Summary
体外受精是一种常用技术,具有多种模型生物体,用于维持实验室种群并生成用于下游应用的同步胚胎。在这里,我们提出一个协议,实现这种技术为墨西哥四分之一鱼,阿斯蒂亚纳斯墨西哥的不同种群。
Abstract
Astyanax墨西哥正在成为生物科学各种研究领域的典范。这种特约鱼类最近的成功部分,是它拥有不育洞穴和河流栖息的种群。这使得遗传特征的遗传图谱在适应这些种群的不同环境期间固定下来。虽然这个物种可以在实验室中维持和繁殖,但在白天获得胚胎并在菌株之间制造混合胚胎是具有挑战性的。体外受精(IVF)已与各种不同模型生物一起使用,在实验室中成功和反复繁殖动物。在这个协议中,我们展示了如何通过使A.mexicanus适应不同的光周期以及水温的变化,我们可以将繁殖周期转移到一天中选定的时间。随后,我们展示如何识别合适的亲鱼,从雄性与雌性收集健康的配子,并使用IVF产生可行的后代。这使得相关的程序,如注射遗传结构或发育分析发生在正常工作时间。此外,该技术还可用于在洞穴和地表居住种群之间创建杂交,从而能够研究表型适应不同环境的遗传基础。
Introduction
近年来,Astyanax墨西哥已成为不同领域的模型生物,如发育生物学,进化生物学,行为生物学和生理学1,2,3,4.这个系统的独特性来自这个物种有几个形态,已经适应了非常不同的环境。水面居住形态生活在河流中,那里有丰富的生物多样性和丰富的鱼类食物来源。相比之下,A.墨西哥的洞穴形态,洞穴鱼,生活在洞穴中,生物多样性,食物来源和氧气被急剧减少1。洞穴鱼不同于水面鱼类的各种表型,如没有眼睛和色素沉着,胰岛素抵抗,以及储存脂肪2,3,4的能力。然而,水面鱼类和洞穴鱼仍然属于同一物种,因此是杂交的。
对于这两种形态类型,已定义了一组条件,允许在实验室条件下进行常规维护和繁殖5、6 。然而,基因改造、适当的胚胎发育研究以及杂交物的创造仍然具有挑战性,原因有几个。A. 墨西哥主要在夜间产卵,这不方便后续早期胚胎阶段的实验,如注入基因结构或监测早期胚胎发育过程。此外,一代表面和洞穴杂交是具有挑战性的使用自然产卵,因为洞穴形态有一个改变的昼夜节律7,最终影响生产可行的ova。成功,但侵入性,IVF程序已被描述为其他Astyanax物种,其中Gamete生产和产卵行为是准备使用激素注射8,9。已描述过侵入性较低的IVF程序(即,在没有注射激素制剂的情况下从人工产卵中获得配子),但不考虑A.mexicanus的洞穴和表面形态之间的产卵周期差异 6.
其他鱼类模型生物,如斑马鱼,很容易进行基因改造和研究,因为上述障碍已经成功解决。标准化育种技术、体外受精和精子冷冻保存的实施,都推动了斑马鱼在生物科学中的应用。因此,将这些技术推广到A.墨西哥,将进一步加强它作为一个模型系统。
在这里,我们提出了一个IVF的详细协议,这将有助于使A.墨西哥更容易访问。我们将提出一个繁殖设置,使鱼的光循环从白天转移到夜间,以便在白天不注射激素制剂即可获得可行的卵子。然后,我们提供了如何获得用于IVF的卵子和奶的详细说明。与使用自然产卵的胚胎相比,该方法将使胚胎在正常工作时间内产生,并使进一步的下游应用更加可行。
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Protocol
这里描述的所有方法都已获得斯塔斯医学研究所的机构动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。
1. 光循环操作
- 在不透明、全封闭(光保护)的流水养殖系统中设置鱼缸(图1)。
注:如图 1所示,流通系统使用系统水将废物通过每个储罐的后立管冲洗,并流入排入卫生排水池的油底壳中。在这个实验中,通过滴灌器使用了每小时一加仑的水交换率。 - 使用用于在注油过程中手动更改温度的独立加热元件,保持每个储罐的温度。
- 以一种方式设置单独的行,以便在每个行中启用单独的光周期。在每行上安装可关闭的门,以防止光线进入或逸出。
注: 自动控制器可以操作所有光周期,对鱼的干扰最小。 - 为机架配备红色工作灯和遮光窗帘,以便在夜间使用。
2. 调整光周期和注鱼,用于游戏收集
- 从一般系统机架中取出所需的鱼(图2a),并放置在养殖架中,以便在注水前14天调整光周期。
注:这允许鱼适应新的环境。 - 在此期间,使用安装的水生加热系统将鱼保持在 22.8 °C (73 °F)。正常的拍摄时间是上午6时至下午8时,晚上8时至6时。对于光循环机架,通过调整为机架内灯光供电的定时器,将光周期移至晚上 10 点至晚上 12 点,在暗时将 12 点移到晚上 10 点。
注:男性和女性被安置在同一个水箱中,以便进行自然充注行为。虽然产卵可能在水箱中进行,但鱼仍可用于体外受精,因为配子在第11阶段释放。 - 一旦鱼适应,开始启动动物产卵5如步骤2.3.1至2.3.5所述。
注:此过程总共需要六天。在此期间,使用已安装的水生加热系统将温度更改为为卵子生产提供黄金。使用50W水族加热器(见材料表),将加热器直接设置为协议中每个步骤中给出的温度(加热器刻度以华氏度为单位)。根据水箱的大小和水的流过速率,温度调整时间可能会有所不同。在这个实验中,温度在中午被调整,温度平衡接管接下来的18小时。- 在第 1 天,将温度从 22.8 °C (73 °F) 提高到 24.4 °C (76 °F)。
- 在第 2 天,将温度从 24.4 °C (76 °F) 提高到 26.1 °C (79 °F)。
- 在第 3 天和第 4 天,将温度保持在 26.1 °C (79 °F)。鱼将在白天产卵,可以进行IVF。
注:根据个别鱼类的不同,雌鱼可以在第3天和/或第4天产卵。我们建议尝试在第 3 天和/或第 4 天获得 ova,具体取决于 ova 集合的成功。 - 在第 5 天,将温度从 26.1 °C (79 °F) 降至 24.4 °C (76 °F)。
- 在第 6 天,将温度从 24.4 °C (76 °F) 降至 22.8 °C (73 °F)。
注:在重复此温度周期之前提供 7 天的间隙。建议继续保持鱼在这个光周期,因为这将减少鱼所需的总时间,以适应这个转移的光周期。
3. 女性游戏系列
- 首先,将湿润的组织擦拭到培养皿盖中,然后关闭盘子,以创建一个加湿室,防止卵子在收集过程中变干。
- 接下来,选择一个女性进行收集。带大、突出腹部的肉鱼可能是这一手术的最佳选择(图2a)。
注:为了区分成年A.墨西哥的男性和女性,棉球法被使用12。 - 用冷水固定一只雌性,并将她置于湿润的海绵动物支架中。为此,将鱼放入 4°C 系统水中至少 30 s 或直到鱼固定(即减少刺运动,详情见 Ross 和 Ross13)。
注:快速工作,尽量避免使鱼变暖,直到程序完成。这可能包括定期将手指的戴手套的尖端浸入冷水中或提供补充麻醉。也可以使用其他麻醉方法(例如MS-22213)。根据Stowers医学研究所的IACUC指南,人工收集卵子被认为是一种非侵入性程序,不需要完全麻醉(例如,通过MS-222)。 - 定位后,用细腻的组织擦拭抹布抹布鱼的腹腔侧,当与水接触时,会导致卵子激活。
- 将女性放在拇指和食指之间。在微微滚动手指时,在泌尿生殖道开口的方向轻轻挤压到腔腔的侧侧。使用一次性铲子收集表达的 ova。
- 这些卵子转移到加湿的培养皿。
注:如果不需要特定的亲子数据,可以在同一个盘中组合几个 ova 离合器。卵子可储存在24°C,最好在收集后30-60分钟内用于IVF。 - 收集后,轻轻地将鱼返回到装满系统水的回收罐。
注:必要时将鱼放回暗柜水箱中,以便将来收集。
4. 雄性游戏系列
- 选择男性进行收藏。
注:男性野味品质没有外在可见的迹象。然而,在使用本过程中,鱼在外观上应显得健康。为了区分成年A.墨西哥的男性和女性,使用了棉球法12。 - 用冷水固定雄性,并将他置于湿润的海绵动物支架中。将鱼放入4°C系统水中至少30秒或直到鱼被固定(即,失去刺运动,见Ross和Ross13了解详情)。
注:快速工作,尽量避免使鱼变暖,直到程序完成。这可能包括定期将手指的戴手套的尖端浸入冷水中或提供补充麻醉。其他麻醉方法(例如,MS-22213)也可以在这里使用。根据Stowers医学研究所的IACUC指南,人工采集精子被认为是一种非侵入性程序,不需要完全麻醉(例如,通过MS-222)。 - 与水接触时,用细腻的组织擦拭鱼的腹侧,会激活鱼片。
- 轻轻地将毛细管的末端放在泌尿生殖器口处。
- 用拇指和食指对鱼的两侧施加温和的压力,以驱逐小鱼。开始远向刺,朝泌尿生殖器开口移动。
- 在毛细管的末端收集密尔。使用吸气管可能需要温和的吸力。避免任何可能与密尔特一起排出的粪便。
- 将 milt 放入空的 1.5 mL 离心管中,用两倍于精子扩展器 E400 的体积稀释(参见材料表)。保持冰上。
注:如果不需要特定的亲子关系数据,来自多个男性的Milt可以汇集在一起。此步骤可用于将密特的工作时间延长数小时,但不需要立即受精。 - 收集后,轻轻地将鱼返回到装满系统水的回收罐。
注:必要时将鱼放回暗柜水箱,以便将来采集精子。
5. 体外受精
- 对每种股票使用新的移液器,在受精前通过移液和/或搅拌管侧混合精子,因为在 milt 中的精子可以随着时间的推移在 E400 溶液中沉淀。
- 将 milt 或扩展的 milt 溶液放入新鲜收集的卵子中。
- 快速向离合器中加入 1 mL 的系统水,以激活精子和卵子进行受精。避免混合或搅拌菜内容物,让2分钟发生受精。
注:混合和搅拌大大降低了施肥率,因此应避免14。 - 添加 E2 胚胎介质以填充 2/3rd满的盘子。
注:根据后续程序,胚胎可以马上使用(例如,用于注射15日之前所述的遗传结构),或者胚胎可以在23°C的E2胚胎培养基中孵育,直到达到5 dpf。此时,使用系统水将胚胎转移到主循环住房系统。
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Representative Results
这里介绍的协议主要基于先前发布的协议6。然而,由于A.墨西哥人在夜间产卵,我们设计了一个鱼养殖房屋架,可以改变光周期,而不受工作时间的影响(图1)。鱼光循环在包含三排水箱的全封闭、流水养殖系统中改变(图1)。每个储罐都包含一个独立的加热元件,用于在注油过程中手动提高温度。单个搁板可以放在单独的光周期,可以关闭以防止光线进入或逸出。所有光周期都可以通过放置在光循环机架侧面的自动控制器进行操作。在黑暗时段使用时,机架配有红色工作灯和遮光窗帘。A. 墨西哥在温度从23-26°C升高后产卵,每天增加1.5°C16。为了在深色橱柜中实现这一点,我们在每个水箱中使用了潜水水族馆加热器(图1)。
在A.墨西哥成功IVF手术的关键因素是收集的卵子的质量。格拉维德,雌性鱼与大,突出的腹部最有可能释放可行的ova,这似乎清晰,甚至在外观(图2a-d)。将收集的milt添加到此类卵子中,通常在20-30分钟内产生受精胚胎(图2e)。活的受精胚胎在进入发育周期的一个细胞阶段之前会稍微变半透明,而未受精的卵子将显得更加不均匀和不透明(图2e)。产生的胚胎保存在ZIRC E2胚胎介质中的培养皿中,在14/10光/暗周期中以23°C孵育。然后,胚胎在受精后5天转移到主循环住房系统进行饲养。
为了证明该技术的重要性,我们展示了杂交种对特定特征(如眼睛大小和身体色素沉着)的表型如何有助于破译其遗传基础。洞穴鱼的眼睛大小和身体色素沉着明显不同于水面鱼类。为了理解这些特征的遗传基础,我们穿越了表面和洞穴鱼(F0),并使用IVF生成了混合F1和F2种群来观察获得的表型变异(图3)。在F1一代中,眼睛的大小较小,表明眼睛的存在是一个部分占主导地位的特征(图3)。在表面洞穴F2混合动力车中,我们获得了广泛的眼睛尺寸,表明在A.mexicanus中有多个控制眼睛大小的位点,使其成为一个定量特征(图3)。另一个例子是色素沉着。观察表面鱼和洞穴鱼的F1杂交,可以得出结论,身体色素沉着是一种主要特征,因为鱼是完全色素沉着(图3)。在F2一代中,身体色素沉着的变化再次指向一个定量特征。这种表型数据与测序数据的结合可以揭示导致这些表型的基本遗传位点。这些F2种群是了解各种特征遗传基础的良好资源,这些种群以前曾用于研究这些特征17、18、19。标准化的IVF技术可以大大简化杂交的生成,使控制这些特征的位点的基因映射,并帮助我们了解某些表型在某些生境中是如何不利的,在另一些生境中是如何适应性的。
图 1: 设计机架,以昼夜循环A.墨西哥。(a) 这个机架系统的一般设置允许光周期操作,模拟白天当门关闭和货架灯关闭的夜间时间。(b) 使用安装在单个储罐中的潜水加热器(见材料表)来刺激鱼的成熟(红色箭头)。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:适合女性的例子为ova收集和代表性的插图,可行的和不可行的ova。(a) 格拉维德,腹部大、突出的女性鱼比(b) 具有流线型腹部的雌性鱼更适合人工收集。(c) 活的卵子(即,在受精时产生活的胚胎)可以通过其清晰、均匀的外观来识别,而不可行的卵子(即,在受精时不产生活的胚胎),如 (d) 所示,具有多云、不均匀的外观。(e) 成功受精后,存活的胚胎会变得更透明,进入一个细胞阶段,而未受精的卵子(红箭)会慢慢腐烂。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:眼睛大小和身体色素沉着特征的遗传分析。血统显示图片的亲 (F0) 表面鱼 (左上) 和洞穴鱼 (右上), F1 混合动力车 (第二行) 和 F2 混合动力车.F1鱼具有中等眼睛大小,完全着色,而F2鱼在两种形态特征上表现出广泛差异:眼睛尺寸和色素沉着。此图所基于的所有原始数据均可从 http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1365 的 Stowers 原始数据存储库访问。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
虽然IVF是许多不同的模型生物,如斑马鱼的标准化方法,但A.墨西哥现有的协议没有考虑到这个物种在夜间自然产卵。鉴于洞穴鱼和表面鱼类的昼夜节律差异很大,洞穴和表面形态之间的成熟周期也不同。虽然A.墨西哥表面的分期温度和时间被仔细研究12,但洞穴鱼的产卵行为和成熟周期可能有所不同。因此,传统的杂交生产方法非常具有挑战性和不确定性,因为A.mexicanus7的洞穴形态中昼夜节律的丧失,导致这些鱼的产卵时间发生变化。通过改变光周期,我们可以提供特定时间的混合胚胎,而不必依赖两种形态之间的罕见自然产卵事件。保持洞穴和水面鱼分开也防止侵略性表面变形对繁殖产生不利影响。
此方法确实存在一些限制,例如 ova 质量的变化。识别雌性(表面或洞穴鱼)与成熟的卵子不是微不足道的,需要仔细观察鱼的行为。一般来说,准备产卵的肉体雌性有较大的腹部,会反复刷对底部的坦克表面或胚胎收集陷阱20。
我们观察到精子的质量在整个日/夜周期中是一致的。成功试管婴儿的关键步骤(在产生受精胚胎方面取得成功)是获得质量好、存活的卵子。因此,从即将自然产卵的鱼中收集卵子是非常重要的(图2a)。一旦收集卵子,可以在解剖显微镜下观察它们以检查质量。然而,在夜间收集可行的ova,对研究人员来说不方便和具有挑战性。我们在这里介绍的设置允许转移卵子的成熟周期,因此IVF可用于在正常工作时间为下游应用生成同步胚胎。
随着对密尔特的冷冻保存(例如,如斑马鱼21所述),IVF将成为建立和维持新兴模型系统A.mexicanus遗传线的有力工具。结合基因改造方法15和形态学敲除17,这些程序将提供研究适应不同基因和发育基础的方法平台栖息地在A.墨西哥。
总之,这里提出的协议将允许生产A.mexicanus的同步胚胎用于其他下游应用,如注入遗传结构或研究早期胚胎表型。该协议的主要优势是,它允许有效地生产表面洞穴杂交,可用于通过QTL(定量特征位点)分析,对表层鱼类和洞穴鱼之间的表型差异进行基因图谱。综合起来,在白天获得IVF的活的卵子是一种强大的技术,将有利于生物科学不同领域的各种未来研究。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者要感谢菲利普·诺格拉和金伯利·布兰德对视频制作的支持。作者还要感谢斯沃斯塔畜牧研究所的整个水产团队。这项工作得到了向DPB和NR提供的机构资助。NR得到了爱德华·马林克罗德基金会和JDRF的支持。RP得到了德国福森斯格明舍夫特(PE 2807/1-1)的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Centrifuge Tube | Eppendorf | #22364111 | |
| 100 mm Petri Dishes | VWR International | #25384-302 | |
| Aspirator Tube | Drummond | #2-000-000 | |
| Calibrated 1-5 µL Capillary Tubes | Drummond | #2-000-001 | |
| Dispolable Spatulas | VWR International | #80081-188 | |
| HMA-50S 50W Aquatic Heaters | Finnex | HMA-50S | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | #3123000063 | |
| P1000 Pipette Tips | Thermo Scientific | #2079E | |
| Sanyo MIR-554 incubator | Panasonic Health Care | MIR-554-PA | |
| Sperm Extender E400 | 130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glucose, 30 mM HEPES Adjust to pH 7.9 with 5M KOH and filter sterilize. Solution can be stored at 4 ?C for up to 6 months. |
||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| System Water | Deionized water supplemented with Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] to reach a specific conductance of 800 µS/cm. Water quality parameters are maintained within safe limits (Upper limit of total ammonia nitrogen range, 1 mg/L; upper limit of nitrite range, 0.5 mg/L; upper limit of nitrate range, 60 mg/L; temperature, 22 °C; pH, 7.65; dissolved oxygen 100 %) | ||
| Tissue Wipes | Kimberly-Clark Professional | #21905-026 | |
| ZIRC E2 Embryo Media | 15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 µM KH2PO4, 50 µM Na2HPO4, 1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. Adjust pH to 7.2 to 7.4 using 2 N hydrochloric acid. Filter sterilize. Stored at room temperature for a maximum of two weeks. |
References
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