interacción con la proteína nucleocitotoplasmática B23. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 : Cuantificación de las mutaciones Rev-NoLS 4, 5, 6 y 8 después de la reacción IP de la bandera . Las reacciones IP de HLfB que expresan WT Rev y nucleolar-localizante M4 (R46G), M5 (R48G), M6 (R50G), M8 (RQ) y control negativo pcDNA-flag se midieron para la concentración de proteínas utilizando diluciones en serie BSA. Se observó una concentración proteica de 12,5-25 g para cada muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7 : Inmunoprecipitación de mutaciones de Rre-NoLS localizantes nucleolares 4, 5 y 6 durante la producción de VIH-1. Se muestran geles SDS-PAGE teñidos de coomassie que contienen complejos de proteínas inmunopreciadas de WT Rev (1 y 2), M4, M5 y M6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Proteínas identificadas Peso molecular WT Rev M2 M6 M9
partícula de reconocimiento de señal 14kDa (proteína de unión al ARN Alu homóloga) 15 kDa 95% 0 0 0
proteína ribosomal S3A 30 kDa 95% 0 0 0
factor de iniciación de la traducción eucariota 4B 69 kDa 95% 0 0 0
proteína ribosomal L31 14 kDa 91% 0 0 0
proteína ribosomal L12 18 kDa 93% 0 0 0
proteína ribosomal L22 15 kDa 91% 0 0 0
ARN nucleolar pequeño, caja C/D 58B 15 kDa 87% 0 0 0
dedo de zinc, dominio CCHC que contiene 11 185 kDa 87% 0 0 0
actin binding LIM proteína 1 79 kDa 79% 0 0 0
proteína ribosomal S13 17 kDa 78% 0 0 0
nucleofosmina (fosfoproteína nucleolar B23, numatrin) 33 kDa 73% 0 0 0

Tabla 1: Identificación de factores de host celular que interactúan con WT Rev durante la producción de VIH-1. Los eluidos de proteínas preparados a partir de WT Rev, M2, M6 y M9 fueron analizados directamente por espectrometría de masas en tándem. Las interacciones proteicas que están vinculadas directa/indirectamente a WT Rev versus M2, M6 y M9 se resumen por probabilidad de identificación de proteínas (en porcentajes).

Proteínas identificadas Peso molecular M4 M5 M6 Wt pCDNA
proteína de unión poli(A), citoplasma 1 61 kDa 98% 0 100% 100% 0
choque térmico 70kDa proteína 1B 70 kDa 100% 100% 100% 100% 0
proteína ribosomal L7 29 kDa 91% 0 100% 100% 0
histone cluster 1, H1e 22 kDa 0 0 100% 100% 0
proteína ribosomal L4 48 kDa 95% 0 100% 100% 0
proteína ribosomal L13 24 kDa 99% 0 100% 100% 0
complementar el componente 1, q proteína de unión al subcomponente 31 kDa 100% 100% 100% 100% 0
Proteína de unión Y box 1 36 kDa 0 0 100% 100% 0
proteína de ensamblaje de nucleosos 1-como 1 45 kDa 0 0 0 100% 0
proteína ribosomal L8 28 kDa 89% 36% 100% 100% 0
proteína ribosomal L18 22 kDa 27% 0 100% 100% 0
choque térmico 70kDa proteína 8 71 kDa 5% 99% 100% 100% 0
proteína ribosomal L19 23 kDa 10% 0 81% 100% 0
proteína ribosomal L27 16 kDa 92% 0 100% 100% 0
proteína ribosomal L7a 30 kDa 0 0 100% 100% 0
proteína ribosomal L24 18 kDa 0 0 100% 99% 0
tubulina, beta clase I 50 kDa 92% 69% 100% 100% 0
proteína ribosomal L6 33 kDa 0 0 100% 100% 0
choque térmico 70kDa proteína 9 (mortalin) 74 kDa 33% 99% 100% 100% 0
proteína ribosomal S2 31 kDa 87% 0 100% 100% 0
caseína quinasa 2, alfa 1 polipéptido 45 kDa 0 0 50% 100% 0
proteína ribosomal L14 23 kDa 0 0 81% 100% 0
proteína ribosomal, grande, P0 34 kDa 0 0 100% 100% 0
histone cluster 1, H1b 23 kDa 0 0 73% 100% 0
choque térmico 70kDa proteína 5 (proteína regulada por glucosa) 72 kDa 99% 0 100% 100% 0
proteína ribosomal S4, ligada al X 30 kDa 0 0 100% 100% 0
proteína ribosomal S20 13 kDa 98% 94% 99% 99% 0
proteína ribosomal L28 16 kDa 0 0 100% 99% 0
proteína ribosomal S14 16 kDa 0 0 100% 100% 0
proteína ribosomal S3A 30 kDa 0 0 100% 100% 0
proteína ribosomal L21 19 kDa 0 0 100% 100% 0
dedo de zinc tipo CCCH, antiviral 1 101 kDa 0 0 97% 100% 0
histone cluster 1, H1c 21 kDa 0 0 0 98% 0
proteína ribosomal L36 12 kDa 0 0 100% 100% 0
proteína ribosomal S18 18 kDa 90% 0 100% 100% 0
modulador de la apoptosis 1 40 kDa 42% 88% 34% 0 0
proteína ribosomal L17 21 kDa 0 0 100% 100% 0
proteína ribosomal S26 13 kDa 91% 0 99% 98% 0
proteína ribosomal L32 18 kDa 0 0 48% 100% 0
proteína ribosomal L35 15 kDa 0 0 97% 100% 0
proteína ribosomal L29 18 kDa 0 0 57% 94% 0
proteína ribosomal S9 23 kDa 0 0 100% 100% 0
ribonucleoproteína nuclear heterogénea H1 (H) 51 kDa 98% 0 100% 100% 0
proteína ribosomal S8 22 kDa 0 0 78% 100% 0
proteína ribosomal L10 25 kDa 0 0 100% 100% 0
proteína ribosomal L23a 18 kDa 0 0 68% 100% 0
proteína ribosomal S6 29 kDa 0 0 100% 100% 0
proteína ribosomal L31 14 kDa 0 0 95% 100% 0
proteína ribosomal S13 17 kDa 0 0 100% 99% 0
proteína ribosomal L10a 25 kDa 45% 0 81% 100% 0
proteína de unión a la poli(A), citoplasmática 4 (forma inducible) 70 kDa 0 0 100% 100% 0
transmembrana emp24 dominio de transporte de proteínas que contiene 1 25 kDa 0 0 0 100% 0
Proteína de unión EBNA1 2 35 kDa 0 0 69% 100% 0
conservada hélice-bucle-helix ubicua quinasa 85 kDa 74% 92% 65% 83% 0
proteína ribosomal L12 18 kDa 0 0 57% 100% 0
proteína ribosomal S24 15 kDa 0 0 100% 100% 0
proteína de dominio de choque frío A 40 kDa 0 0 0 100% 0
proteína ribosomal L27a 17 kDa 0 0 89% 99% 0
ribonucleoproteína nuclear heterogénea F 46 kDa 0 0 99% 99% 0
proteína ribosomal L11 20 kDa 0 0 99% 100% 0
proteína ribosomal L26-como 1 17 kDa 0 0 100% 100% 0
caseína quinasa 2, polipéptido alfa prima 41 kDa 0 0 0 100% 0
tubulina, alfa 1a 50 kDa 33% 0 100% 0 0
proteína ribosomal L3 46 kDa 0 0 86% 94% 0
proteína ribosomal mitocondrial L15 33 kDa 0 0 100% 99% 0
nucleolina 77 kDa 0 0 25% 100% 0
proteína ribosomal mitocondrial S21 11 kDa 0 0 93% 94% 0
KRR1, componente de proceso de subunidad pequeña (SSU), homólogo (levadura) 44 kDa 89% 0 76% 99% 0
proteína ribosomal mitocondrial S7 28 kDa 0 0 0 100% 0
canal de cloruro, sensible a los nucleótidos, 1A 22 kDa 0 0 97% 86% 0
ciclina B3 158 kDa 0 0 67% 49% 0
nucleótino nucleótido-como proteína 3 (nucleolar) 61 kDa 0 0 99% 98% 0
proteína ribosomal mitocondrial S23 22 kDa 0 0 100% 50% 0
proteína ribosomal mitocondrial S22 41 kDa 0 0 0 99% 0
nucleofosmina (fosfoproteína nucleolar B23, numatrin) 33 kDa 0 0 52% 97% 0
proteína ribosomal S19 16 kDa 0 0 0 99% 0
gliceraldehyde-3-fosfato deshidrogenasa 36 kDa 0 0 100% 0 0
histone cluster 1, H2bg 14 kDa 0 0 53% 72% 0
proteína ribosomal S23 16 kDa 0 0 68% 0 0
Factor de intercambio de nucleótido de rho guanina (GEF) 1 104 kDa 0 0 0 94% 0
proteína asociada a la muerte 3 46 kDa 0 0 87% 87% 0
proteína ribosomal mitocondrial S6 14 kDa 0 0 52% 84% 0
proteína ribosomal L39 6 kDa 0 0 0 87% 0
proteína ribosomal mitocondrial S28 21 kDa 0 0 85% 99% 0
histone cluster 1, H4h 11 kDa 0 0 0 93% 0
proteína ribosomal mitocondrial L43 23 kDa 0 0 0 97% 0
proteína ribosomal S15 17 kDa 0 0 0 85% 0
proteína ribosomal S12 15 kDa 0 0 68% 39% 0
proteína ribosomal L35a 13 kDa 0 0 0 96% 0
proteína ribosomal mitocondrial L38 45 kDa 0 0 42% 98% 0
proteína ribosomal mitocondrial S14 15 kDa 0 0 45% 76% 0
fosfodiesterasa 5A, específica de cGMP 95 kDa 14% 0 0 72% 0
proteína ribosomal L15 24 kDa 0 0 0 56% 0
ribonucleproteína nuclear heterogénea C (C1/C2) 22 kDa 0 0 0 100% 0
proteína ribosomal mitocondrial S16 11 kDa 0 0 0 92% 0
proteína ribosomal S15a 15 kDa 0 0 0 91% 0
ninrexina 2 185 kDa 0 50% 0 0 0
candidato de susceptibilidad al autismo 2 139 kDa 0 0 46% 0 0
proteína ribosomal mitocondrial L17 20 kDa 0 0 0 92% 0
factor de empalme 3a, subunidad 1, 120kDa 89 kDa 0 0 56% 89% 0
Familia de dominio la ribonucleoprotein, miembro 1 116 kDa 0 0 65% 66% 0
leprecan-como 2 62 kDa 0 0 0 68% 0
proteína ribosomal L18a 21 kDa 0 0 0 86% 0
proteína ribosomal L23 15 kDa 0 0 60% 47% 0
transmembrana emp24 dominio de transporte de proteínas que contiene 9 27 kDa 0 0 0 78% 0
partícula de reconocimiento de señal 72kDa 75 kDa 0 0 0 100% 0
lectina, unión a galactoside, soluble, 3 26 kDa 0 71% 28% 0 0
proteína ribosomal mitocondrial L1 37 kDa 0 0 0 69% 0
H1 histone familia, miembro X 22 kDa 0 0 0 96% 0
caseína quinasa 2, beta polipéptido 25 kDa 0 0 0 89% 0
familia portadora de soluto 4, cotransportador de bicarbonato de sodio, miembro 7 118 kDa 82% 0 0 0 0
Dominio repetido WD 13 54 kDa 0 81% 0 0 0
alargamiento de la transcripción A (SII), 3 17 kDa 0 0 0 38% 0
proteína ribosomal S16 16 kDa 0 0 75% 0 0
SP140 proteína del cuerpo nuclear 92 kDa 0 0 0 64% 0
otoferlin 227 kDa 62% 0 0 0 0
transporte golgi 1B 15 kDa 0 0 0 33% 0
proteína ribosomal mitocondrial S34 26 kDa 0 0 0 33% 0
proteína ribosomal L30 13 kDa 0 0 0 49% 0
actin binding LIM proteína 1 96 kDa 0 0 0 43% 0
nucleótino nucleótido-como proteína 2 (nucleolar) 84 kDa 40% 0 0 0 0
proteína de unión a lipoproteínas de alta densidad 141 kDa 0 0 34% 0 0
adenosina deaminasa, específica de ARN, B2 81 kDa 0 0 28% 0 0
cystatin E/M 17 kDa 0 27% 0 0 0
proteína de dedo de zinc 786 80 kDa 0 0 23% 0 0
dominio similar a la homología pleckstrin, familia B, miembro 1 145 kDa 0 0 0 95% 0
proteína fosfatasa metilesterasa 1 44 kDa 0 0 94% 0 0
janus quinasa y microtúbulo que interactúan con la proteína 2 95 kDa 0 0 0 94% 0
partícula de reconocimiento de señal 68kDa 67 kDa 0 0 0 93% 0
Familia de dominio TBC1, miembro 24 63 kDa 0 0 0 89% 0
proteína ribosomal mitocondrial L27 16 kDa 0 0 0 89% 0
proteína ribosomal mitocondrial L2 24 kDa 0 0 0 88% 0
proteína ribosomal mitocondrial S2 33 kDa 0 0 0 87% 0
Pentatricopéptido repetir dominio 3 79 kDa 0 0 0 84% 0
proteína ribosomal, grande, P2 12 kDa 0 0 0 76% 0
IMP (inosina 5'monofosfato) deshidrogenasa 2 56 kDa 0 0 76% 0 0
tubulina, beta clase 4B IVb 50 kDa 0 0 76% 0 0
proteína ribosomal mitocondrial L23 19 kDa 0 0 0 74% 0
proteína ribosomal mitocondrial S31 45 kDa 0 0 0 74% 0
galactosa-3-O-sulfotransferasa 1 49 kDa 74% 0 0 0 0
supresor de la variegación 4-20 homólogo 1 (Drosophila) 99 kDa 0 72% 0 0 0
proteína ribosomal mitocondrial S25 20 kDa 0 0 0 70% 0
dominio ribosomal L1 que contiene 1 55 kDa 0 0 0 70% 0
familia con similitud de secuencia 110, miembro D 29 kDa 69% 0 0 0 0
proteína ribosomal L36a-como 12 kDa 0 0 0 66% 0
cerebellin 4 precursor 22 kDa 0 0 0 64% 0
N-acetilglucosamina-1-fosfato transferasa, alfa y beta subunidades 144 kDa 64% 0 0 0 0
RAD51 homólogo B (S. cerevisiae) 38 kDa 0 0 0 64% 0
regulador de alargamiento de transcripción 1 124 kDa 63% 0 0 0 0
homeobox A1 15 kDa 0 0 0 62% 0
proteína de transferencia de fosfolípidos 49 kDa 0 0 0 62% 0
Rho GTPase activa la proteína 33 137 kDa 0 0 54% 0 0
proteína ribosomal mitocondrial S18B 29 kDa 0 0 0 52% 0
retículum aminopeptidasa endoplasmática 2 106 kDa 51% 0 0 0 0
motivo tripartito que contiene 28 89 kDa 0 50% 0 0 0
transcripción del carcinoma de colon inmaduro 1 24 kDa 0 0 0 50% 0
Dominio interactivo enriquecido de AT 1A (similar a SWI) 242 kDa 0 0 49% 0 0
proteína ribosomal mitocondrial S17 15 kDa 0 0 0 48% 0
pinin, proteína asociada a la desmósoma 82 kDa 0 0 0 48% 0
proteína fosfatasa, mg2 + / Mn2 + dependiente, 1G 59 kDa 0 0 0 45% 0
G dominio de parche y anquirin a xrepeticiones 1 39 kDa 45% 0 0 0 0
proteína ribosomal mitocondrial L3 39 kDa 0 0 0 44% 0
en ciernes desinhibidos por benzimidazoles 3 homólogos (levadura) 37 kDa 0 44% 0 0 0
WD y tetratricopéptidos se repiten 1 76 kDa 0 0 0 44% 0
proteína disulfuro issomerasa familia A, miembro 2 58 kDa 0 0 0 42% 0
kazrina, perilakin es proteína que interactúa 86 kDa 0 41% 0 0 0
bobinado-bobina-hélice-coiled-coiled-coil-helix dominio que contiene 2 16 kDa 0 0 40% 0 0
proteína de choque térmico 90kDa alfa (citosólico), miembro de clase A 1 85 kDa 0 0 40% 0 0
regulador de retinitis pigmentosa GTPase 83 kDa 0 0 40% 0 0
CTD (dominio carboxia-terminal, ARN polimerasa II, polipéptido A)
fosfatasa, subunidad 1
104 kDa 0 39% 0 0 0
proteína ribosomal mitocondrial L37 48 kDa 0 0 0 39% 0
C2CD2-como 76 kDa 0 38% 0 0 0
DnaJ (Hsp40) homólogo, subfamilia C, miembro 6 106 kDa 0 0 38% 0 0
proteína ribosomal mitocondrial L51 15 kDa 0 0 0 38% 0
bystin-como 50 kDa 0 0 0 38% 0
proteína asociada a la huntingtina 1 76 kDa 0 0 0 37% 0
proteína de dedo de zinc 263 77 kDa 0 36% 0 0 0
ciclo de división celular y regulador de apoptosis 1 133 kDa 0 0 34% 0 0
proteína tirosina fosfatasa, no receptor tipo 13
(APO-1/CD95 (Fas)-asociado a fosfatasa)
256 kDa 0 0 34% 0 0
Dominio KRAB-A que contiene 2 56 kDa 0 0 0 31% 0
activación de la señal cointegrator 1 subunidad compleja 2 28 kDa 0 0 0 31% 0
proteína centrosomal 76kDa 74 kDa 0 30% 0 0 0
polimerasa (ARN) III (dirigida por ADN) polipéptido C (62kD) 61 kDa 0 0 0 30% 0
5-hidroxitriptamina (serotonina) receptor 6 47 kDa 0 0 0 29% 0
Receptor de células T alfa uniéndose 56 2 kDa 0 26% 0 0 0
biorientación de los cromosomas en la división celular 1-como 330 kDa 0 0 0 25% 0
Asociación Ras y dominios DIL 114 kDa 0 0 25% 0 0
Dominio repetido WD 66 130 kDa 0 0 0 24% 0
cromosoma 6 marco de lectura abierto 25 13 kDa 0 0 22% 0 0
proteína transmembrana 177 34 kDa 0 0 0 21% 0
célula precursora neuronal expresada, el desarrollo regulado hacia abajo 4-como 101 kDa 0 20% 0 0 0

Tabla 2: Identificación de factores de huésped celular complejos con mutaciones Rev de localización nucleolar 4, 5 y 6 durante la producción de VIH-1. El gel SDS-PAGE teñido de Coomassie en la Figura 6 se procesó para espectrometría de masas en tándem. Los resultados de interacción proteica de WT Rev frente a mutaciones nucleolares M4, M5 y M6 se resumen por probabilidad de identificación de proteínas (en porcentajes).

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Discussion

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Se evaluaron análisis espectrométricos masivos que comparaban las mutaciones Rev-NoLS y WT Rev en presencia de VIH-1 para comprender los factores nucleolares involucrados en el ciclo de replicación viral. Esto identificaría los componentes nucleolares necesarios para la infectividad viral. Nucleolar B23 tiene una alta afinidad con Rev-NoLS y funciona en la localización nucleolar de Rev3 y transporte nucleocitotoplasmático de MRNAs 22 de VIH ligados a Rev. La afinidad de B23 con las mutaciones Rev-NoLS, que contenían sustituciones de arginina única o múltiple, se evaluó mediante la inmunoprecipitación de la bandera Rev-3'durante la producción viral (Figura2; WT y mutaciones M2, M6 y M9). La afinidad B23 con las mutaciones de un solo punto Rev-NoLS M4, M5 y M6 se examinó previamente en presencia de replicación del VIH-1. En el estudio anterior, los eluidos IP de M4, M5 y M6 fueron sometidos a inmunoblotting occidental con un anticuerpo específico de la bandera de la marca para la afinidad Rev y B231. En el fondo de las mutaciones de un solo punto rev, la afinidad de unión B23 se redujo significativamente. B23 mantuvo afinidad con WT Rev durante la replicación del VIH. Se esperaba que las mutaciones de un solo punto inducidas dentro de Rev-NoLS disminuyeran la afinidad de unión a otros factores de huésped celular que facilitan la unión y el transporte del ARNm del VIH. Las mutaciones de un solo punto y de múltiples puntos Rev-NoLS en este modelo suprimieron la afinidad de la nucleofosmina B23 a Rev, lo que indica una interrupción en el cierre nucleocitoplasmasísmo y el transporte de ARNm del VIH. Es probable que los factores nucleolares (nucleolin C23 y proteína de ensamblaje de nucleososoma 1), los factores de transporte (ARHGEF1 y TCB1D24) y los factores de empalme (hnRNPC y PNN) participen en el ciclo infeccioso del VIH-1 mediante la interacción con los complejos proteicos Rev. La Tabla 1 y la Tabla 2 revelan varios otros factores celulares, tanto nucleolares como no nucleolares en el patrón, que están potencialmente involucrados en el ciclo de replicación del VIH-1 a través de Rev. procesamiento, el transporte de snoRNA al nucleolus, y 2'-O-metilación del ARN ribosomal - se identificó sin embargo la función de esta proteína en el ciclo de replicación del VIH-1 sigue siendo desconocida. Actualmente se están investigando las funciones específicas de estos factores celulares en el ciclo infeccioso VIH-1.

Los resultados presentados aquí demuestran el uso de este enfoque para la identificación de factores nucleolares virales/anfitriones que mantienen el ciclo infeccioso VIH-1. Los factores nucleolares virales/huésped que participan en otros modelos de enfermedades podrían identificarse utilizando este enfoque. Es probable que un factor nucleolar pueda implicar funciones multifuncionales en varios modelos de enfermedades. Por ejemplo, B23 se ha implicado en el transporte de proteínas virales nucleolares, ensamblaje viral, encaptidación, replicación y latencia en otros modelos infecciosos virales. B23 se caracteriza por interacciones con NoLS de factores celulares para el transporte nucleocitotoplasmático - factor de crecimiento p120 (aminoácidos 40-57)23 y C23 procesador pre-rRNA (aminoácidos 540–628)24. B23 también está documentado para interactuar con el virus linfotrópico de células T humana (HTLV-1) proteína Rex (aminoácidos 1-22)25, VIH-1 Tat (aminoácidos 49–57)2,y HIV-1 Rev (aminoácidos 37-47)26. El genoma del virus de la encefalitis japonesa (VJE) codifica una proteína central de localización nucleolar, a través de la cual los aminoácidos Gly42 y Pro43 interactúan con la región N-terminal de B23 durante la infección por el VJE, lo que resulta en el transporte de proteína de núcleo viral/B23 a el núcleo27. El genoma de ARN de una sola cadena del virus de la hepatitis B (VHB) se compone parcialmente de ADN de doble cadena, que codifica una proteína central nucleolar. La proteína central del VHB se asocia con nucleolina y B23 en el nucleolus28; B23 se demostró en el conjunto del VHB a través de la interacción con el dominio de la proteína central N-terminal. Específicamente, los aminoácidos B23 259-294 se unen al dominio N-terminal de la proteína central del VHB para permitir la encapsidación viral29. El virus de la hepatitis D del ARN de un solo cadena de sentido negativo (HDV) expresa el antígeno HDVAg en dos isoformas; la pequeña isoforma ayuda en la replicación de ARN, y la isoforma grande facilita el ensamblaje viral. La replicación de ARN tiene lugar dentro del núcleo y requiere interacción B23 con HDVAg30,31. La infección por EL VHC provoca una regulación ascendente de B23, que interactúa principalmente con la pequeña isoforma del HDVAg y menos con la isoforma HDVAg grande. Las interacciones tienen lugar a través del pequeño dominio HDVAg NLS, a través del cual B23 se une y logra la acumulación nuclear. Tras la eliminación del sitio de enlace de HDV a B23, la replicación de ARN se vio afectada. Se demostró que HDVAg colocaliza con B23 y nucleolin en el nucleolus. Nucleolin fue descubierto para poseer propiedades transcripcionales como un represor32, revelando el nucleolus como un compartimiento para la regulación de la replicación de HDV. B23 también participa en la latencia del genoma del herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi (KSHV). Proteína latente KSHV - v-ciclina - con host CDK6 quinasa, fosforilatos B23 en Thr199, facilitando la interacción B23 con antígeno nuclear asociado a latencia33. El antígeno nuclear asociado a la latencia actúa para prevenir la replicación lítica viral. El agotamiento de B23 conduce a la reactivación de KSHV, revelando B23 como regulador de latencia KSHV. La función B23 en el ciclo de replicación del VIH-1 se caracteriza por la actividad de transporte nucleocitotoplasmático de Tat y Rev, y se desconoce si B23 puede inducir latencia durante la infección por el VIH. Actualmente se desconoce la participación de B23 en la replicación, encapidación y montaje del VIH-1.

La adaptación de este método a otros modelos de enfermedad requeriría mucho esfuerzo y tiempo para la generación de espinas dorsales infecciosas deficientes en proteínas expresadas en las líneas celulares apropiadas. La ventaja de esta columna vertebralHXB2 VIH-1 deficiente de Rev es la capacidad de examinar las mutaciones Rev-NoLS en presencia de toda la columna vertebral viral, factores infecciosos virales y factores de huésped involucrados en el ciclo de replicación del VIH-1. Otros estudios han examinado la función nucleolar Rev en ausencia del sistema infeccioso completo vih-1. La caracterización exhaustiva de las vías infecciosas y de enfermedades debe incluir entornos representativos que apoyen el curso natural de la progresión de la enfermedad. Se realizaron dos tipos diferentes de análisis y se compararon en la capacidad de identificar factores nucleolares. En la Tabla 1 se enumeran los factores que permanecieron vinculados a WT Rev como resultado del análisis directo de espectrometría de masas de eluido de proteínas. Este análisis produjo varios factores conocidos de HIV-1 Rev. Este método directo se comparó con otro proceso que implica la extracción de proteínas separadas dentro de geles SDS-PAGE y análisis de espectrometría de masas de tales proteínas. Este segundo método produjo una variedad de factores conocidos y potenciales que están unidos al complejo proteico Rev pero carecieron de las siguientes proteínas previamente identificadas en la Tabla1: partícula de reconocimiento de señal 14 kDa, iniciación de traducción eucariota factor 4B, proteína ribosomal L22, pequeña caja de ARN nucleolar C/D 58B y dominio CCHC de dedo de zinc que contiene 11. En última instancia, el método superior elegido para los análisis de espectrometría de masas en este protocolo implicó la extracción de péptidos de geles SDS-PAGE. El primer método directo incluía un búfer de muestra 2x en el eluido sin azul bromofenol; los componentes restantes del tampón de muestra 2x podrían interferir con el tratamiento completo de la trippsina y podrían producir péptidos procesados incompletamente para el análisis de espectrometría de masas. El segundo método indirecto fue capaz de purificar los péptidos tratados con trippsina de posibles contaminantes de SDS-PAGE.

Los métodos de preparación de espectrometría de masas descritos aquí podrían utilizarse para la identificación de intervenciones terapéuticas para erradicar la infección por VIH-1 a través de la focalización de Rev. Todas las mutaciones Delemientes y Rev-NoLS de un solo punto podrían ser examinadas actividad dominante negativa y utilizada en el arresto de la función Rev. Las características negativas dominantes de interés para el detención funcional Rev son las siguientes: afinidad vinculante Rev/RRE; relocalización de núcleos WT Rev a través de la multimerización con mutantes Rev; afinidad con los factores celulares clave involucrados en el transporte y empalme del ARNm del VIH-1. Podría examinarse la multimerización de Rev que implique la coexpresión de mutaciones Rev-NoLS con WT Rev. Se espera que las mutaciones negativas dominantes en este modelo multimerizarcon con WT Rev y desplazar los patrones nucleolares hacia el núcleo y el citoplasma, lo que conduce a un arresto funcional de Rev. La espectrometría de masas podría utilizarse para identificar la pérdida de factores celulares clave involucrados en el empalme y transporte del ARNM VIH-1. La identificación de las interacciones faltantes con WT Rev como resultado de la coexpresión con mutaciones Rrev-NoLS dominantes-negativas revelaría la participación de vías específicas de nucleolares en la patogénesis del VIH-1. Alternativamente, las partículas virales de HIV-1NL4-3 generadas en el fondo de las mutaciones Rev-NoLS podrían ser investigadas para todos los factores celulares empaquetados. Los factores celulares y virales empaquetados dentro de las partículas virales pueden identificarse aún más a través de espectrometría de masas. Esto revelaría la presencia de factores nucleolares dentro de las partículas virales y el papel de los factores nucleolares identificados en la infección viral. Los métodos descritos son aplicables a otros modelos virales y de enfermedades para la identificación y caracterización de vías poco estudiadas. Esto permitiría el desarrollo de intervenciones terapéuticas contra enfermedades mediante las cuales se disponga de tratamientos limitados.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores reconocen a la Dra. Barbara K. Felber y al Dr. George N. Pavlakis por la cultura adherente hlfB proporcionada por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) Programa de Investigación y Reactivo de Referencia sobre el SIDA, División del SIDA, Instituto Nacional de Alergia según la Alergia y Infeccioso Enfermedades (NIAID), NIH. Los autores también reconocen las fuentes financieras proporcionadas por los NIH, las Subvenciones AI042552 y AI029329.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Fisher Chemical A38S-212
Acetonitrile Fisher Chemical A955-500
Acrylamide:Bisacrylamide BioRad 1610158
Ammonium bicarbonate Fisher Chemical A643-500
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich 7727-54-0
ANTI-Flag M2 affinity gel Sigma-Aldrich A2220
anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG Sigma-Aldrich F3165
BioMax MS film Carestream 8294985
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL Bio-Rad 5000006
B23 mouse monoclonal IgG Santa Cruz Biotechnologies sc-47725
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Carnation non-fat powdered milk Nestle N/A
Cell scraper ThermoFisher Scientific 179693PK
C18IonKey nanoTile column Waters 186003763
Corning 100-mm TC-treated culture dishes Fisher Scientific 08-772-22
Dithiothreitol Thermo Scientific J1539714
1 x DPBS Corning 21-030-CVRS
ECL Estern blotting substrate Pierce 32106
Ethanol, 200 proof Fisher Chemical A409-4
FBS Gibco 16000044
Formic Acid Fisher Chemical A117-50
GelCode blue stain reagent ThermoFisher 24590
Glycerol Fisher Chemical 56-81-5
goat-anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz Biotechnologies sc-2005
Iodoacetamide ACROS Organics 122270050
KimWipe delicate task wiper Kimberly Clark Professional 34120
L-glutamine Gibco 25030081
Methanol Fisher Chemical 67-56-1
NanoAcuity UPLC Waters N/A
Pierce Silver Stain Kit Thermo Scientific 24600df
15-mL Polypropylene conical tube Falcon 352097
Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa Thermo Scientific 26616
Protease inhibitor cocktail Roche 4693132001
Purified BSA New England Biolabs B9001
PVDF  Western blotting membrane Roche 3010040001
Sodium Pyruvate Gibco 11360070
10 x TBS Fisher Bioreagents BP2471500
TEMED BioRad 1610880edu
Triton X-100 detergent solution BioRad 1610407
Trizaic source Waters N/A
trypsin-EDTA Corning 25-051-CIS
Tween 20 BioRad 1706531
Synapt G2 mass spectrometer Waters N/A
Whatman filter paper Tisch Scientific 10427813

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References

  1. Arizala, J. A. C., et al. Nucleolar Localization of HIV-1 Rev Is Required, Yet Insufficient for Production of Infectious Viral Particles. AIDS Research and Human Retroviruses. (2018).
  2. Li, Y. P. Protein B23 is an important human factor for the nucleolar localization of the human immunodeficiency virus protein Tat. Journal of Virology. 71, 4098-4102 (1997).
  3. Szebeni, A., et al. Nucleolar protein B23 stimulates nuclear import of the HIV-1 Rev protein and NLS-conjugated albumin. Biochemistry. 36, 3941-3949 (1997).
  4. Truant, R., Cullen, B. R. The arginine-rich domains present in human immunodeficiency virus type 1 Tat and Rev function as direct importin beta-dependent nuclear localization signals. Molecular and Cellular Biology. 19, 1210-1217 (1999).
  5. Eirin-Lopez, J. M., Frehlick, L. J., Ausio, J. Long-term evolution and functional diversification in the members of the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Genetics. 173, 1835-1850 (2006).
  6. Frehlick, L. J., Eirin-Lopez, J. M., Ausio, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. BioEssays. 29, 49-59 (2007).
  7. Okuwaki, M., Matsumoto, K., Tsujimoto, M., Nagata, K. Function of nucleophosmin/B23, a nucleolar acidic protein, as a histone chaperone. FEBS Letters. 506, 272-276 (2001).
  8. Szebeni, A., Olson, M. O. Nucleolar protein B23 has molecular chaperone activities. Protein Science. 8, 905-912 (1999).
  9. Hingorani, K., Szebeni, A., Olson, M. O. Mapping the functional domains of nucleolar protein B23. Journal of Biological Chemistry. 275, 24451-24457 (2000).
  10. Borer, R. A., Lehner, C. F., Eppenberger, H. M., Nigg, E. A. Major nucleolar proteins shuttle between nucleus and cytoplasm. Cell. 56, 379-390 (1989).
  11. Yun, J. P., et al. Nucleophosmin/B23 is a proliferate shuttle protein associated with nuclear matrix. Journal of Cellular Biochemistry. 90, 1140-1148 (2003).
  12. Savkur, R. S., Olson, M. O. Preferential cleavage in pre-ribosomal RNA byprotein B23 endoribonuclease. Nucleic Acids Research. 26, 4508-4515 (1998).
  13. Herrera, J. E., Savkur, R., Olson, M. O. The ribonuclease activity of nucleolar protein B23. Nucleic Acids Research. 23, 3974-3979 (1995).
  14. Grisendi, S., et al. Role of nucleophosmin in embryonic development and tumorigenesis. Nature. 437, 147-153 (2005).
  15. Itahana, K., et al. Tumor suppressor ARF degrades B23, a nucleolar protein involved in ribosome biogenesis and cell proliferation. Molecular Cell. 12, 1151-1164 (2003).
  16. Ye, K. Nucleophosmin/B23, a multifunctional protein that can regulate apoptosis. Cancer Biology & Therapy. 4, 918-923 (2005).
  17. Kuo, M. L., den Besten, W., Bertwistle, D., Roussel, M. F., Sherr, C. J. N-terminal polyubiquitination and degradation of the Arf tumor suppressor. Genes & Development. 18, 1862-1874 (2004).
  18. Kuo, M. L., den Besten, W., Thomas, M. C., Sherr, C. J. Arf-induced turnover of the nucleolar nucleophosmin-associated SUMO-2/3 protease Senp3. Cell Cycle. 7, 3378-3387 (2008).
  19. Horn, H. F., Vousden, K. H. Cancer: guarding the guardian. Nature. 427, 110-111 (2004).
  20. Grisendi, S., Mecucci, C., Falini, B., Pandolfi, P. P. Nucleophosmin and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 493-505 (2006).
  21. Dingwall, C., et al. Nucleoplasmin cDNA sequence reveals polyglutamic acid tracts and a cluster of sequences homologous to putative nuclear localization signals. The EMBO Journal. 6, 69-74 (1987).
  22. Fankhauser, C., Izaurralde, E., Adachi, Y., Wingfield, P., Laemmli, U. K. Specific complex of human immunodeficiency virus type 1 rev and nucleolar B23 proteins: dissociation by the Rev response element. Molecular and Cellular Biology. 11, 2567-2575 (1991).
  23. Valdez, B. C., et al. Identification of the nuclear and nucleolar localization signals of the protein p120. Interaction with translocation protein B23. Journal of Biological Chemistry. 269, 23776-23783 (1994).
  24. Li, Y. P., Busch, R. K., Valdez, B. C., Busch, H. C23 interacts with B23, a putative nucleolar-localization-signal-binding protein. European Journal of Biochemistry/FEBS. 237, 153-158 (1996).
  25. Adachi, Y., Copeland, T. D., Hatanaka, M., Oroszlan, S. Nucleolar targeting signal of Rex protein of human T-cell leukemia virus type I specifically binds to nucleolar shuttle protein B-23. Journal of Biological Chemistry. 268, 13930-13934 (1993).
  26. Szebeni, A., Herrera, J. E., Olson, M. O. Interaction of nucleolar protein B23 with peptides related to nuclear localization signals. Biochemistry. 34, 8037-8042 (1995).
  27. Tsuda, Y., et al. Nucleolar protein B23 interacts with Japanese encephalitis virus core protein and participates in viral replication. Microbiology and Immunology. 50, 225-234 (2006).
  28. Ning, B., Shih, C. Nucleolar localization of human hepatitis B virus capsid protein. Journal of Virology. 78, 13653-13668 (2004).
  29. Lee, S. J., Shim, H. Y., Hsieh, A., Min, J. Y., Jung, G. Hepatitis B virus core interacts with the host cell nucleolar protein, nucleophosmin 1. Journal of Microbiology. 47, 746-752 (2009).
  30. Huang, W. H., Yung, B. Y., Syu, W. J., Lee, Y. H. The nucleolar phosphoprotein B23 interacts with hepatitis delta antigens and modulates the hepatitis delta virus RNA replication. Journal of Biological Chemistry. 276, 25166-25175 (2001).
  31. Li, Y. J., Macnaughton, T., Gao, L., Lai, M. M. RNA-templated replication of hepatitis delta virus: genomic and antigenomic RNAs associate with different nuclear bodies. Journal of Virology. 80, 6478-6486 (2006).
  32. Yang, T. H., et al. Purification and characterization of nucleolin and its identification as a transcription repressor. Molecular and Cellular Biology. 14, 6068-6074 (1994).
  33. Sarek, G., et al. Nucleophosmin phosphorylation by v-cyclin-CDK6 controls KSHV latency. PLoS Pathogens. 6, 1000818 (2010).
Identificación de factores nucleolares durante la replicación del VIH-1 a través de la inmunoprecipitación de rev y la espectrometría de masas
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Arizala, J. A. C., Chomchan, P., Li, H., Moore, R., Ge, H., Ouellet, D. L., Rossi, J. J. Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (148), e59329, doi:10.3791/59329 (2019).More

Arizala, J. A. C., Chomchan, P., Li, H., Moore, R., Ge, H., Ouellet, D. L., Rossi, J. J. Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (148), e59329, doi:10.3791/59329 (2019).

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