Summary
In vitro fertilizasyon, laboratuvar nüfusunu korumak ve akım uygulamaları için senkronize embriyolar üretmek için çeşitli model organizmalar ile yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Burada, biz Meksika Tetra balık, Astyanax mexicanusfarklı nüfusu için bu tekniği uygulayan bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Astyanax mexicanus biyolojik bilimin çeşitli araştırma alanları için bir model organizma olarak ortaya çıkmaktadır. Bu teleost balık türlerinin son başarının bir parçası, interfertaş mağara ve nehir-konut nüfusu sahip olmasıdır. Bu, bu nüfusun farklı ortamlarda adaptasyon sırasında sabit kalıtsal özelliklerin genetik haritalama sağlar. Bu tür laboratuarda muhafaza edilebilir ve yetiştirilen iken, hem gündüz embriyolar elde etmek ve suşları arasında hibrid embriyo oluşturmak için zordur. In vitro fertilizasyon (ıVF), laboratuvardaki hayvanları başarıyla ve tekrar tekrar doğurmak için farklı model organizmaların çeşitliliği ile kullanılmıştır. Bu protokolde, biz göstermek nasıl, a. mexicanus tarafından farklı ışık döngüleri su sıcaklığında değişiklikler ile birleştiğinde için, biz günün seçilmiş bir zamana üreme döngüleri vardiya olabilir. Daha sonra, uygun ebeveyn balıklarını nasıl tespit ettiğimizi, erkek ve dişilerden sağlıklı gamet toplamaya ve ıVF kullanarak uygulanabilir yavruları üretmeyi gösteriyoruz. Bu, normal çalışma saatlerinde ortaya çıkan genetik yapıların veya gelişimsel analizlerin enjekte edilmesi gibi ilgili prosedürler sağlar. Ayrıca, bu teknik mağara ve yüzey konut nüfus arasında melez oluşturmak için kullanılabilir, ve böylece farklı ortamlar için fenotipi adaptasyon genetik temeli çalışma sağlar.
Introduction
Son yıllarda, Astyanax mexicanus gelişimsel biyoloji, Evrimsel biyoloji, davranışsal biyoloji ve Fizyoloji1,2,3,4 gibi farklı alanlarda bir model organizma haline gelmiştir . Bu sistemin benzersizliği çok farklı ortamlarda adapte olan birkaç Morfotiplerin sahip bu tür gelir. Yüzey konut morphotype yüksek biyoçeşitlilik ve balık için gıda kaynaklarının bol olduğu nehirlerde yaşıyor. Buna karşılık, A. mexicanusmağara Morfotiplerin, cavefish, biyolojik çeşitlilik, gıda kaynakları ve oksijen büyük ölçüde azalır mağaralarda yaşıyor1. Cavefish göz ve pigmentasyon yokluğu, insülin direnci ve yağ2,3,4saklamak için yeteneği gibi fenotipleri çeşitli yüzey balık farklıdır. Bununla birlikte, yüzey balığı ve gizliyor hala aynı türe aittir ve bu nedenle, interferon.
Hem morphotypes için, koşullar bir dizi rutin bakım ve üreme laboratuvar koşulları altında izin vermek için tanımlanmıştır5,6. Ancak, genetik değişiklikler, uygun embriyonik gelişimsel çalışmalar, ve melezlerin oluşturulması hala çeşitli nedenlerle zor. A. mexicanus öncelikle genetik yapıları enjeksiyon veya erken embriyonik gelişimsel süreçlerin izlenmesi gibi erken embriyonik aşamalarında sonraki deneyler için uygunsuz olan gece saatlerinde spawn. Buna ek olarak, yüzey ve mağara melez nesil doğal yumurtlama kullanarak zorlu, mağara Morfotiplerin değiştirilmiş bir sirkadiyen ritmi var beri7 sonuçta uygulanabilir ova üretimini etkiler. Başarılı, ancak invaziv, IVF prosedürleri diğer astyanax türleri için tarif edilmiştir, burada gamet üretim ve yumurtlama davranışı Hormonal enjeksiyonları kullanılarak astarlanmış olduğu,8,9. Daha az invaziv IVF prosedürleri (yani, hormonal preparatlar enjeksiyon olmadan manuel yumurtlama gamet elde) tarif edilmiştir ama mağara ve A. mexicanus yüzey Morfotiplerin arasındaki yumurtlama döngüsü farklılıkları dikkate almaz 6' ya kadar.
Diğer balık modeli organizmalar, zebrafish gibi, kolayca genetik olarak değiştirilebilir ve bir embriyonik düzeyde incelenebilir çünkü engelleri yukarıda belirtilen başarıyla çözüldü. Standartlaştırılmış üreme tekniklerinin uygulanması, in vitro fertilizasyon, ve sperm ağaloprezervasyon tüm zebra balığı ileri itti ve biyolojik bilimler modeli kullanımı katılaşmış10. Bu nedenle, bir. mexicanus bu teknikleri genişletmek daha bir model sistemi olarak güçlendirecektir.
Burada, biz a. mexicanus daha erişilebilir hale getirmek için yardımcı olacak IVF için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Biz uygun ova hormonal preparatlar enjeksiyon olmadan gün boyunca elde edilebilir, böylece gündüz geceleri balık ışık döngüleri kayması sağlayan bir üreme kurulum sunacak. Daha sonra ıVF için kullanılan ova ve Milt elde etmek için nasıl ayrıntılı bir açıklama sağlar. Bu yöntem normal çalışma saatleri boyunca embriyolar üretimini sağlayacak ve doğal yumurtlama embriyoları kullanarak daha fazla aşağı aşağı uygulamaları daha uygun hale getirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm yöntemler, Stowers Tıp Araştırmaları Enstitüsü 'nin kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıayuc) tarafından onaylanmıştır.
1. ışık döngüsü manipülasyon
- Birden fazla tank satırı içeren (Şekil 1) opak, tamamen kapalı (ışık koruma), akışlı su ürünleri sistemi içinde balık tankları ayarlayın.
Not: Şekil 1 ' de gösterildiği gibi akış sistemi, her bir tankın arka stand borusu üzerinden atık temizlemek için sistem suyu kullanır ve bir sıhhi drenaj içine boşaltır bir kartona akar. Bu deneyde, saat başına bir galon (ABD) su Döviz kuru bir damla emiter ile kullanıldı. - Her bir tankın sıcaklığını, astar işlemi sırasında sıcaklığı manuel olarak değiştirmek için kullanılan bağımsız bir ısıtma elemanı ile koruyun.
- Her biri ayrı photoperiods etkinleştirmek için bir şekilde ayrı satırları ayarlayın. Giriş veya kaçmak ışık önlemek için kapalı olabilir her satırda kapılar yükleyin.
Not: otomatik denetleyici balık en az rahatsızlık ile tüm photoperiods manipülasyon etkinleştirebilirsiniz. - Karanlık saatlerde erişim için kırmızı çalışma lambası ve karartma perdeleri ile raf donatın.
2. gamet koleksiyonu için fotoperiyodun ve emişli balık ayarlama
- İstenilen balıkları çıkarın (Şekil 2a) genel sistem rafları ve üreme rafları yerine 14 gün önce astar fotoperiod ayarlaması için izin.
Not: Bu balık yeni bir ortama boyunca uyum sağlamasına sağlar. - Balık 22,8 °C ' de (73 °F) bu dönemde yüklü su ısıtma sistemini kullanarak tutun. Normal fotoperiyodun 6 a.m. 8 p.m. ışık ve 8 p.m. için 6 a.m. karanlık. Işık döngüsü raf için, 10 p.m. için 12 p.m. ışık ve 12 p.m. için 10 p.m. zaman kronometre ayarlayarak fotoperiod vardiya raf içinde ışık güçler.
Not: erkekler ve kadınlar, doğal astar davranışlarını sağlamak için aynı tankta yer alır. Yumurtlama tankta yer alabilir iken, gamet aşamaları11piyasaya sürülürken balık hala in vitro fertilizasyon için kullanılabilir. - Balık acclimatied sonra, yumurtlama için hayvanlar emişli başlatmak5 olarak açıklandığı gibi Steps 2.3.1 için 2.3.5.
Not: Bu yordam toplam altı gün sürer. Bu süre içinde, yüklü bir su ısıtma sistemi kullanarak ova üretimi Prime için sıcaklık değiştirin. 50W su ısıtıcılar kullanarak ( malzeme tablosunabakın), sıcaklığa doğrudan ısıtıcı ayarlamak (ısıtıcı üzerinde ölçek Fahrenheit) her adımda protokolde verilen. Su tankının boyutuna ve akış hızına bağlı olarak, sıcaklık ayarı süresi farklılık gösterebilir. Bu deneyde, sıcaklık öğleden sonra ayarlandı ve sıcaklık denkleme sonraki 18 h devraldı.- 1. gün, sıcaklığı 22,8 °C (73 °F) ile 24,4 °C (76 °F) arasında yükseltin.
- 2. gün, sıcaklığı 24,4 °C (76 °F) ile 26,1 °C (79 °F) arasında yükseltin.
- 3 ve 4. günde, sıcaklığı 26,1 °C (79 °F) olarak tutun. Balık gün boyunca spawn hazır olacak ve ıVF gerçekleştirilebilir.
Not: bireysel balıklara bağlı olarak, kadınlar gün 3 ve/veya gün 4 spawn olabilir. Ova koleksiyonunun başarısına bağlı olarak gün 3 ve/veya gün 4 ' e kadar ova almaya çalışmanızı öneririz. - 5. gün, 26,1 °C (79 °F) ile 24,4 °C (76 °F) arası sıcaklığı azaltın.
- 6. gün, 24,4 °C (76 °F) ile 22,8 °C (73 °F) arası sıcaklığı azaltın.
Not: Bu sıcaklık döngüsünü yinelemeden önce 7 günlük bir boşluk verin. Bu bu fotoperiod içinde balık tutmaya devam etmek için bu zaman bu değiştirilen ışık döngüsü ayarlamak için balık tarafından gerekli toplam süreyi azaltacaktır tavsiye edilir.
3. kadın gamet koleksiyonu
- Bir nemlendirici oda oluşturmak ve toplama işlemi sırasında kurutmak için ova önlemek için çanak kapanması ve bir petri çanak kapak içine silmek nemlendirilmiş bir doku ekleyerek başlayın.
- Sonraki koleksiyon için bir kadın seçin. Büyük, çıkıntılı ağlarla Gravid balığı muhtemelen bu prosedür için en iyi seçim olacaktır (Şekil 2a).
Not: yetişkin A. mexicanuserkek ve kadın arasında ayırt etmek için, pamuk topu yöntemi kullanılmıştır12. - Bir dişi soğutulmuş suyu kullanarak immobilize ve onu nemlendirilmiş sünger hayvan tutucusu içinde fitil konumuna yerleştirin. Bunu 4 °C sistem suyuna en az 30 s ya da balık immobilize olana kadar (yani, Güneş hareketi kaybı, Ross ve Ross13 Ayrıntılar için bkz) yerleştirerek yapın.
Not: hızlı çalışma ve prosedür tamamlanıncaya kadar balık ısınma önlemek için deneyin. Bu periyodik parmaklar soğuk suya veya ek anestezi sunan eldivenli uçları daldırma dahil olabilir. Diğer anestezi yöntemleri (örn., MS-22213) de kullanılabilir. Stowers Medikal Araştırma Enstitüsü 'nün ıasuc yönergelerine göre, ova manuel toplanması, tam anestezi gerektirmeyen (örn. MS-222 ile) non-invaziv bir prosedür olarak kabul edilir. - Bir kez konumlandırılmış, su ile temas olarak hassas bir doku silme ile balıkların ventral tarafı leke etkinleştirmek için ova neden olacaktır.
- Dişi başparmak ve işaret parmağı arasında tutun. Parmaklarınızı hafifçe yuvarlarken, ürogenital açılış yönünde koelomik boşluğun lateral taraflarına hafifçe sıkın. Tek kullanımlık spatula kullanarak ifade ova toplayın.
- Bu ova nemlendirilmiş Petri tabak aktarın.
Not: belirli ebeveyn verileri gerekli değilse, ova çeşitli debriyajlar aynı çanak kombine edilebilir. Ova 24 °C ' de depolanabilir ve toplama işleminden sonra 30-60 dk içinde ıVF için kullanıldığında en iyisidir. - Koleksiyonundan sonra, yavaşça sistem suyu ile dolu bir kurtarma tankı balık dönün.
Not: gerektiğinde gelecekteki ova koleksiyonu için balıkları geri karanlık kabine deposuna yerleştirin.
4. erkek gamet koleksiyonu
- Koleksiyon için bir erkek seçin.
Not: erkek gamet kalitesi hiçbir dıştan görünür işaretler vardır. Ancak, balık bu yordamda kullanmadan önce görünümde sağlıklı görünmesi gerekir. Yetişkin A. mexicanuserkek ve kadın arasında ayırt etmek için, pamuk topu yöntemi kullanılmıştır12. - Bir erkek soğutulmuş su kullanarak immobilize ve nemlendirilmiş bir sünger hayvan tutucusu içinde fitil pozisyonda onu yerleştirin. En az 30 saniye veya balık immobilize olana kadar 4 °C sistem suyuna balık yerleştirerek immobilize (yani, Güneş hareketi kaybı, bkz Ross ve Ross13 Ayrıntılar için).
Not: hızlı çalışma ve prosedür tamamlanıncaya kadar balık ısınma önlemek için deneyin. Bu periyodik parmaklar soğuk suya veya ek anestezi sunan eldivenli uçları daldırma dahil olabilir. Diğer anestezi yöntemleri (örn., MS-22213) burada da kullanılabilir. Stowers Medikal Araştırma Enstitüsü 'nün ıasuc yönergelerine göre, manuel sperm toplama, tam anestezi gerektirmeyen (örn. MS-222 ile) non-invaziv bir prosedür olarak kabul edilir. - Su ile temas olarak hassas bir doku silmek ile balık ventral tarafında Blot Milt aktive edecektir.
- Bir kılcal tüpün ucunu ürogenital açılışta nazikçe yerleştirin.
- Başparmak ve önparmak ile balık tarafına nazik basınç uygulayarak expel Milt. Solungaçlara distal başlayın, ürogenital açılışa doğru hareket.
- Bir kapiller tüp sonunda Milt toplayın. Aspiratör tüpü kullanılarak nazik emiş gerekebilir. Milt ile atılmış olabilir herhangi bir dışkı kaçının.
- Milt 'yi boş bir 1,5 mL Santrifüjü tüpüne dağıtın ve sperm Extender E400 ' in iki katı hacmi ile seyreltin (bkz. malzeme tablosu). Buzdan devam et.
Not: belirli soy veri gerekli değilse birden fazla erkek Milt birlikte havuza alınabilir. Bu adım, birkaç saat boyunca Milt çalışma süresini uzatmak için kullanılabilir, ancak hemen döllenme için gerekli değildir. - Koleksiyonundan sonra, yavaşça sistem suyu ile dolu bir kurtarma tankı balık dönün.
Not: gerektiğinde gelecekteki sperm koleksiyonu için balık geri karanlık kabine tankı içine yerleştirin.
5. In vitro fertilizasyon
- Her stok için yeni bir pipet kullanarak, spermleri pipetleme ile karıştırın ve/veya tüpün içinde sperm olarak döllenmeden önce, saat içinde E400 çözüme yerleşebilir.
- Taze toplanan ova içine Milt veya uzatılmış Milt solüsyonu dağıtmak.
- Hızla gübreleme için sperm ve yumurta etkinleştirmek için debriyaj 1 mL sistem suyu ekleyin. Çanak içeriğini karıştırma veya ajitasyon kaçının ve 2 min fertilizasyon gerçekleşmesi için izin.
Not: karıştırma ve ajitasyon büyük ölçüde fertilizasyon oranlarını azaltır ve bu nedenle,14kaçınılmalıdır. - Eklemek E2 embriyo medya 2/3RD tam çanak doldurmak için.
Not: sonraki prosedüre bağlı olarak, embriyolar ya hemen kullanılabilir (örn.,15' den önce açıklandığı gibi genetik yapıların enjekte edilmesi için) veya embriyolar 5 DPF 'ye ulaşıncaya kadar 23 °c ' de E2 embryo medyasında inkübe edilebilir. Bu noktada sistem suyu kullanarak ana devridaim konut sistemine embriyolar aktarın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada sunulan protokol esas olarak önceden yayımlanan protokol6dayanmaktadır. Ancak, bir. mexicanus gece saatlerinde yumurtlar beri, biz çalışma saatleri bağımsız fotoperiyodun değiştirebilirsiniz Balık yetiştirme için bir konut raf tasarlanmış (Şekil 1). Balık ışığı döngüsü, üç adet tank içeren tam kapalı, akışlı bir su ürünleri sistemi içinde değiştirilir (Şekil 1). Her tank, astar işlemi sırasında sıcaklığı manuel olarak artırmak için kullanılan bağımsız bir ısıtma elemanı içerir. Bireysel raflar ayrı photoperiods koymak olabilir ve girme veya kaçmak ışık önlemek için kapalı olabilir. Tüm photoperiods ışık döngüsü raf tarafında konumlandırılmış otomatik bir denetleyici yoluyla manipüle edilebilir. Karanlık saatlerde erişim için raf kırmızı çalışma lambası ve karartma perdeleri ile donatılmıştır. A. mexicanus , 23-26 °c ' den itibaren sıcaklık artışından sonra16günde 1,5 °c ' lik bir artış ile yumurtlar. Karanlık dolaplarımıza bunu başarmak için her tankta dalgıç akvaryum ısıtıcıları kullandık (Şekil 1).
A. mexicanus başarılı bir IVF prosedürü için anahtar faktör toplanan ova kalitesidir. Gravid, büyük, çıkıntılı ağılı kadın balık en uygun ova serbest bırakmak muhtemeldir, hangi açık ve hatta görünüş olarak görünür (Şekil 2a-d). Toplanan Milt, genellikle 20-30 min (Şekil 2e) içinde döllenmiş embriyo gelişimi bu tür ova sonuçlarına ekleme. Döllenmeyen ova daha düzensiz ve opak (Şekil 2e) görünecek iken gelişimsel döngüsünün bir hücre aşamasına girmeden önce döllenmiş embriyo biraz daha saydam hale gelecek. Ortaya çıkan embriyolar ZIRC E2 embryo medyasında Petri yemekleriyle tutulur ve 14/10 bir ışık/karanlık döngüde 23 °C ' de inküte edilir. Embriyolar daha sonra, yetiştirme için 5 gün sonrası gübreleme sırasında ana sirkülasyon gövdesi sistemine aktarılır.
Tekniğin önemini göstermek için, nasıl göz boyutu ve vücut pigmentasyon gibi belirli özellikleri için melez phenoyping genetik temelinde deşifre yardımcı olabilir gösterir. Cavefish açıkça göz büyüklüğü ve vücut pigmentasyon yüzey balıklardan farklıdır. Bu özelliklerin genetik temelini anlamak için, Biz yüzey ve gizliyor (F0) ve hibrid F1 ve F2 nüfus IVF kullanarak elde fenotipik varyasyonu gözlemlemek için (Şekil 3) geçti. Gözlerinizin büyüklüğü, göz varlığının kısmen dominant bir özellik olduğunu belirten F1 jenerasyonunda daha küçüktür (Şekil 3). Yüzey-mağara F2 melez, biz göz boyutları geniş bir yelpazede elde, a. mexicanus göz boyutunu kontrol birden fazla loci olduğunu gösteren, bir niceliksel bir özellik yapma (Şekil 3). Başka bir örnek pigmentasyon olduğunu. Yüzey ve cavefish F1 hibrid gözlem, bu vücut pigmentasyon balık tam pigmentli olarak baskın bir özellik olduğu sonucuna varılabilir (Şekil 3). F2 üretimi, vücut pigmentasyon tekrar varyasyon nicel bir özellik doğru işaret ediyor. Bu fenotip verilerin sıralama verileriyle kombinasyonu, bu fenotiplerden sorumlu olan genetik lokasyonunu ortaya çıkarabilir. Bu F2 nüfusu çeşitli özelliklerin genetik temelini anlamak için iyi bir kaynaktır ve bu tür nüfusun daha önce bu özellikleri incelemek için kullanılmıştır17,18,19. Standart bir ıVF tekniği büyük ölçüde melez nesil düzene, loci bu tür özellikleri kontrol ve bize bazı fenotipleri bazı habitatlar ve başkalarına adaptif dezavantajlı olduğunu anlamak yardımcı genetik haritalama sağlar.
Şekil 1 : Raf tasarım gün/gece döngüleri vardiya Bir mexicanus. (a) Bu raf sisteminin genel kurulumu fotoperiod manipülasyon sağlar, kapılar kapalı olduğunda gün saat boyunca gece zaman bir simülasyon vererek, ve raf ışıkları kapatılır. (b) balık ova olgunlaşma uyarmak için astar dalgıç ısıtıcılar kullanılarak elde edilir ( malzeme tablosunabakın) ayrı olarak ayarlanabilir tek tanklarda yüklü (kırmızı oklar). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Ova koleksiyonu için uygun kadın örnekleri ve uygulanabilir ve olmayan ova temsili Illustration. (a) Gravid, büyük, çıkıntılı göbek ile kadın balık daha manuel ova toplama için uygundur (b) akıcı şekilli karın ile kadın. (c) uygun ova (yani, döllenmiş zaman erilen embriyolar üreten ova) kendi net, hatta görünüm ile tespit edilebilir, iken (yani, ova, döllenmiş olarak uygulanabilir embriyo üreten değil), içinde gösterildiği gibi (d), bulutlu, düzensiz var Görünüm. (e) başarılı döllendikten sonra, uygun embriyolar daha saydam hale gelir ve bir hücre aşamasına girdikten sonra döllenmez ova (kırmızı oklar) yavaşça çürüecek. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : Göz büyüklüğü ve vücut pigmentasyon Özellikleri Genetik Analizi. Ebeveyn (F0) yüzey balık (sol üst) ve gizliyor (sağ üst), F1 melez (ikinci satır) ve F2 melez resimleri gösteren Pedigree. F1 balık ara göz boyutuna sahiptir ve F2 balık iki morfolojik özellikleri geniş bir varyasyon gösterirken tam pigmentli: göz boyutu ve pigmentasyon. Bu figürün temelindeki tüm orijinal veriler, http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1365 adresindeki Stowers orijinal veri deposundan erişilebilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IVF zebrafish gibi birçok farklı model organizmalar için standartlaştırılmış bir yöntemdir iken, a. mexicanus için mevcut protokoller bu türün doğal olarak gece saat6sırasında yumurtalar dikkate almaz. Bu gizliyor ve yüzey balıklarının sirkadiyen ritimleri oldukça büyük ölçüde farklılık göz önüne alındığında, ova olgunlaşma döngüsü de mağara ve yüzey morphotypes arasında farklılık gösterir. A. mexicanus yüzeyi için hazırlama sıcaklıkları ve süreleri de12incelenirken, gizliyor kendi yumurtlama davranışı ve olgunlaşma döngüsünde farklılık gösterebilir. Hibrid üretimin konvansiyonel yöntemleri bu nedenle çok zorlu ve belirsiz bir mağara morphotype içinde sirkadiyen ritim kaybı nedeniyle olan A. mexicanus7, bu balık değişen yumurtlama süreleri sonuçlanır. Photoperiod kaydırarak, biz iki morphotypes arasında nadir doğal yumurtlama olaylara güvenmek zorunda kalmadan zaman spesifik hibrid embriyo sağlayabilir. Mağara ve yüzey balıklarını ayrı tutmak da agresif yüzey morphs üreme üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olmasını önler.
Bazı sınırlamalar bu yöntemle ova kalitesinde varyasyonlar gibi var. Olgun ova ile bir dişi (yüzey veya cavefish) kimliği önemsiz değildir ve balık davranışlarını dikkatli gözlemler gerektirir. Genellikle, yumurtlama için hazır Gravid kadın daha büyük ağlı ve art arda alt tank yüzeyi veya embriyo toplama tuzağı20karşı fırça olacaktır.
Biz sperm kalitesi tüm gün/gece döngüsü boyunca tutarlı olduğunu gözlemledik. Başarılı ıVF kritik adım (döllenmiş embriyo üreten açısından başarılı) kaliteli elde edilir, uygun ova. Bu nedenle, doğal spawn hakkında olan balık ova toplamak son derece önemlidir (Şekil 2a). Ova toplandıktan sonra, kalitesini incelemek için bir Diseksiyon mikroskobu altında gözlemlenebilir. Gece boyunca uygun ova koleksiyonu, ancak, uygunsuz ve araştırmacı için zorlu. Biz burada mevcut kurulum ova olgunlaşma döngüsünün kayması için izin verir, böylece ıVF normal çalışma saatleri sırasında akım uygulama için senkronize embriyolar oluşturmak için kullanılabilir.
Milt (örneğin, zebra balığı21' de tarif edildiği gibi) ağakoprezervasyon ilerlemesi ile, IVF ortaya çıkan model sistemi a. mexicanusiçin genetik hatları kurmak ve sürdürmek için güçlü bir araç haline gelecek. Genetik modifikasyon15 ve morpholino temelli17, bu prosedürler için yöntemler ile birlikte farklı için adaptasyon genetik ve gelişimsel temelleri çalışma metodolojik platformu sağlayacaktır A. mexicanushabitatları.
Özetle, burada sunulan protokol genetik yapıları enjeksiyon veya erken embriyolojik fenotürleri okuyan gibi diğer akım uygulamaları için A. mexicanus senkronize embriyo üretimini sağlayacaktır. Protokolün ana gücü, QTL (niceliksel Özellik loci) analizi ile yüzey balığı ile gizliyor arasındaki fenotipi farklılıkları genetik olarak eşlemek için kullanılabilecek yüzey-mağara melezlerin verimli üretimini sağlar. Birlikte alınan, ıVF için gündüz uygun ova elde biyolojik bilimler farklı alanlarda gelecekteki çeşitli çalışmalar için yararlı olacak güçlü bir tekniktir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar video üretim desteği için Philippe Noguera ve Kimberly Bland teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar aynı zamanda hayvancılığa yönelik Stowers Enstitüsü 'nün tüm Aquatics takımını kabul etmek ister. Bu çalışma DPB ve NR 'a kurumsal finansman tarafından destekleniyordu. NR, Edward Mallinckrodt Vakfı ve JDRF tarafından destekleniyordu. RP, Deutsche Forschungsgemeinschaft 'dan (PE 2807/1-1) bir hibe tarafından destekleniyordu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Centrifuge Tube | Eppendorf | #22364111 | |
| 100 mm Petri Dishes | VWR International | #25384-302 | |
| Aspirator Tube | Drummond | #2-000-000 | |
| Calibrated 1-5 µL Capillary Tubes | Drummond | #2-000-001 | |
| Dispolable Spatulas | VWR International | #80081-188 | |
| HMA-50S 50W Aquatic Heaters | Finnex | HMA-50S | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | #3123000063 | |
| P1000 Pipette Tips | Thermo Scientific | #2079E | |
| Sanyo MIR-554 incubator | Panasonic Health Care | MIR-554-PA | |
| Sperm Extender E400 | 130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glucose, 30 mM HEPES Adjust to pH 7.9 with 5M KOH and filter sterilize. Solution can be stored at 4 ?C for up to 6 months. |
||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| System Water | Deionized water supplemented with Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] to reach a specific conductance of 800 µS/cm. Water quality parameters are maintained within safe limits (Upper limit of total ammonia nitrogen range, 1 mg/L; upper limit of nitrite range, 0.5 mg/L; upper limit of nitrate range, 60 mg/L; temperature, 22 °C; pH, 7.65; dissolved oxygen 100 %) | ||
| Tissue Wipes | Kimberly-Clark Professional | #21905-026 | |
| ZIRC E2 Embryo Media | 15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 µM KH2PO4, 50 µM Na2HPO4, 1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. Adjust pH to 7.2 to 7.4 using 2 N hydrochloric acid. Filter sterilize. Stored at room temperature for a maximum of two weeks. |
References
- Jeffery, W. R. Regressive evolution in Astyanax cavefish. Annual Review Genetics. 43, 25-47 (2009).
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genetics. 5, e1000326 (2009).
- Riddle, M. R., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555, 647-651 (2018).
- Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441 (2), 297-304 (2018).
- Borowsky, R. Breeding Astyanax mexicanus through Natural Spawning. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Borowsky, R. In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Beale, A., et al. Circadian rhythms in Mexican blind cavefish Astyanax mexicanus in the lab and in the field. Nature Communications. 4, 2769 (2013).
- Sato, Y., Sampaio, E. V., Fenerich-Verani, N., Verani, J. R. Reproductive biology and induced breeding of two Characidae species (Osteichthyes, Characiformes) from the São Francisco River basin, Minas Gerais, Brazil. Revista Brasileira Zoology. 23 (1), 267-273 (2006).
- Yasui, G. S., et al. Improvement of gamete quality and its short-term storage: an approach for biotechnology in laboratory fish. Animal. 9 (3), 464-470 (2015).
- Westerfield, M. The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2000).
- Simon, V., Hyacinthe, C., Retaux, S. Breeding behavior in the blind Mexican cavefish and its river-dwelling conspecific. PLoS One. 14 (2), e0212591 (2019).
- Borowsky, R. Determining the Sex of Adult Astyanax mexicanus. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Ross, L. G., Ross, B. Anaesthetic and Sedative Techniques for Aquatic Animals. , 3rd edn, Wiley-Blackwell. (2008).
- Matthews, J. L., et al. Changes to Extender, Cryoprotective Medium, and In Vitro Fertilization Improve Zebrafish Sperm Cryopreservation. Zebrafish. 15 (3), 279-290 (2018).
- Stahl, B. A., et al. Stable transgenesis in Astyanax mexicanus using the Tol2 transposase system. Developmental Dynamics. , 1-9 (2019).
- Elipot, Y., Legendre, L., Pere, S., Sohm, F., Retaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11, 291-299 (2014).
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genetics. 5 (1), e1000326 (2009).
- Jeffery, W. R. Chapter 8. Evolution and development in the cavefish Astyanax. Current Topics in Developmental Biology. 86, 191-221 (2009).
- Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C., Borowsky, R. Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus. Current Biology. 17 (5), 452-454 (2007).
- Hinaux, H., et al. A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish. Zebrafish. 8, 155-165 (2011).
- Draper, B. W., Moens, C. B. A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiment. (29), (2009).
