Summary
体外受精は、ラボ集団を維持し、下流アプリケーション用に同期胚を生成するために、様々なモデル生物と一般的に使用される技術です。ここでは、メキシコのテトラ魚、アスティアナックスメキシコの異なる集団のためにこの技術を実装するプロトコルを提示します。
Abstract
アスティアナックス・メキシカヌスは、生物科学の様々な研究分野のモデル生物として出現しています。このテレオスト魚種の最近の成功の一部は、それが相互不妊洞窟と川に住む人口を所有していることである。これは、これらの集団の異なる環境への適応中に固定された遺伝的形質の遺伝的マッピングを可能にする。この種はラボで維持され、飼育することができますが、昼間に胚を得て、株間にハイブリッド胚を作ることは困難です。体外受精(IVF)は、実験室で動物を正常かつ繰り返し繁殖させるために、様々な異なるモデル生物と共に使用されてきた。このプロトコルでは、水温の変化と相まって異なる光サイクルにA.メキシコを順応させることによって、繁殖サイクルを1日の選択した時間にシフトする方法を示す。その後、適切な親魚を同定し、オスとメスから健康なゲームを採取し、IVFを用いて生存可能な子孫を生み出す方法を示す。これにより、遺伝子構成体の注入や発達解析などの関連する手順が通常の勤務時間中に発生します。さらに、この技術は、洞窟と表面に住む集団との間にハイブリッドを作成し、それによって異なる環境へのプチピック適応の遺伝的基礎の研究を可能にするために使用することができる。
Introduction
近年、アスティアナックス・メキシカヌスは、発生生物学、進化生物学、行動生物学、生理学1、2、3、4などの異なる分野のモデル生物となっています。.このシステムのユニークさは、非常に異なる環境に適応しているいくつかの形態を有するこの種から来ています。表面の住居モルフォタイプは、生物多様性が高く、魚の食料源が豊富な川に住んでいます。対照的に、A.メキシコの洞窟形態、洞窟魚は、生物多様性、食料源、および酸素が大幅に減少する洞窟に住んでいます1.洞窟魚は、目や色素沈着の不在、インスリン抵抗性、および脂肪2、3、4を保存する能力などの様々な表現型の表面魚とは異なります。しかし、表面の魚や洞窟魚はまだ同じ種に属し、したがって、相互不妊です。
両方の形態タイプについて、実験室条件5、6の下で定期的なメンテナンスおよび繁殖を可能にする一連の条件が定義されている。しかし、遺伝子改変、適切な胚発生研究、ハイブリッドの作成は、いくつかの理由から依然として困難です。A. メキシコ人は、主に夜間に産卵し、遺伝的構造の注入や初期胚発生過程のモニタリングなど、初期胚の初期段階でのその後の実験には不便である。さらに、表面と洞窟のハイブリッドの生成は、洞窟の形態が最終的に生存可能な卵の生産に影響を与える変更された概日リズム7を持っているので、自然な産卵を使用して困難です。成功した、まだ侵襲的な、IVF手順は、他のアスティアナックス種のために記載されており、そこでは、ゲームの産生および産卵行動がホルモン注射8、9を用いてプライミングされた。侵襲性の低いIVF手順(すなわち、ホルモン製剤の注入なしに手動産卵からゲームを得る)が記載されているが、A.メキシコの洞窟と表面形態の間の産卵サイクルの違いを考慮していない。 6.
ゼブラフィッシュのような他の魚モデル生物は、上記の障害が正常に解決されたので、遺伝的に遺伝子改変し、胚レベルで研究することができます。標準化された繁殖技術の実装、体外受精、および精子凍結保存は、すべてゼブラフィッシュを前方に押し出し、生物科学におけるモデルの使用を固めた10。したがって、これらの技術をA.メキシコに拡張することは、モデルシステムとしてさらに強化される。
ここでは、A.メキシコ人をよりアクセスしやすくするのに役立つ IVF の詳細なプロトコルを紹介します。ホルモン製剤を注入することなく日中に生存可能な卵巣を得られるように、魚の光サイクルを昼間から夜間にシフトできる繁殖セットアップを紹介します。その後、IVFに使用される卵巣とミルトを取得する方法の詳細な説明を提供します。この方法は、通常の労働時間中に胚の生産を可能にし、自然産卵からの胚を使用するよりも、さらに下流のアプリケーションをより実現可能にします。
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Protocol
ここに記載されているすべての方法は、スタワーズ医学研究所の機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. 光サイクル操作
- 不透明で完全に囲まれた(光保護)、複数のタンク列を含むフロースルー養殖システム内に魚のタンクを設定します(図1)。
注:図1に示すように、フロースルーシステムは、システム水を使用して各タンクのバックスタンドパイプを通して廃棄物を洗い流し、衛生排水管に注がれるサンプに流れ込みます。この実験では、点滴エミッタを介して1時間あたり1ガロン(US)の水交換レートを使用した。 - プライミングプロセス中に手動で温度を変更するために使用される独立した加熱要素を持つ各タンクの温度を維持します。
- 個々の行を設定して、それぞれに個別のフォトピリオドを有効にします。光が入ったり逃げたりするのを防ぐために、閉じることができる各行にドアを取り付けます。
注:自動コントローラは、魚への最も少ない妨害ですべての光周期の操作を可能にすることができます。 - 暗い時間帯にアクセスするための赤い作業灯と停電カーテンをラックに装備します。
2. フォトピリオドの調整とゲームコレクション用の魚のプライミング
- 一般的なシステムラックから所望の魚(図2a)を取り出し、プライミングの14日前に光周期の調整を可能にするために、繁殖ラックに置きます。
注:これは魚が新しい環境に順応することを可能にします。 - この期間中は、水生加熱システムを使用して22.8 °C(73 °F)で魚を保管してください。通常の光周期は、午前6時から午後8時まで、午後8時から午前6時までです。ライト サイクル ラックの場合は、ラック内のライトに電力を与えるタイマーを調整して、光周期を午後 10 時から午後 12 時、午後 12 時から午後 10 時にシフトします。
注:男性と女性は、自然なプライミング動作が行われることを可能にするために、同じタンクに収容されています。産卵はタンク内で行われるかもしれませんが、ゲームテスはステージ11で放出されるので、魚は体外受精に使用することができます。 - 魚が順応したら、ステップ2.3.1から2.3.5に記載されているように、5を産卵するための動物のプライミングを開始します。
注: この手順には合計で 6 日間かかります。この時間をかけて、インストールされた水生加熱システムを使用してova生産をプライムに温度を変更します。50W水生ヒーター(材料の表を参照)を使用して、各ステップでプロトコルで与えられた温度(ヒーターのスケールは華氏)に直接ヒーターを設定します。タンクの大きさや水の流量に応じて、温度調整の時間が異なる場合があります。この実験では、正午に温度を調整し、温度平衡は次の18時間を引き継いだ。- 1日目に、温度を22.8 °C(73 °F)から24.4 °C(76°F)に上げます。
- 2日目に、温度を24.4 °C(76 °F)から26.1 °C(79°F)に上げます。
- 3日目と4日目は、26.1 °C(79°F)の温度を保ちます。魚は日中に産卵する準備ができて、IVFを行うことができます。
注:個々の魚に応じて、雌は3日目と4日目に産卵することができます。私たちは、ovaコレクションの成功に応じて、3日目および/または4日目にovaを取得しようとすることをお勧めします。 - 5日目に、温度を26.1 °C(79 °F)から24.4 °C(76°F)に下げます。
- 6日目に、温度を24.4 °C(76 °F)から22.8 °C(73°F)に下げます。
注:この温度サイクルを繰り返す前に、7日間のギャップを提供します。これは、このシフト光サイクルに調整するために魚が必要な全体的な時間を短縮するので、この光周期で魚を維持し続けることをお勧めします.
3. 女性のゲームコレクション
- まず、湿ったティッシュをペトリ皿の蓋に挿入し、皿を閉じて加湿室を作り、採取プロセス中に卵巣が乾燥するのを防ぐことから始めます。
- 次に、コレクション用の女性を選択します。大きく突出した腹部を持つ重い魚は、おそらくこの手順のための最良の選択になります(図2a)。
注:成人A.メキシコの男性と女性を区別するために、綿ボール法を用いて12. - 冷たい水を使用して女性を固定し、湿ったスポンジ動物ホルダーの上に上の位置に彼女を置きます。少なくとも30sのために4°Cシステムの水に魚を置くことによって、または魚が固定されるまでそうしてください(すなわち、ギルの動きの損失は、詳細については、ロスとロス13を参照してください)。
注:迅速に作業し、手順が完了するまで魚を温めないようにしてください。これには、定期的に指の手袋の先端を冷たい水に浸したり、補足麻酔を提供したりすることが含まれます。他の麻酔法(例えば、MS-22213)も同様に使用されてもよい。スタワーズ医学研究所のIACUCガイドラインの下で、ovaの手動収集は、完全な麻酔を必要としない非侵襲的な手順と考えられています(例えば、MS-222を通じて)。 - 一度配置, 水との接触として繊細な組織の拭き取りで魚の腹部側をブロットすると、卵巣が活性化します.
- 親指と人差し指の間に女性を保持します。指をわずかに転がしながら、泌尿生殖器の開口部の方向にコエロミック空洞の側面に対して穏やかに絞ります。使い捨てへらを使用して発現した卵子を収集します。
- これらのovaを加湿したペトリ皿に移します。
注:特定の親子データが必要ない場合は、ovaのいくつかのクラッチを同じ皿に組み合わせてもよい。ovaは24°Cで保存することができ、回収後30〜60分以内にIVFに使用する場合に最適です。 - 回収後、魚をシステム水で満たされた回収タンクにそっと戻します。
注:必要に応じて、将来のovaコレクションのために暗いキャビネットタンクに魚を戻します。
4. 男性のゲームコレクション
- コレクション用の男性を選択します。
注:男性のゲームの品質の外側に目に見える兆候はありません。しかし、魚は、この手順で使用する前に外観に健康に見える必要があります。成人A.メキシコの男性と女性を区別するために、綿球法を用いて12. - 冷たい水を使用して男性を固定し、湿ったスポンジ動物ホルダーの上にスパンツの位置に置きます。少なくとも30秒間、または魚が固定されるまで4°C系水に魚を置くことによって固定化する(すなわち、ギルの動きの損失は、詳細については、ロスとロス13を参照してください)。
注:迅速に作業し、手順が完了するまで魚を温めないようにしてください。これには、定期的に指の手袋の先端を冷たい水に浸したり、補足麻酔を提供したりすることが含まれます。他の麻酔法(例えば、MS-22213)もここで使用されてもよい。スタワーズ医学研究所のIACUCガイドラインの下では、精子の手動収集は、完全な麻酔を必要としない非侵襲的な手順と考えられています(例えば、MS-222を通じて)。 - 水との接触がミルトを活性化するように繊細なティッシュワイプで魚の腹部側をブロット。
- 毛細管の端を泌尿生殖器の開口部にそっと置きます。
- 親指と人差し指で魚の側面に穏やかな圧力を加えることによってミルトを追い出します。エラに遠位を開始, 泌尿生殖器の開口部に向かって移動.
- 毛細管の端にミルトを収集します。穏やかな吸引は、吸引器チューブの使用によって必要な場合があります。ミルトで排出される可能性のある便は避けてください。
- ミルトを空の1.5mL遠心分離管に分配し、精子エクステンダーE400の2倍の体積で希釈する(材料の表を参照)。氷の上にいろ
注:特定の親子データが必要ない場合は、複数の男性からのミルトが一緒にプールされることがあります。このステップは、ミルトの作業時間を数時間延長するために使用することができますが、即時受精のために必要とされません。 - 回収後、魚をシステム水で満たされた回収タンクにそっと戻します。
注:必要に応じて、将来の精子収集のために暗いキャビネットタンクに魚を戻します。
5. 体外受精
- 各ストックのための新しいピペットを使用して、ミルトで精子として受精する前にチューブの側面をピペッティングおよび/または攪拌することによって精子を混合し、時間をかけてE400溶液に沈着することができます。
- ミルトまたは拡張ミルト溶液を新たに採取した卵子に分配します。
- すぐに受精のための精子と卵を活性化するためにクラッチにシステム水の1 mLを追加します。皿の内容物を混ぜたり攪拌したりすることを避け、受精のために2分を可能にする。
注:混合と攪拌は、受精率を大幅に低下させ、したがって、14を避けるべきです。 - E2胚メディアを追加して、2/3rdの完全な皿を埋めます。
注:後続の手順に応じて、胚はすぐに使用することができる(例えば、15より前に記載された遺伝的構成要素の注射のために)または胚は、5 dpfに達するまで23°CでE2胚培地でインキュベートすることができる。この時点で、システム水を使用して、主な再循環ハウジングシステムに胚を転送します。
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Representative Results
ここで説明するプロトコルは、主に以前に公開されたプロトコル6に基づいています。しかし、A.メキシコ人は夜間に産卵するので、労働時間に依存しない光周期を変えることができる魚の飼育用のハウジングラックを設計しました(図1)。魚の光サイクルは、3列のタンクを含む完全に囲まれたフロースルー養殖システム内で変更されます(図1)。各タンクには、プライミングプロセス中に手動で温度を上げるのに使用される独立した加熱要素が含まれています。個々の棚は別々のフォトピリオドに置くことができ、光が入ったり逃げたりするのを防ぐために閉じることができる。すべての光周期はライトサイクルラックの側面に置かれる自動化されたコントローラーによって操作することができる。暗い時間帯にアクセスするために、ラックには赤い作業灯と停電カーテンが装備されています。A. メキシコ産は、1日あたり1.5 °Cの増分で23から26 °Cの温度の上昇後に発生します 16.暗いキャビネットでこれを実現するために、各タンクに水中水族館ヒーターを使用しました(図1)。
A. メキシコでのIVF手順の成功の重要な要因は、収集された卵巣の品質です。グラビッド、大きく突出した腹部を持つ雌魚は、透明で見た目でも見える生存可能な卵巣を放出する可能性が最も高い(図2a-d)。このような卵巣に採取したミルトを加えると、通常20〜30分以内に受精胚が発症する(図2e)。生存可能な受精胚は、発達サイクルの1つの細胞段階に入る前にわずかに半透明になり、未受精卵はより不均一で不透明に見える(図2e)。得られた胚は、ZIRC E2胚培中のペトリ皿に保持され、14/10光/暗いサイクルで23°Cでインキュベートされる。胚は、その後、飼育のための受精後5日で主要な再循環ハウジングシステムに移されます。
この技術の重要性を示すために,眼の大きさや体の色素沈着などの特定の形質に対するハイブリッドの表現型が遺伝的基盤の解読にどのように役立つかを示す.洞窟魚は明らかに目の大きさや体の色素沈着の表面の魚とは異なります。これらの形質の遺伝的基礎を理解するために、表面と洞窟魚(F0)を横断し、IVFを用いてハイブリッドF1およびF2集団を生成し、得られた意味線変動を観察した(図3)。目の大きさは、目の存在が部分的に支配的な形質であることを示すF1世代では小さい(図3)。表面洞窟F2ハイブリッドでは、広範囲の目の大きさを得て、A.メキシコの目の大きさを制御する複数の遺伝子座があることを示し、定量的形質となっています(図3)。もう一つの例は色素沈着です。表面と洞窟魚のF1ハイブリッドを観察すると、魚が完全に着色されているので、体の色素沈着が支配的な形質であると結論付けることができます(図3)。F2世代では、体色素沈着の変動が再び定量的形質を指し出す。この型分法データとシーケンシングデータの組み合わせは、これらの型を担う根本的な遺伝的遺伝子座を明らかにすることができます。これらのF2集団は、様々な形質の遺伝的基礎を理解するための良いリソースであり、そのような集団は、これらの形質17、18、19を研究するために以前に使用されてきた。標準化されたIVF技術は、ハイブリッドの生成を大幅に合理化し、そのような形質を制御する遺伝子座の遺伝的マッピングを可能にし、特定の表現型がいくつかの生息地でどのように不利であり、他の生息地で適応的であるかを理解するのに役立つ。
図 1: 昼/夜のサイクルをシフトするラックの設計A. メキシコ人.(a) このラックシステムの一般的なセットアップにより、光周期操作が可能となり、ドアが閉まり、棚のライトがオフになっている日中の夜間のシミュレーションが可能になります。(b) 卵子の成熟を刺激するために魚をプライミングすることは、個別に調整することができる個々のタンクに設置された水中ヒーター(材料の表を参照)を使用することによって達成される(赤い矢印)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2:卵巣コレクションに適した雌の例と生存可能および生存不可能な卵巣の代表的な図.(a) グラビッド、大きく突出した腹部を持つ雌魚は、合理化された形の腹部を持つ(b)メスよりも手動ovaコレクションに適しています。(c) 生存可能なova(すなわち、受精時に生存可能な胚を産生するova)は、その明確な、さらには外観によって同定することができるが、生存不可能な卵巣(すなわち、受精時に生存可能な胚を産生しない)は、(d)に示すように、曇り、不均一を持っている。外観。(e) 受精に成功すると、生存可能な胚はより半透明になり、未受精卵(赤い矢印)がゆっくりと崩壊する一方で、1つの細胞段階に入る。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: 眼の大きさと体色素質の遺伝子解析ペアレント(F0)表面魚(左上)と洞窟魚(右上)、F1ハイブリッド(2列目)とF2ハイブリッドの写真を示す血統。F1魚は中間眼の大きさを持ち、完全に着色され、F2魚は眼の大きさと色素沈着という2つの形態学的形質の広範な変化を示す。この図の基になるすべての元のデータは、http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1365のスタワーズ元データリポジトリからアクセスできます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
IVFはゼブラフィッシュのような多くの異なるモデル生物のための標準化された方法であるが、A.メキシコのための既存のプロトコルは、この種が自然に夜間6の間に生み出することを考慮に入れていない。洞窟魚と表面魚が概日リズムで大きく異なることを考えると、卵子の成熟周期も洞窟と表面の形態の間で異なります。表面A.メキシコのステージング温度と時間はよく研究されていますが、洞窟魚は産卵行動と成熟サイクルで異なる場合があります。したがって、ハイブリッド生産の従来の方法は、これらの魚の産卵時間の変化をもたらすA.メキシコ7の洞窟形態の概日リズムの喪失のために非常に挑戦的で不確実である。光周期をシフトすることにより、2つの形態の間の希少な自然発生事象に頼ることなく、時間固有のハイブリッド胚を提供することができる。洞窟と表面の魚を別々に保つことはまた、積極的な表面モーフが繁殖に悪影響を及ぼすのを防ぎます。
この方法では、ovaの品質の変動など、いくつかの制限があります。成熟した卵子を持つ雌(表面または洞窟魚)の同定は些細なものではなく、魚の行動を注意深く観察する必要があります。一般的に、産卵の準備ができている重力の女性は、より大きな腹部を持っており、底部タンク表面または胚コレクショントラップ20に対して繰り返しブラシをかけます。
我々は、精子の質が一日/夜のサイクル全体を通して一貫していることを観察した。IVFの成功の重要なステップ(受精胚の生成の面で成功)は、良好な品質、生存可能な卵巣を得ることです。したがって、自然に産卵しようとしている魚から卵子を採取することは非常に重要です(図2a)。卵子が採取されると、解剖顕微鏡下で観察して品質を調べることができます。しかし、夜間に生存可能な卵子のコレクションは、研究者にとって不便で挑戦的です。ここで示すセットアップは、卵巣の成熟サイクルのシフトを可能にするので、IVFは通常の勤務時間中に下流アプリケーション用の同期胚を生成するために使用することができます。
ミルトの凍結保存の進歩(例えば、ゼブラフィッシュ21に記載されているように)により、IVFは、新興モデルシステムA.メキシコの遺伝的線を確立し、維持するための強力なツールとなる。遺伝子改変15およびモルフォリノベースのノックダウン17の方法と組み合わせることで、これらの手順は、異なる適応の遺伝的および発達的基盤を研究するための方法論的プラットフォームを提供する。A.メキシコの生息地.
要約すると、ここで提示されるプロトコルは、遺伝的構造の注入や初期胚性表現型の研究など、他の下流アプリケーションに対するA.メキシコの同期胚の産生を可能にする。プロトコルの主な強みは、QTL(定量形質遺伝子座)分析を通じて表面魚と洞窟魚の間の地形の違いを遺伝的にマッピングするために使用できる表面洞窟ハイブリッドの効率的な生産を可能にすることです。一緒に、IVFのための昼間に生存可能な卵巣を得ることは、生物科学の異なる分野における様々な将来の研究のために有益である強力な技術である。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
著者たちは、フィリップ・ノゲラとキンバリー・ブラントのビデオ制作に対する支援に感謝したいと思います。著者らはまた、動物飼育のためのスタワーズ研究所の水生チーム全体を認めたいと思います。この仕事は、DPBとNRへの機関資金によって支えられた。NRはエドワード・マリンクロッド財団とJDRFの支援を受けました。RPは、ドイツのフォルシュンゲミンシャフト(PE 2807/1-1)からの助成金によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Centrifuge Tube | Eppendorf | #22364111 | |
| 100 mm Petri Dishes | VWR International | #25384-302 | |
| Aspirator Tube | Drummond | #2-000-000 | |
| Calibrated 1-5 µL Capillary Tubes | Drummond | #2-000-001 | |
| Dispolable Spatulas | VWR International | #80081-188 | |
| HMA-50S 50W Aquatic Heaters | Finnex | HMA-50S | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | #3123000063 | |
| P1000 Pipette Tips | Thermo Scientific | #2079E | |
| Sanyo MIR-554 incubator | Panasonic Health Care | MIR-554-PA | |
| Sperm Extender E400 | 130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glucose, 30 mM HEPES Adjust to pH 7.9 with 5M KOH and filter sterilize. Solution can be stored at 4 ?C for up to 6 months. |
||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| System Water | Deionized water supplemented with Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] to reach a specific conductance of 800 µS/cm. Water quality parameters are maintained within safe limits (Upper limit of total ammonia nitrogen range, 1 mg/L; upper limit of nitrite range, 0.5 mg/L; upper limit of nitrate range, 60 mg/L; temperature, 22 °C; pH, 7.65; dissolved oxygen 100 %) | ||
| Tissue Wipes | Kimberly-Clark Professional | #21905-026 | |
| ZIRC E2 Embryo Media | 15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 µM KH2PO4, 50 µM Na2HPO4, 1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. Adjust pH to 7.2 to 7.4 using 2 N hydrochloric acid. Filter sterilize. Stored at room temperature for a maximum of two weeks. |
References
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