Summary
In vitro fertilisatie is een veelgebruikte techniek met een verscheidenheid aan model organismen om labpopulaties te behouden en gesynchroniseerde embryo's te produceren voor downstreamtoepassingen. Hier presenteren we een protocol dat deze techniek implementeert voor verschillende populaties van de Mexicaanse Tetra vissen, Astyanax mexicanus.
Abstract
Astyanax mexicanus is ontstaan als modelorganisme voor een verscheidenheid aan onderzoeksgebieden in de biologische wetenschap. Een deel van het recente succes van deze schip vissoorten is dat het een verstoorde grot en rivier bewoners bezit. Dit maakt de genetische mapping mogelijk van erfelijke eigenschappen die zijn vastgesteld tijdens de aanpassing aan de verschillende omgevingen van deze populaties. Hoewel deze soort in het Lab kan worden behouden en gefokt, is het uitdagend om beide overdag embryo's te verkrijgen en hybride embryo's tussen stammen te creëren. In vitro fertilisatie (IVF) is gebruikt met een verscheidenheid van verschillende model organismen om met succes en herhaaldelijk dieren te fokken in het laboratorium. In dit protocol laten we zien hoe, door het acclimatiseren van A. mexicanus aan verschillende licht cycli in combinatie met veranderingen in de watertemperatuur, we de kweek cycli kunnen verschuiven naar een gekozen tijdstip van de dag. Vervolgens laten we zien hoe geschikte oudervis te identificeren, gezonde gameten van mannetjes en vrouwtjes te verzamelen en levensvatbare nakomelingen te produceren met behulp van IVF. Hiermee kunnen gerelateerde procedures, zoals de injectie van genetische constructies of ontwikkelings analyse, plaatsvinden tijdens normale werkuren. Bovendien kan deze techniek worden gebruikt om hybriden te creëren tussen de grot en de oppervlaktewonertal, en daarmee de studie van de genetische basis van fenotypische aanpassingen aan verschillende omgevingen mogelijk te maken.
Introduction
In de afgelopen jaren, Astyanax mexicanus is uitgegroeid tot een modelorganisme in verschillende gebieden, zoals ontwikkelingsbiologie, evolutionaire biologie, gedragsbiologie, en fysiologie1,2,3,4 . De uniciteit van dit systeem komt van deze soort met verschillende vertegenwoordigen die zijn aangepast aan zeer verschillende omgevingen. De oppervlakte woning morphotype leeft in rivieren waar sprake is van een hoge biodiversiteit en veel voedselbronnen voor de vis. In tegenstelling, de grot vertegenwoordigen van A. mexicanus, de cavefish, leven in grotten waar de biodiversiteit, voedselbronnen en zuurstof drastisch worden verminderd1. Cavefish verschillen van de oppervlakte vis in een verscheidenheid van fenotypes zoals de afwezigheid van ogen en pigmentatie, insulineresistentie, en de mogelijkheid voor het opslaan van vet2,3,4. Echter, oppervlakte vissen en cavefish behoren nog steeds tot dezelfde soort en zijn daarom interfertile.
Voor beide morphotypen is een reeks voorwaarden gedefinieerd om routineonderhoud en kweek onder laboratoriumomstandigheden te kunnen toestaan op5,6. Echter, genetische modificaties, goede embryonale ontwikkelingsstudies, en de creatie van hybriden zijn nog steeds uitdagend om verschillende redenen. A. mexicanus spawnde voornamelijk tijdens nachturen wat lastig is voor latere experimenten op vroege embryonale stadia zoals injectie van genetische constructies of het monitoren van vroege embryonale ontwikkelingsprocessen. Daarnaast is het genereren van oppervlakte-en grot hybriden uitdagend met behulp van natuurlijke paai, omdat de grot vertegenwoordigen een veranderde circadiane ritme7 hebben die uiteindelijk de productie van levensvatbare eicellen beïnvloedt. Succesvolle, maar invasieve, IVF-procedures zijn beschreven voor andere Astyanax -soorten, waar de productie van gameten en paai gedrag werd klaar met behulp van hormonale injecties8,9. Minder invasieve IVF-procedures (d.w.z. het verkrijgen van gameten uit handmatige paai zonder de injectie van hormonale preparaten) zijn beschreven, maar beschouwen de verschillen in de paai cyclus tussen grot en oppervlakte vertegenwoordigen van A. mexicanus niet 6.
Andere vismodel organismen, zoals de zebravissen, kunnen gemakkelijk genetisch gemodificeerd zijn en op embryonale wijze worden bestudeerd, omdat de hierboven genoemde obstakels met succes zijn opgelost. De implementatie van gestandaardiseerde foktechnieken, in-vitro fertilisatie, en het gebruik van sperma-cryopreservering hebben de zebravis naar voren geschoven en het model in de biologische wetenschappen verstevigd10. Daarom zal het uitbreiden van deze technieken naar a. mexicanus het verder versterken als een modelsysteem.
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor IVF dat zal helpen om a. mexicanus toegankelijker te maken. We zullen een fokopstelling presenteren die het mogelijk maakt om de licht cycli van de vis van overdag naar 's nachts te verschuiven, zodat levensvatbare eicellen kunnen worden verkregen tijdens de dag uren zonder injectie van hormonale preparaten. Vervolgens geven we een gedetailleerde beschrijving van het verkrijgen van de eicellen en milt die voor IVF worden gebruikt. Deze methode maakt de productie van embryo's tijdens normale werkuren mogelijk en maakt verdere downstreamtoepassingen mogelijk in vergelijking met het gebruik van embryo's van natuurlijke paaien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van Stowers Institute for Medical Research.
1. manipulatie van de licht cyclus
- Zet viskwekerijen op in een ondoorzichtige, volledig afgesloten (licht bescherming), doorstroom aquacultuur systeem met meerdere rijen tanks (Figuur 1).
Opmerking: het doorstroomsysteem zoals weergegeven in Figuur 1 gebruikt systeemwater om afval door de achterbuis van elke tank te spoelen en stroomt in een put die uitmondt in een sanitaire afvoer. In dit experiment werd een water wisselkoers van één gallon (US) per uur door middel van een DRIP emitter gebruikt. - Behoud de temperatuur van elke tank met een onafhankelijk verwarmingselement dat wordt gebruikt om de temperatuur tijdens het priming proces handmatig te wijzigen.
- Stel afzonderlijke rijen in op een manier om afzonderlijke photoperiods in te schakelen. Installeer deuren op elke rij die gesloten kunnen worden om te voorkomen dat het licht binnenkomt of ontsnapt.
Opmerking: de geautomatiseerde controller kan manipulatie van alle foto operiods met de minste verstoring van de vis mogelijk maken. - Rust het rek uit met een rood werk lampje en verduisteringsgordijnen voor toegang tijdens donkere uren.
2. aanpassen van fooperiod en priming vis voor gameten-collectie
- Verwijder de gewenste vis (Figuur 2a) uit algemene systeem rekken en plaats in fokrekken om de foto operiod 14 dagen vóór het primen te kunnen afstellen.
Let op: Hierdoor kan de vis acclimatiseren aan een nieuwe omgeving. - Houd de vissen gedurende deze periode bij 22,8 °C (73 °F) met behulp van het geïnstalleerde water verwarmingsysteem. De normale foto operiod is van 6 uur tot 8 p.m. licht en 8 p.m. tot 6 uur donker. Voor het lichtfietsenrek verschuift u de fotoperiode naar 10 pm tot 12 p.m. Light en 12 p.m. tot 10 uur donker door de timer aan te passen die het licht in het rek aandrijf.
Opmerking: mannetjes en vrouwtjes zijn ondergebracht in dezelfde tank om natuurlijk priming gedrag te laten plaatsvinden. Terwijl het paaien in de tank kan plaatsvinden, kan vis nog steeds worden gebruikt voor in vitro fertilisatie, omdat gameten in stadia11vrijkomen. - Zodra de vis geacclimatiseerd is, begint de dieren te primen voor paai5 zoals beschreven in de stappen 2.3.1 tot en met 2.3.5.
Opmerking: deze procedure duurt zes dagen in totaal. Verander in deze tijd de temperatuur om de OVA-productie te Prime met behulp van een geïnstalleerd water verwarmingsysteem. Met behulp van de 50W water verwarmers (Zie tabel van de materialen), zet de kachel direct op de temperatuur (schaal op de kachel is in Fahrenheit) gegeven in het protocol bij elke stap. Afhankelijk van de grootte van de tank en de doorstroomsnelheid van het water, kan de tijd van de temperatuur aanpassing afwijken. In dit experiment werd de temperatuur 's middags aangepast en nam de temperatuur-evenwichtsoefening de volgende 18 uur in beslag.- Op dag 1 verhoogt u de temperatuur van 22,8 °C (73 °F) tot 24,4 °C (76 °F).
- Op dag 2 verhoogt u de temperatuur van 24,4 °C (76 °F) tot 26,1 °C (79 °F).
- Houd op dag 3 en 4 de temperatuur bij 26,1 °C (79 °F). Vis zal gedurende de dag klaar zijn om te spawnen en IVF kan worden uitgevoerd.
Let op: afhankelijk van de individuele vissen, kunnen vrouwtjes spawnen op dag 3 en/of dag 4. We raden aan om OVA te proberen te verkrijgen op dag 3 en/of dag 4, afhankelijk van het succes van de OVA-collectie. - Op dag 5 verlaagt u de temperatuur van 26,1 °C (79 °F) tot 24,4 °C (76 °F).
- Op dag 6 verlaagt u de temperatuur van 24,4 °C (76 °F) tot 22,8 °C (73 °F).
Opmerking: zorg voor een onderbreking van 7 dagen voordat u deze temperatuurcyclus herhaalt. Het wordt aanbevolen om de vis in deze fotoperiode te blijven houden, omdat dit de totale tijd die de vis nodig heeft om zich aan te passen aan deze verschoven licht cyclus zal verminderen.
3. vrouwelijke gameten collectie
- Begin met het aanbrengen van een bevochtigd weefsel doekje in een Petri schaaltje en sluit het schaaltje om een bevochtigde kamer te creëren en voorkom dat de eicellen uitdrogen tijdens het verzamelproces.
- Kies vervolgens een vrouwtje voor de collectie. Gravid vis met grote, uitstekende buikjes zal waarschijnlijk de beste keuze zijn voor deze procedure (Figuur 2a).
Opmerking: om onderscheid te maken tussen mannetjes en vrouwtjes van Adult A. mexicanus, werd de Cotton Ball methode12gebruikt. - Immobiliseer een vrouwtje met gekoeld water en plaats haar in de liggende positie in een bevochtigde sponsdieren houder. Doe dit door de vissen in 4 °C systeemwater te plaatsen gedurende ten minste 30 s of totdat de vis is geïmmobiliseerd (d.w.z. verlies van Gill-beweging, Zie Ross en Ross13 voor meer informatie).
Opmerking: werk snel en probeer de vis niet op te warmen totdat de procedure is voltooid. Dit kan omvatten periodiek dippen van de gegloeide toppen van de vingers in koud water of het aanbieden van aanvullende anesthesie. Andere anesthesie methoden (bijv. MS-22213) kunnen ook worden gebruikt. Onder de IACUC-richtlijnen van het Stowers Instituut voor medisch onderzoek wordt de manuele inzameling van eicellen beschouwd als een niet-invasieve ingreep, die geen volledige anesthesie vereist (bijv. via MS-222). - Eenmaal gepositioneerd, DEP de ventrale kant van de vis met een delicate weefsel doekje als contact met water zal ervoor zorgen dat de eicellen te activeren.
- Houd het vrouwtje tussen de duim en wijsvinger. Knijp zachtjes tegen de laterale zijden van de coelomische holte in de richting van de urogenitale opening terwijl u de vingers lichtjes rolt. Verzamel de geuite eicellen met behulp van een wegwerp spatel.
- Breng deze eicellen over naar het bevoficeerde Petri schaaltje.
Opmerking: verschillende koppelingen van eicellen kunnen in hetzelfde gerecht worden gecombineerd als er geen specifieke gegevens over de afstamming nodig zijn. De eicellen kunnen bij 24 °C worden bewaard en zijn het beste bij gebruik voor IVF binnen 30-60 minuten na het verzamelen. - Na het verzamelen, de vis voorzichtig terug te keren naar een Recovery tank gevuld met systeemwater.
Opmerking: plaats de vis terug in de donkere kast tank voor toekomstige OVA-collectie indien nodig.
4. mannelijke gameten collectie
- Kies een mannetje om te verzamelen.
Opmerking: er zijn geen uiterlijk zichtbare tekenen van mannelijke gameten kwaliteit. Echter, vis moet verschijnen gezond in uiterlijk voor gebruik in deze procedure. Om onderscheid te maken tussen mannetjes en vrouwtjes van volwassen A. mexicanuswerd de Cotton Ball methode12gebruikt. - Immobiliseer een mannetje met behulp van gekoeld water en plaats hem in de rugligging in een bevochtigde sponsdieren houder. Immobiliseer door de vis gedurende ten minste 30 seconden in het systeemwater van 4 °C te plaatsen of totdat de vis is geïmmobiliseerd (d.w.z. verlies van Gill-beweging, Zie Ross en Ross13 voor meer informatie).
Opmerking: werk snel en probeer de vis niet op te warmen totdat de procedure is voltooid. Dit kan omvatten periodiek dippen van de gegloeide toppen van de vingers in koud water of het aanbieden van aanvullende anesthesie. Andere anesthesie methoden (bijv. MS-22213) kunnen hier ook worden gebruikt. Onder de IACUC richtlijnen van de Stowers Institute for Medical Research, handmatige verzameling van sperma wordt beschouwd als een niet-invasieve procedure, die niet volledige anesthesie vereist (bijv., door middel van MS-222). - DEP de ventrale zijde van de vis met een delicaat weefsel doekje als contact met water het milt-effect zal activeren.
- Plaats het uiteinde van een capillaire buis voorzichtig op de urogenitale opening.
- Verdrijven milt door het aanbrengen van zachte druk op de zijkanten van de vis met de duim en wijsvinger. Begin distale naar de kieuwen, verplaatsen naar de urogenitale opening.
- Vang de milt op aan het uiteinde van een capillaire buis. Een zachte zuigkracht kan nodig zijn door het gebruik van een aspirator buis. Vermijd uitwerpselen die kunnen worden uitgezet met het milt.
- Doseer het milt in een lege centrifugebuis van 1,5 mL en Verdun met tweemaal het volume van de sperma Extender E400 (Zie tabel met materialen). Blijf op ijs.
Opmerking: milt van meerdere mannetjes kan samengevoegd worden als er geen specifieke ouderschap gegevens nodig zijn. Deze stap kan worden gebruikt om de werktijd van het milt aantal uren te verlengen, maar het is niet vereist voor onmiddellijke bevruchting. - Na het verzamelen, de vis voorzichtig terug te keren naar een Recovery tank gevuld met systeemwater.
Opmerking: plaats de vis terug in de donkere kast tank voor toekomstige sperma collectie indien nodig.
5. in vitro fertilisatie
- Gebruik een nieuwe pipet voor elke kolf, meng het sperma door pipetteren en/of roeren van de zijkant van de buis voor het bemetelen als sperma in milt kan vestigen in de E400 oplossing na verloop van tijd.
- Breng de milt of de verlengde milt oplossing in de vers verzamelde eicellen.
- Voeg snel 1 mL systeemwater toe aan de koppeling om het sperma en de eieren voor bevruchting te activeren. Vermijd het mengen of agiteren van de inhoud van het gerecht en laat 2 minuten voor bemesting optreden.
Opmerking: het mengen en agiteren vermindert de bevruchting aanzienlijk en moet daarom worden vermeden14. - Voeg E2 embryo media toe om de schaal 2/3RD volledig te vullen.
Opmerking: afhankelijk van de daaropvolgende procedure kunnen embryo's direct worden gebruikt (bijv. voor de injectie van genetische constructies zoals beschreven vóór15) of kunnen embryo's worden geïnineerd in E2 embryo media bij 23 °c tot ze 5 DPF bereiken. Op dit punt overdracht embryo's naar de belangrijkste recirculatie huis systeem met behulp van systeemwater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het protocol dat hier wordt gepresenteerd, is voornamelijk gebaseerd op een eerder gepubliceerd protocol6. Echter, sinds A. mexicanus spawnt tijdens de nachturen, we ontwierpen een huisvestingrek voor het kweken van vissen dat de fotoperiode onafhankelijk van de werkuren kan veranderen (Figuur 1). De vislichtcyclus wordt gewijzigd binnen een volledig afgesloten, doorstroom aquacultuur systeem dat drie rijen tanks bevat (Figuur 1). Elke tank bevat een onafhankelijk verwarmingselement dat wordt gebruikt om de temperatuur tijdens het priming proces handmatig te verhogen. Individuele planken kunnen worden geplaatst op afzonderlijke foto operiods en kunnen worden gesloten om te voorkomen dat licht binnenkomen of ontsnappen. Alle foto operiods kunnen worden gemanipuleerd door middel van een geautomatiseerde controller gepositioneerd aan de zijkant van de lichtfietsenrek. Voor toegang tijdens donkere uren is het rek uitgerust met een rood werk lampje en verduisteringsgordijnen. A. mexicanus spawnt na een stijging van de temperatuur van 23-26 ° c met een increment van 1,5 °c per dag16. Om dit te bereiken in onze donkere kasten, gebruikten we dompelbare aquarium verwarmers in elke tank (Figuur 1).
De sleutelfactor voor een succesvolle IVF-procedure in a. mexicanus is de kwaliteit van de verzamelde eicellen. Gravid, vrouwelijke vissen met grote, uitstekende buikjes zijn het meest geneigd om levensvatbare eicellen vrij te geven, die duidelijk en zelfs in uiterlijk verschijnen (Figuur 2a-d). Het toevoegen van de verzamelde milt aan dergelijke eicellen resulteert in de ontwikkeling van bevruchte embryo's meestal binnen 20-30 min (figuur 2e). Levensvatbare bevruchte embryo's zullen iets meer doorschijnend worden voordat ze de één celfase van de ontwikkelingscyclus betreden, terwijl onbevruchte eicellen ongelijkmatig en ondoorzichtig zullen lijken (figuur 2e). Resulterende embryo's worden in Petri schaaltjes in ZIRC E2 embryo media gehouden en geïnineerd bij 23 °C in een 14/10 licht/donker cyclus. Vervolgens worden de embryo's na 5 dagen na de bevruchting naar het hoofd recirculatiesysteem overgebracht voor het fokken.
Om het belang van de techniek aan te tonen, laten we zien hoe het fenotypen van hybriden voor specifieke eigenschappen zoals ooggrootte en lichaams pigmentatie kan helpen bij het ontcijferen van hun genetische basis. Cavefish verschilt duidelijk van de oppervlakte vissen in hun ooggrootte en lichaams pigmentatie. Om de genetische basis van deze eigenschappen te begrijpen, hebben we de oppervlakte-en cavefish (F0) overschreden en hybride F1-en F2-populaties gegenereerd met behulp van IVF om de verkregen fenotypische variatie te observeren (Figuur 3). De grootte van de ogen is kleiner bij de F1-generatie die aangeeft dat de aanwezigheid van de ogen een gedeeltelijk dominante eigenschap is (Figuur 3). In de Surface-Cave F2-Hybriden verkrijgen we een breed scala aan ooggroottes, wat aangeeft dat er meerdere loci zijn die de ooggrootte in a. mexicanus regelen, waardoor het een kwantitatieve eigenschap is (Figuur 3). Een ander voorbeeld is pigmentatie. Observeren van de F1 hybride van oppervlakte en cavefish, kan worden geconcludeerd dat lichaams pigmentatie een dominante eigenschap is als de vis volledig gepigmenteerd is (Figuur 3). Bij de F2-generatie wijst de variatie in lichaams pigmentatie weer naar een kwantitatieve eigenschap. Combinatie van deze fenotypische gegevens met sequentie gegevens kan onderliggende genetische loci onthullen die verantwoordelijk is voor deze fenotypes. Deze F2 populaties zijn een goede hulpbron voor het begrijpen van de genetische basis van verschillende eigenschappen en dergelijke populaties zijn eerder gebruikt voor het bestuderen van deze eigenschappen17,18,19. Een gestandaardiseerde IVF-techniek kan het genereren van hybriden sterkstroom lijnen, waardoor genetische mapping mogelijk is van de loci die dergelijke eigenschappen beheersen en helpt ons te begrijpen hoe bepaalde fenotypes nadelig zijn voor sommige habitats en adaptief in andere.
Figuur 1 : Ontwerp van racks om dag-en nachtcycli van A. mexicanus. (a) de algemene opzet van dit racksysteem maakt manipulatie van fotoperiode mogelijk, waardoor een simulatie van nacht tijd gedurende de dag uren wanneer deuren gesloten zijn, en de plank lichten worden uitgeschakeld. b) het primen van de vis om de rijping van eicellen te stimuleren wordt bereikt door gebruik te maken van Dompel verwarmers (Zie tabel met materialen) die in afzonderlijke tanks zijn geïnstalleerd en afzonderlijk kunnen worden aangepast (rode pijlen). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Voor beelden van geschikte vrouwtjes voor de inzameling van eicellen en representatieve illustratie van levensvatbare en onlevensvat bare eicellen. a) gravid, vrouwelijke vissen met grote, uitstekende buikjes zijn meer geschikt voorhand matige OVA-collectie dan (b) vrouwtjes met een gestroomlijnd gevormde buik. c) levensvatbare eicellen (d.w.z. eicellen die levensvatbare embryo's produceren wanneer ze worden bevruchte) kunnen worden geïdentificeerd aan de hand van hun duidelijke, gelijkmatige verschijning, terwijl onlevensvat bare eicellen (d.w.z. eicellen die geen levensvatbare embryo's produceren wanneer ze worden bevruchte), zoals aangegeven onderd, een troebel, ongelijkmatig Uiterlijk. e) na succesvolle bevruchting worden levensvatbare embryo's meer doorschijnend en komen ze in één cel, terwijl onbevruchte eicellen (rode pijlen) langzaam zullen vervallen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Genetische analyse van de eigenschappen van de ooggrootte en lichaams pigmentatie. Pedigree met foto's van de ouderlijke (F0) oppervlakte vis (linksboven) en cavefish (rechtsboven), F1 hybriden (tweede rij) en de F2 hybriden. De F1-vissen hebben een tussenliggende ooggrootte en zijn volledig gepigmenteerd, terwijl F2-vissen een brede variatie vertonen in de twee morfologische eigenschappen: ooggrootte en pigmentatie. Alle originele gegevens die aan dit cijfer zijn gelinkt, kunnen worden geraadpleegd vanuit de Stowers Original data repository op http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1365. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel IVF een gestandaardiseerde methode is voor veel verschillende model organismen zoals zebravissen, houden bestaande protocollen voor a. mexicanus geen rekening met het dat deze soort natuurlijk spawnt tijdens de nachturen6. Gezien het feit dat cavefish en oppervlakte vissen nogal drastisch verschillen in hun circadiane ritmes, verschilt de rijpings cyclus van de eicellen ook tussen de grot en de oppervlakte morphotypes. Terwijl de faserings temperaturen en-tijden voor Surface A. mexicanus goed zijn bestudeerd12, kunnen cavefish verschillen in hun paai gedrag en rijpings cyclus. Conventionele methoden van hybride productie zijn daarom zeer uitdagend en onzeker als gevolg van het verlies van circadiane ritme in de grot morphotype van A. mexicanus7, wat resulteert in veranderde paai tijden van deze vissen. Door het verschuiven van de photoperiod, kunnen we tijd specifieke hybride embryo's bieden zonder te hoeven vertrouwen op zeldzame natuurlijke paai gebeurtenissen tussen de twee morphotypes. Het gescheiden houden van de grot en de oppervlakte vissen voorkomt ook dat agressieve oppervlakte-morphs een nadelig effect hebben op de fokkerij.
Er zijn enkele beperkingen met deze methode, zoals variaties in de kwaliteit van de OVA. Identificatie van een vrouwtje (oppervlak of cavefish) met volgroeide eicellen is niet triviaal en vereist zorgvuldige waarnemingen van het visgedrag. Over het algemeen hebben zwangere-vrouwtjes die klaar zijn voor paai, grotere buikjes en zullen ze herhaaldelijk tegen het onderste tank oppervlak of de embryo-opvang trap20poetsen.
We hebben geconstateerd dat de kwaliteit van sperma consistent is gedurende de hele dag/nacht cyclus. De kritieke stap van succesvolle IVF (succesvol in termen van het genereren van bevruchte embryo's) is het verkrijgen van goede kwaliteit, levensvatbare eicellen. Daarom is het uitermate belangrijk om de eicellen te verzamelen van vissen die op een natuurlijke manier gaan spawnen (Figuur 2a). Zodra de eicellen zijn verzameld, kunnen ze worden waargenomen onder een dissectie-Microscoop om de kwaliteit te onderzoeken. De verzameling van levensvatbare eicellen tijdens de nacht is echter lastig en uitdagend voor de onderzoeker. De Setup die we hier presenteren, maakt het mogelijk om de rijpings cyclus van de eicellen te verschuiven, zodat IVF kan worden gebruikt voor het genereren van gesynchroniseerde embryo's voor downstreamtoepassing tijdens normale werkuren.
Met de vooruitgang van cryopreservatie van milt (bijv., zoals beschreven in zebravissen21), zal IVF een krachtig instrument worden voor het vaststellen en onderhouden van genetische lijnen voor het opkomende modelsysteem a. mexicanus. In combinatie met methoden voor genetische modificatie15 en de op morpholino gebaseerde knockdown17, zullen deze procedures het methodologisch platform bieden om de genetische en ontwikkelings onderbouwing van aanpassingen aan verschillende habitats in A. mexicanus.
Samenvattend zal het hier gepresenteerde protocol de productie mogelijk maken van gesynchroniseerde embryo's van A. mexicanus voor andere downstreamtoepassingen, zoals het injecteren van genetische constructies of het bestuderen van vroege embryologische fenotypes. De belangrijkste sterkte van het protocol is dat het zorgt voor een efficiënte productie van oppervlakte-grot hybriden die kunnen worden gebruikt om genetisch fenotypische verschillen tussen oppervlakte vissen en cavefish door middel van qtl (kwantitatieve eigenschap loci) analyse. Bij elkaar genomen is het verkrijgen van levensvatbare eicellen overdag voor IVF een krachtige techniek die gunstig zal zijn voor een verscheidenheid aan toekomstige studies in verschillende gebieden van de biologische wetenschappen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen Philippe Noguera en Kimberly Bland bedanken voor hun ondersteuning bij de videoproductie. De auteurs willen ook graag het hele team van Aquatics van het Stowers Institute for Animal husbandry erkennen. Dit werk werd gesteund door institutionele financiering aan DPB en NR. NR werd gesteund door de Edward Mallinckrodt Foundation en JDRF. RP werd gesteund door een subsidie van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (PE 2807/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Centrifuge Tube | Eppendorf | #22364111 | |
| 100 mm Petri Dishes | VWR International | #25384-302 | |
| Aspirator Tube | Drummond | #2-000-000 | |
| Calibrated 1-5 µL Capillary Tubes | Drummond | #2-000-001 | |
| Dispolable Spatulas | VWR International | #80081-188 | |
| HMA-50S 50W Aquatic Heaters | Finnex | HMA-50S | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | #3123000063 | |
| P1000 Pipette Tips | Thermo Scientific | #2079E | |
| Sanyo MIR-554 incubator | Panasonic Health Care | MIR-554-PA | |
| Sperm Extender E400 | 130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glucose, 30 mM HEPES Adjust to pH 7.9 with 5M KOH and filter sterilize. Solution can be stored at 4 ?C for up to 6 months. |
||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| System Water | Deionized water supplemented with Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] to reach a specific conductance of 800 µS/cm. Water quality parameters are maintained within safe limits (Upper limit of total ammonia nitrogen range, 1 mg/L; upper limit of nitrite range, 0.5 mg/L; upper limit of nitrate range, 60 mg/L; temperature, 22 °C; pH, 7.65; dissolved oxygen 100 %) | ||
| Tissue Wipes | Kimberly-Clark Professional | #21905-026 | |
| ZIRC E2 Embryo Media | 15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 µM KH2PO4, 50 µM Na2HPO4, 1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. Adjust pH to 7.2 to 7.4 using 2 N hydrochloric acid. Filter sterilize. Stored at room temperature for a maximum of two weeks. |
References
- Jeffery, W. R.
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genetics. 5, e1000326 (2009).
- Riddle, M. R., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555, 647-651 (2018).
- Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441 (2), 297-304 (2018).
- Borowsky, R. Breeding Astyanax mexicanus through Natural Spawning. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Borowsky, R. In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Beale, A., et al. Circadian rhythms in Mexican blind cavefish Astyanax mexicanus in the lab and in the field. Nature Communications. 4, 2769 (2013).
- Sato, Y., Sampaio, E. V., Fenerich-Verani, N., Verani, J. R. Reproductive biology and induced breeding of two Characidae species (Osteichthyes, Characiformes) from the São Francisco River basin, Minas Gerais, Brazil. Revista Brasileira Zoology. 23 (1), 267-273 (2006).
- Yasui, G. S., et al. Improvement of gamete quality and its short-term storage: an approach for biotechnology in laboratory fish. Animal. 9 (3), 464-470 (2015).
- Westerfield, M. The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2000).
- Simon, V., Hyacinthe, C., Retaux, S. Breeding behavior in the blind Mexican cavefish and its river-dwelling conspecific. PLoS One. 14 (2), e0212591 (2019).
- Borowsky, R. Determining the Sex of Adult Astyanax mexicanus. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Ross, L. G., Ross, B. Anaesthetic and Sedative Techniques for Aquatic Animals. , 3rd edn, Wiley-Blackwell. (2008).
- Matthews, J. L., et al. Changes to Extender, Cryoprotective Medium, and In Vitro Fertilization Improve Zebrafish Sperm Cryopreservation. Zebrafish. 15 (3), 279-290 (2018).
- Stahl, B. A., et al. Stable transgenesis in Astyanax mexicanus using the Tol2 transposase system. Developmental Dynamics. , 1-9 (2019).
- Elipot, Y., Legendre, L., Pere, S., Sohm, F., Retaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11, 291-299 (2014).
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genetics. 5 (1), e1000326 (2009).
- Jeffery, W. R. Chapter 8. Evolution and development in the cavefish Astyanax. Current Topics in Developmental Biology. 86, 191-221 (2009).
- Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C., Borowsky, R. Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus. Current Biology. 17 (5), 452-454 (2007).
- Hinaux, H., et al. A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish. Zebrafish. 8, 155-165 (2011).
- Draper, B. W., Moens, C. B. A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiment. (29), (2009).
