Summary
La fertilización in vitro es una técnica comúnmente utilizada con una variedad de organismos modelo para mantener las poblaciones de laboratorio y producir embriones sincronizados para aplicaciones posteriores. Aquí, presentamos un protocolo que implementa esta técnica para diferentes poblaciones del tetra pescado mexicano, Astyanax mexicanus.
Abstract
Astyanax mexicanus está emergiendo como un organismo modelo para una variedad de campos de investigación en ciencia biológica. Parte del éxito reciente de esta especie de peces de teleost es que posee cuevas interferentes y poblaciones que habitan en los ríos. Esto permite el mapeo genético de rasgos hereditarios que se fijaron durante la adaptación a los diferentes ambientes de estas poblaciones. Si bien esta especie puede ser mantenida y criada en el laboratorio, es un reto obtener embriones durante el día y crear embriones híbridos entre cepas. La fertilización in vitro (FIV) se ha utilizado con una variedad de diferentes organismos modelo para criar con éxito y repetidamente animales en el laboratorio. En este protocolo, mostramos cómo, al aclimatar A. mexicanus a diferentes ciclos de luz junto con cambios en la temperatura del agua, podemos cambiar los ciclos de reproducción a una hora elegida del día. Posteriormente, mostramos cómo identificar peces parentales adecuados, recolectar gametos saludables de machos y hembras, y producir descendencia viable usando FIV. Esto permite que se produzcan procedimientos relacionados como la inyección de construcciones genéticas o el análisis del desarrollo durante las horas normales de trabajo. Además, esta técnica se puede utilizar para crear híbridos entre las poblaciones de cuevas y habitantes de superficie, y así permitir el estudio de la base genética de adaptaciones fenotípicas a diferentes ambientes.
Introduction
En los últimos años, Astyanax mexicanus se ha convertido en un organismo modelo en diferentes campos como la biología del desarrollo, la biología evolutiva, la biología conductual y la fisiología1,2,3,4 . La singularidad de este sistema proviene de que esta especie tenga varios morfotipos que se han adaptado a ambientes muy diferentes. El morfotipo de la vivienda superficial vive en ríos donde hay una alta biodiversidad y un montón de fuentes de alimento para los peces. Por el contrario, los morfotipos de la cueva de A. mexicanus,el pez cavernario, viven en cuevas donde la biodiversidad, las fuentes de alimentos y el oxígeno disminuyen drásticamente1. Los peces cavernícolas difieren de los peces de superficie en una variedad de fenotipos como la ausencia de ojos y pigmentación, resistencia a la insulina, y la capacidad de almacenar grasa2,3,4. Sin embargo, los peces de superficie y los peces cavernícolas siguen perteneciendo a la misma especie y, por lo tanto, son interferentes.
Para ambos morfotipos, se ha definido un conjunto de condiciones para permitir el mantenimiento y la cría de rutina en condicionesdelaboratorio 5,6. Sin embargo, las modificaciones genéticas, los estudios de desarrollo embrionario adecuados y la creación de híbridos siguen siendo desafiantes por varias razones. A. mexicanus desove principalmente durante las horas nocturnas, lo que es inconveniente para experimentos posteriores en etapas embrionarias tempranas como la inyección de construcciones genéticas o el monitoreo de procesos de desarrollo embrionariotemprano tempranos. Además, la generación de híbridos superficiales y de cuevas es un reto utilizando el desove natural, ya que los morfotipos de la cueva tienen un ritmo circadiano alterado7 que en última instancia afecta a la producción de óvulos viables. Se han descrito procedimientos exitosos, pero invasivos, de FIV para otras especies de Astyanax, donde la producción de gametos y el comportamiento de desove se prepararon con inyecciones hormonales8,9. Se han descrito procedimientos de FIV menos invasivos (es decir, obtención de gametos a partir de manual sin la inyección de preparaciones hormonales), pero no se tienen en cuenta las diferencias en el ciclo de desove entre los morfotipos de cueva y superficie de A. mexicanus 6.
Otros organismos modelo de peces, como el pez cebra, pueden ser fácilmente modificados genéticamente y estudiados a nivel embrionario porque los obstáculos indicados anteriormente se han resuelto con éxito. La implementación de técnicas de reproducción estandarizadas, la fertilización in vitro y la criopreservación de espermatozoides han empujado al pez cebra hacia adelante y solidificado el uso del modelo en las ciencias biológicas10. Por lo tanto, extender estas técnicas a A. mexicanus lo fortalecerá aún más como un sistema modelo.
Aquí, presentamos un protocolo detallado para la FIV que ayudará a hacer A. mexicanus más accesible. Presentaremos una configuración de cría que permite cambiar los ciclos de luz de los peces de día a noche para que se puedan obtener óvulos viables durante las horas de día sin necesidad de inyección de preparaciones hormonales. A continuación, proporcionamos una descripción detallada de cómo obtener los óvulos y milt utilizados para la FIV. Este método permitirá la producción de embriones durante las horas normales de trabajo y hará que las aplicaciones posteriores sean más factibles en comparación con el uso de embriones de desove natural.
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Protocol
Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Instituto Stowers para la Investigación Médica.
1. Manipulación del ciclo de luz
- Instalar tanques de peces dentro de un sistema de acuicultura opaco, totalmente cerrado (protección ligera), que fluya a través de múltiples filas de tanques (Figura1).
NOTA: El sistema de flujo a través, como se muestra en la Figura 1, utiliza agua del sistema para vaciar los residuos a través de la tubería del soporte trasero de cada tanque y fluye hacia un sumidero que se vacía en un drenaje sanitario. En este experimento, se utilizó un tipo de cambio de agua de un galón (EE.UU.) por hora a través de un emisor de goteo. - Mantener la temperatura de cada tanque con un elemento calefactor independiente que se utiliza para alterar manualmente la temperatura durante el proceso de cebado.
- Configure filas individuales de una manera para habilitar fotoperiodos separados en cada uno. Instale puertas en cada fila que se puedan cerrar para evitar que la luz entre o escape.
NOTA: El controlador automatizado puede permitir la manipulación de todos los fotoperiodos con la menor perturbación para los peces. - Equipar el bastidor con una luz de trabajo roja y cortinas opacas para el acceso durante las horas oscuras.
2. Ajuste del fotoperiodo y el pescado cebado para la recolección de gametos
- Retire el pescado deseado (Figura2a)de los estantes generales del sistema y colóquelo en los estantes de cría para permitir el ajuste del fotoperiodo 14 días antes del cebado.
NOTA: Esto permite que los peces se aclimaten a un nuevo entorno. - Mantener el pescado a 22,8 oC (73 oF) durante este período utilizando el sistema de calentamiento acuático instalado. El fotoperiodo normal es de 6 a.m. a 8 p.m. de luz y de 8 p.m. a 6 a.m. de noche. Para el rack de ciclo de luz, cambie el fotoperiodo a 10 p.m. a 12 p.m. de luz y de 12 p.m. a 10 p.m. de noche ajustando el temporizador que alimenta la luz dentro del bastidor.
NOTA: Los machos y las hembras se alojan en el mismo tanque para permitir comportamientos de cebado naturales. Mientras que el desove puede tener lugar en el tanque, los peces todavía se pueden utilizar para la fertilización in vitro ya que los gametos se liberan en las etapas11. - Una vez que los peces estén aclimatados, comience a cebar los animales para desovar5 como se describe en los pasos 2.3.1 a 2.3.5.
NOTA: Este procedimiento tarda seis días en total. Durante este tiempo, cambie la temperatura para preparar la producción de óvulos utilizando un sistema de calefacción acuática instalado. Usando los Calentadores Acuáticos de 50W (ver Tabla de Materiales),ajuste el calentador directamente a la temperatura (escala en el calentador está en Fahrenheit) dada en el protocolo en cada paso. Dependiendo del tamaño del tanque y la velocidad de flujo del agua, el tiempo de ajuste de la temperatura puede diferir. En este experimento, la temperatura se ajustó al mediodía y el equilibrio de temperatura se apoderó de las siguientes 18 h.- En el día 1, suba la temperatura de 22,8 oC (73 oF) a 24,4 oC (76 oF).
- En el día 2, suba la temperatura de 24,4 oC (76 oF) a 26,1 oC (79 oF).
- Los días 3 y 4, mantenga la temperatura a 26,1 oC. Los peces estarán listos para desovar durante el día y se puede realizar FIV.
NOTA: Dependiendo de los peces individuales, las hembras pueden desovar el día 3 y/o el día 4. Recomendamos intentar obtener óvulos el día 3 y/o el día 4 dependiendo del éxito de la colección de óvulos. - En el día 5, baje la temperatura de 26,1 oC (79 oF) a 24,4 oC (76 oF).
- En el día 6, baje la temperatura de 24,4 oC (76 oF) a 22,8 oC (73 oF).
NOTA: Proporcione un intervalo de 7 días antes de repetir este ciclo de temperatura. Se recomienda seguir manteniendo los peces en este fotoperiodo ya que esto reducirá el tiempo total necesario por el pescado para ajustarse a este ciclo de luz desplazado.
3. Colección de gametos femeninos
- Comience insertando una toallita de tejido humedecido en la tapa de un plato Petri y cerrando el plato para crear una cámara humidificada y evitar que los óvulos se sequen durante el proceso de recolección.
- A continuación, elija una hembra para la colección. Los peces gravid con abdomens grandes y salientes probablemente serán la mejor opción para este procedimiento (Figura2a).
NOTA: Para diferenciar entre machos y hembras de A. mexicanusadulto, se utilizó el método de bola de algodón12. - Inmovilizar a una hembra usando agua fría y colocarla en la posición supina en un soporte de animal esponja humedecido. Para ello, coloque el pescado en agua del sistema de 4oC durante al menos 30 s o hasta que el pez esté inmovilizado (es decir, pérdida de movimiento de las branquias, consulte Ross y Ross13 para obtener más información).
NOTA: Trabaje rápidamente y trate de evitar calentar el pescado hasta que se complete el procedimiento. Esto puede incluir sumergir periódicamente las puntas enguantadas de los dedos en agua fría o ofrecer anestesia suplementaria. También se pueden utilizar otros métodos de anestesia (p. ej., MS-22213). Bajo las directrices de la IACUC del Instituto Stowers para la Investigación Médica, la recolección manual de óvulos se considera un procedimiento no invasivo, que no requiere anestesia completa (por ejemplo, a través de MS-222). - Una vez colocado, borre el lado ventral del pez con una delicada toallita de tejido, ya que el contacto con el agua hará que los óvulos se activen.
- Sostenga la hembra entre el pulgar y el dedo índice. Apriete suavemente contra los lados laterales de la cavidad celómica en la dirección de la abertura urogenital mientras rueda ligeramente los dedos. Recoger los óvulos expresados utilizando una espátula desechable.
- Transfiera estos óvulos al plato de Petri humidificado.
NOTA: Se pueden combinar varios embragues de óvulos en el mismo plato si no se necesitan datos específicos de parentesco. Los óvulos se pueden almacenar a 24 oC y son mejores cuando se utilizan para la FIV dentro de 30-60 minutos después de la recolección. - Después de la recolección, devuelva suavemente el pescado a un tanque de recuperación lleno de agua del sistema.
NOTA: Vuelva a colocar el pescado en un tanque de gabinete oscuro para futuras recogidas de óvulos cuando sea necesario.
4. Colección de gametos masculinos
- Elija un macho para la colección.
NOTA: No hay signos visibles hacia afuera de la calidad de los gametos masculinos. Sin embargo, los peces deben aparecer sanos en apariencia antes de su uso en este procedimiento. Para diferenciar entre machos y hembras de adulto A. mexicanus,se utilizó el método de bola de algodón12. - Inmovilizar a un macho usando agua fría y colocarlo en la posición supina en un soporte de animal esponja humedecido. Inmovilizar colocando los peces en agua del sistema de 4oC durante al menos 30 segundos o hasta que el pez esté inmovilizado (es decir, pérdida de movimiento de las branquias, ver Ross y Ross13 para más detalles).
NOTA: Trabaje rápidamente y trate de evitar calentar el pescado hasta que se complete el procedimiento. Esto puede incluir sumergir periódicamente las puntas enguantadas de los dedos en agua fría o ofrecer anestesia suplementaria. Otros métodos de anestesia (por ejemplo, MS-22213) también se pueden utilizar aquí. Bajo las directrices de la IACUC del Instituto Stowers para la Investigación Médica, la recolección manual de espermatozoides se considera un procedimiento no invasivo, que no requiere anestesia completa (por ejemplo, a través de MS-222). - Soplar el lado ventral del pez con una delicada toallita de tejido como contacto con el agua activará el milt.
- Coloque suavemente el extremo de un tubo capilar en la abertura urogenital.
- Expulsar milt aplicando una presión suave en los lados del pez con el pulgar y el dedo índice. Comience distal a las branquias, moviéndose hacia la abertura urogenital.
- Recoger el milt en el extremo de un tubo capilar. La succión suave puede ser necesaria mediante el uso de un tubo del aspirador. Evite las heces que puedan ser expulsadas con la milta.
- Dispensar el milt en un tubo de centrífuga vacío de 1,5 ml y diluir con el doble del volumen de Sperm Extender E400 (ver Tabla de Materiales). Manténgase en hielo.
NOTA: Milt de varios machos se pueden agrupar si no se necesitan datos específicos de parentesco. Este paso se puede utilizar para extender el tiempo de trabajo de la milt durante varias horas, pero no es necesario para la fertilización inmediata. - Después de la recolección, devuelva suavemente el pescado a un tanque de recuperación lleno de agua del sistema.
NOTA: Vuelva a colocar el pescado en el tanque del gabinete oscuro para la futura recolección de espermatozoides cuando sea necesario.
5. Fertilización in vitro
- Usando una nueva pipeta para cada acción, mezcle los espermatozoides pipeteando y/o agitando el lado del tubo antes de fertilizar como espermatozoides en milt puede asentarse en la solución E400 con el tiempo.
- Dispensar el milt o solución de milt extendido en los óvulos recién recogidos.
- Agregue rápidamente 1 ml de agua del sistema al embrague para activar los espermatozoides y los óvulos para la fertilización. Evite mezclar o agitar el contenido del plato y deje 2 minutos para que se produzca la fertilización.
NOTA: Mezclar y agitar reduce en gran medida las tasas de fertilización y, por lo tanto, debe evitarse14. - Añadir E2 Embryo Media para llenar el plato 2/3rd lleno.
NOTA: Dependiendo del procedimiento posterior, los embriones pueden utilizarse de inmediato (por ejemplo, para la inyección de construcciones genéticas como se describe antes de15) o los embriones pueden ser incubados en E2 Embryo Media a 23oC hasta que alcancen los 5 dpf. En este punto transferir embriones al sistema principal de viviendas de recirculación utilizando agua del sistema.
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Representative Results
El protocolo presentado aquí se basa principalmente en un protocolopublicadopreviamente 6. Sin embargo, dado que A. mexicanus desove durante las horas de la noche, diseñamos un estante de alojamiento para la cría de peces que puede cambiar el fotoperiodo independientemente de las horas de trabajo (Figura1). El ciclo de luz de los peces se altera dentro de un sistema de acuicultura completamente cerrado y fluido que contiene tres filas de tanques (Figura1). Cada tanque contiene un elemento calefactor independiente que se utiliza para aumentar manualmente la temperatura durante el proceso de cebado. Los estantes individuales se pueden colocar en fotoperiodos separados y se pueden cerrar para evitar que la luz entre o escape. Todos los fotoperiodos se pueden manipular a través de un controlador automatizado situado en el lado del bastidor del ciclo de luz. Para el acceso durante las horas oscuras, el bastidor está equipado con una luz de trabajo roja y cortinas opacas. A. mexicanus desove después de un aumento de la temperatura de 23 - 26 oC con un incremento de 1.5 oC por día16. Para lograr esto en nuestros gabinetes oscuros, utilizamos calentadores de acuario sumergibles en cada tanque (Figura1).
El factor clave para un procedimiento exitoso de FIV en A. mexicanus es la calidad de los óvulos recogidos. Gravid, peces hembra con grandes abdomens sobresalientes son más propensos a liberar óvulos viables, que parecen claros e incluso en apariencia (Figura2a-d). La adición del milt recogido a tales óvulos da como resultado el desarrollo de embriones fertilizados generalmente dentro de 20-30 min (Figura2e). Los embriones fertilizados viables serán ligeramente más translúcidos antes de entrar en la etapa de una célula del ciclo de desarrollo, mientras que los óvulos no fecundados aparecerán más desiguales y opacos (Figura2e). Los embriones resultantes se mantienen en platos Petri en ZIRC E2 Embryo Media y se incuban a 23oC en un ciclo de luz/oscuridad 14/10. Los embriones se transfieren al sistema de carcasa de recirculación principal a los 5 días posteriores a la fertilización para su cría.
Para demostrar la importancia de la técnica, mostramos cómo el fenotipado de híbridos para rasgos específicos como el tamaño de los ojos y la pigmentación corporal puede ayudar a descifrar su base genética. Los peces cavernarios difieren claramente de los peces de superficie en su tamaño de ojos y pigmentación corporal. Para entender la base genética de estos rasgos, cruzamos la superficie y los peces cavernarios (F0) y generamos poblaciones híbridas de F1 y F2 utilizando FIV para observar la variación fenotípica obtenida (Figura3). El tamaño de los ojos es más pequeño en la generación F1, lo que indica que la presencia de ojos es un rasgo parcialmente dominante (Figura3). En los híbridos F2 de la cueva superficial, obtenemos una amplia gama de tamaños de ojos, lo que indica que hay múltiples loci que controlan el tamaño de los ojos en A. mexicanus, por lo que es un rasgo cuantitativo (Figura3). Otro ejemplo es la pigmentación. Observando el híbrido F1 de la superficie y el pez cavernario, se puede concluir quela pigmentación corporal es un rasgo dominante ya que los peces están completamente pigmentados (Figura 3). En la generación F2, la variación en la pigmentación corporal apunta de nuevo hacia un rasgo cuantitativo. La combinación de estos datos fenotípicos con los datos de secuenciación puede revelar loci genéticos subyacentes responsables de estos fenotipos. Estas poblaciones de F2 son un buen recurso para entender la base genética de diversos rasgos y tales poblaciones se han utilizado previamente para el estudio de estos rasgos17,18,19. Una técnica de FIV estandarizada puede agilizar en gran medida la generación de híbridos, permitiendo el mapeo genético de los loci que controlan tales rasgos y ayudándonos a entender cómo ciertos fenotipos son desventajosos en algunos hábitats y adaptables en otros.
Figura 1 : Diseño de bastidores para cambiar ciclos de día / noche de A. mexicanus. (a) La configuración general de este sistema de rack permite la manipulación del fotoperiodo, dando una simulación de la noche durante las horas del día cuando las puertas están cerradas, y las luces del estante se apagan. (b ) El priming del pescado para estimular la maduración de óvulos se logra mediante el uso de calentadores sumergibles (ver Tabla de Materiales)instalados en tanques individuales que se pueden ajustar por separado (flechas rojas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Ejemplos de hembras adecuadas para la colección de óvulos y la ilustración representativa de óvulos viables e inviables. (a) Gravid, peces hembra con abdomens grandes y salientes son más adecuados para la recolección manual de óvulos que (b) hembras con una forma aerostadora. (c) Los óvulos viables (es decir, los óvulos que producen embriones viables cuando se fertilizan) pueden identificarse por su aspecto claro y uniforme, mientras que los óvulos inviables (es decir, los óvulos que no producen embriones viables cuando se fertilizan), como se muestra en (d), tienen un nublado, desigual Aspecto. (e) Después de una fertilización exitosa, los embriones viables se vuelven más translúcidos y entran en la etapa de una célula, mientras que los óvulos no fecundados (flechas rojas) se descomponen lentamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Análisis genético del tamaño de los ojos y los rasgos de pigmentación corporal. Pedigree que muestra imágenes de peces de superficie parentales (F0) (arriba a la izquierda) y peces cavernícola (arriba a la derecha), híbridos F1 (segunda fila) y los híbridos F2. Los peces F1 tienen un tamaño de ojo intermedio y están completamente pigmentados, mientras que los peces F2 muestran una amplia variación en los dos rasgos morfológicos: el tamaño de los ojos y la pigmentación. Se puede acceder a todos los datos originales subyacentes a esta figura desde el repositorio de datos original de Stowers en http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1365. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Si bien la FIV es un método estandarizado para muchos organismos modelo diferentes como el pez cebra, losprotocolos existentes para A. mexicanus no tienen en cuenta que esta especie desove naturalmente durante las horas de la noche 6. Dado que los peces cavernarios y los peces de superficie difieren drásticamente en sus ritmos circadianos, el ciclo de maduración de los óvulos también difiere entre los morfotipos de la cueva y la superficie. Mientras que las temperaturas y tiempos de puesta en escena para la superficie A. mexicanus están bien estudiados12,los peces cavernícolas pueden diferir en su comportamiento de desove y ciclo de maduración. Por lo tanto, los métodos convencionales de producción híbrida son muy desafiantes e inciertos debido a la pérdida del ritmo circadiano en el morfotipo de la cueva de A. mexicanus7,lo que resulta en tiempos alterados de desove de estos peces. Al cambiar el fotoperiodo, podemos proporcionar embriones híbridos específicos del tiempo sin tener que depender de eventos de desove naturales raros entre los dos morfotipos. Mantener la cueva y los peces de superficie separados también evita que los morfos agresivos de la superficie tengan un efecto adverso en la reproducción.
Existen algunas limitaciones con este método, como las variaciones en la calidad de los óvulos. La identificación de una hembra (superficie o pez cavernícola) con óvulos maduros no es trivial y requiere observaciones cuidadosas del comportamiento de los peces. Generalmente, las hembras gravitas listas para el desove tienen abdomens más grandes y se cepillan repetidamente contra la superficie del tanque inferior o la trampa de recolección de embriones20.
Observamos que la calidad de los espermatozoides es consistente durante todo el ciclo día/noche. El paso crítico del éxito de la FIV (éxito en términos de generación de embriones fertilizados) es obtener óvulos viables y de buena calidad. Por lo tanto, es extremadamente importante recoger los óvulos de los peces que están a punto de desovar naturalmente (Figura2a). Una vez que los óvulos se recogen, se pueden observar bajo un microscopio de disección para examinar la calidad. La colección de óvulos viables durante la noche, sin embargo, es inconveniente y desafiante para el investigador. La configuración que presentamos aquí permite el cambio del ciclo de maduración de los óvulos, por lo que la FIV se puede utilizar para generar embriones sincronizados para la aplicación posterior durante las horas normales de trabajo.
Con el avance de la criopreservación de la milt (por ejemplo, como se describe en el pez cebra21),la FIV se convertirá en una poderosa herramienta para establecer y mantener líneas genéticas para el sistema modelo emergente A. mexicanus. En combinación con los métodos de modificación genética15 y de derribo basado en morpholino17, estos procedimientos proporcionarán la plataforma metodológica para estudiar los fundamentos genéticos y de desarrollo de las adaptaciones a diferentes hábitats en A. mexicanus.
En resumen, el protocolo presentado aquí permitirá la producción de embriones sincronizados de A. mexicanus para otras aplicaciones posteriores, como la inyección de construcciones genéticas o el estudio de fenotipos embrionarios tempranos. La principal fortaleza del protocolo es que permite la producción eficiente de híbridos de superficie-cueva que se pueden utilizar para mapear genéticamente las diferencias fenotípicas entre los peces de superficie y los peces cavernarios a través del análisis QTL (loci de rasgo cuantitativo). En conjunto, la obtención de óvulos viables durante el día para la FIV es una técnica poderosa que será beneficiosa para una variedad de estudios futuros en diferentes campos de las ciencias biológicas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores quieren agradecer a Philippe Noguera y Kimberly Bland por su apoyo en la producción de vídeo. Los autores también quieren reconocer a todo el Equipo Acuático del Instituto Stowers para la cría de animales. Esta labor fue apoyada por la financiación institucional de DPB y NR. NR fue apoyado por la Edward Mallinckrodt Foundation y JDRF. RP fue apoyado por una subvención de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (PE 2807/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Centrifuge Tube | Eppendorf | #22364111 | |
| 100 mm Petri Dishes | VWR International | #25384-302 | |
| Aspirator Tube | Drummond | #2-000-000 | |
| Calibrated 1-5 µL Capillary Tubes | Drummond | #2-000-001 | |
| Dispolable Spatulas | VWR International | #80081-188 | |
| HMA-50S 50W Aquatic Heaters | Finnex | HMA-50S | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | #3123000063 | |
| P1000 Pipette Tips | Thermo Scientific | #2079E | |
| Sanyo MIR-554 incubator | Panasonic Health Care | MIR-554-PA | |
| Sperm Extender E400 | 130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glucose, 30 mM HEPES Adjust to pH 7.9 with 5M KOH and filter sterilize. Solution can be stored at 4 ?C for up to 6 months. |
||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| System Water | Deionized water supplemented with Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] to reach a specific conductance of 800 µS/cm. Water quality parameters are maintained within safe limits (Upper limit of total ammonia nitrogen range, 1 mg/L; upper limit of nitrite range, 0.5 mg/L; upper limit of nitrate range, 60 mg/L; temperature, 22 °C; pH, 7.65; dissolved oxygen 100 %) | ||
| Tissue Wipes | Kimberly-Clark Professional | #21905-026 | |
| ZIRC E2 Embryo Media | 15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 µM KH2PO4, 50 µM Na2HPO4, 1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. Adjust pH to 7.2 to 7.4 using 2 N hydrochloric acid. Filter sterilize. Stored at room temperature for a maximum of two weeks. |
References
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