Summary
Provrörsbefruktning är en vanligt förekommande teknik med en mängd olika modellorganismer för att bibehålla laboratorie populationer och producera synkroniserade embryon för nedströmsapplikationer. Här presenterar vi ett protokoll som implementerar denna teknik för olika populationer av den mexikanska Tetra fisken, Astyanax Auktor.
Abstract
Astyanax Auktor växer fram som modellorganism för en mängd olika forskningsområden inom biologisk vetenskap. En del av den senaste framgången för denna benfisk fiskarter är att den besitter interfertil grotta och flod-bostad populationer. Detta möjliggör genetisk mappning av ärftliga egenskaper som fastställdes under anpassningen till de olika miljöerna i dessa populationer. Medan denna art kan upprätthållas och föds upp i labbet, det är utmanande att både få embryon under dagtid och skapa hybrid embryon mellan stammar. In vitro-fertilisering (IVF) har använts med en mängd olika modellorganismer för att framgångsrikt och upprepade gånger föda upp djur i labbet. I detta protokoll visar vi hur, genom att acklimatisera A. Auktor till olika ljus cykler i kombination med förändringar i vattentemperaturen, kan vi flytta avel cykler till en vald tid på dagen. Därefter visar vi hur man identifierar lämplig föräldra fisk, samla friska könsceller från män och kvinnor, och producera livskraftiga avkomma med hjälp av IVF. Detta gör att relaterade procedurer såsom injektion av genetiska konstruktioner eller utvecklings analys ska inträffa under normal arbetstid. Dessutom kan denna teknik användas för att skapa hybrider mellan grottan och ytbostadens populationer, och därigenom möjliggöra studiet av den genetiska grunden för fenotypiska anpassningar till olika miljöer.
Introduction
Under de senaste åren har Astyanax Auktor blivit en modellorganism inom olika områden såsom utvecklingsbiologi, evolutionsbiologi, beteende bio logi och fysiologi1,2,3,4 . Det unika med detta system kommer från denna art med flera morfotyper som har anpassats till mycket olika miljöer. Den ytlevande morfotypen lever i floder där det finns stor biologisk mångfald och massor av matkällor för fisken. I motsats, grottan morfotyper av A. Auktor, den Cavefish, bor i grottor där biologisk mångfald, matkällor, och syre drastiskt minskat1. Cavefish skiljer sig från ytan fisk i en mängd olika fenotyper såsom frånvaro av ögon och pigmentering, insulinresistens, och förmågan att lagra fett2,3,4. Men, ytfisk och Cavefish fortfarande tillhör samma art och är därför interfertil.
För båda morfotyperna har en uppsättning villkor definierats för att möjliggöra rutinmässigt underhåll och avel under laboratorieförhållanden5,6. Emellertid, genetiska modifieringar, ordentliga embryonala utvecklingsstudier, och skapandet av hybrider är fortfarande utmanande av flera skäl. A. Auktor leker i första hand under natt timmar vilket är besvärligt för efterföljande experiment på tidiga embryonala stadier som injektion av genetiska konstruktioner eller övervakning av tidiga embryonala utvecklingsprocesser. Dessutom är generering av yt-och grotthybrider utmanande med naturlig lek, eftersom grottmorfotyperna har en förändrad dygnsrytm7 som i slutändan påverkar produktionen av livskraftiga ägg. Framgångsrika, men invasiva, IVF-förfaranden har beskrivits för andra Astyanax arter, där könscell produktion och lekbeteende primade med hormonella injektioner8,9. Mindre invasiva IVF-procedurer (dvs. att få könsceller från manuell lek utan injektion av hormonella preparat) har beskrivits men anser inte skillnaderna i lek cykeln mellan grotta och ytmorfotyper av A. Auktor 6.
Andra fisk modell organismer, som till exempel Zebrafisken, kan lätt modifieras genetiskt och studeras på embryonal nivå, eftersom de ovan nämnda hindren har lösts på ett framgångsrikt sätt. Implementering av standardiserade avelsmetoder, in vitro-fertilisering, och spermie frysförvaring har alla drivit zebrafisk framåt och stelnat modellens användning i de biologiska vetenskaperna10. Därför, utvidga dessa tekniker till a. Auktor kommer att ytterligare stärka det som ett modellsystem.
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för IVF som kommer att bidra till att göra en. Auktor mer tillgänglig. Vi kommer att presentera en avel setup som gör det möjligt att flytta ljus-cykler av fisken från dagtid till nattetid så att livskraftiga ägg kan erhållas under dagtid utan injektion av hormonella preparat. Vi ger sedan en detaljerad beskrivning av hur du skaffar de ägg och milt som används för IVF. Denna metod kommer att möjliggöra produktion av embryon under normal arbetstid och göra ytterligare tillämpningar i senare led mer genomförbara jämfört med användning av embryon från naturlig lek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) av Stowers Institute för medicinsk forskning.
1. ljus cykel manipulation
- Ställ upp fisktankar i ett ogenomskinligt, fullständigt bifogat (ljus skydd), genomflödesgenom vattenbrukssystem som innehåller flera rader med tankar (figur 1).
Obs: Genomflödessystemet som visas i figur 1 använder system vatten för att spola avfall genom det bakre stativ röret i varje tank och rinner ut i en sump som mynnar ut i en sanitär avlopp. I detta experiment, en vatten växelkurs på en gallon (US) per timme genom en dropp EMITTER användes. - Håll temperaturen på varje tank med ett oberoende värmeelement som används för att manuellt ändra temperaturen under grundningen.
- Ställ in enskilda rader på ett sätt för att aktivera separata foto perioder i varje. Installera dörrar på varje rad som kan stängas för att förhindra ljus från att komma in eller fly.
Obs: den automatiserade styrenheten kan möjliggöra manipulering av alla foto perioder med minsta störningen till fisken. - Utrusta racket med rött arbetsljus och mörkläggningsgardiner för åtkomst under mörka timmar.
2. Justera fotoperiod och priming fisk för könscell Collection
- Ta bort önskad fisk (figur 2A) från de allmänna system hållarna och placera den i avels ställningar för att möjliggöra justering av fotoperioden 14 dagar före grundningen.
Obs: Detta gör det möjligt för fisken att acklimatisera sig till en ny miljö. - Förvara fisken vid 22,8 ° c (73 ° f) under denna period med hjälp av det installerade akvatiska värmesystemet. Den normala fotoperioden är från 6 a.m. till 8 p.m. ljus och 8 p.m. till 6 är mörkt. För ljus cykel rack, flytta fotoperioden till 10 p.m. till 12 p.m. ljus och 12 p.m. till 10 PM mörkt genom att justera timern som driver ljuset i racket.
Obs: män och kvinnor är inhysta i samma tank för att möjliggöra naturliga priming beteenden att äga rum. Medan leken kan äga rum i tanken, kan fisken fortfarande användas för provrörsbefruktning sedan könsceller släpps i etapper11. - När fisken är acklimatiserad, börja priming djuren för lek5 som beskrivs i steg 2.3.1 till 2.3.5.
ANMÄRKNINGAR: den här proceduren tar totalt sex dagar. Under denna tid, ändra temperaturen för att Prime äggproduktionen med hjälp av en installerad akvatiska värmesystem. Med hjälp av 50 w akvatiska värmare (se tabell över material), Ställ in värmaren direkt till temperaturen (skala på värmaren är i Fahrenheit) som anges i protokollet vid varje steg. Beroende på storleken på tanken och genomflödesgraden av vattnet, kan tiden för temperaturjustering variera. I detta experiment, temperaturen justerades vid middagstid och temperaturequilibration tog över nästa 18 h.- På dag 1, Höj temperaturen från 22,8 ° c (73 ° f) till 24,4 ° c (76 ° f).
- På dag 2 höjer du temperaturen från 24,4 ° c (76 ° f) till 26,1 ° c (79 ° f).
- På dag 3 och 4, hålla temperaturen vid 26,1 ° c (79 ° f). Fisk kommer att vara redo att leka under dagen och IVF kan utföras.
Observera: beroende på den enskilda fisken kan honor leka dag 3 och/eller dag 4. Vi rekommenderar att du försöker få OVA på dag 3 och/eller dag 4 beroende på framgången av OVA-kollektionen. - På dag 5 sänker du temperaturen från 26,1 ° c (79 ° f) till 24,4 ° c (76 ° f).
- På dag 6, Sänk temperaturen från 24,4 ° c (76 ° f) till 22,8 ° c (73 ° f).
Obs: ge en 7-dagars mellanrum innan du upprepar denna temperaturcykel. Det rekommenderas att fortsätta att hålla fisken i denna fotoperiod eftersom detta kommer att minska den totala tiden som behövs av fisken för att anpassa sig till denna skiftade ljus cykel.
3. kvinnlig könscell samling
- Börja med att sätta in en fuktad vävnad torka i en petriskål och stänga skålen för att skapa en fuktad kammare och förhindra ägg från uttorkning under insamlingsprocessen.
- Nästa Välj en hona för insamling. Dräktig fisk med stora, utskjutande abdomens kommer sannolikt att vara det bästa valet för detta förfarande (figur 2A).
Notera: för att skilja mellan manlig och kvinnlig av vuxen människa A. Auktor, användes bomull klumpa ihop sig metoden12. - Immobilize en hona med kallt vatten och placera henne i ryggläge i en fuktad svampdjur hållare. Gör det genom att placera fisken i 4 ° c system vatten i minst 30 s eller tills fisken är immobiliserade (dvs förlust av Gill rörelse, se Ross och Ross13 för detaljer).
Obs: arbeta snabbt och försök att undvika att värma fisken tills förfarandet är slutfört. Detta kan innefatta regelbundet doppa de handskar tips av fingrarna i kallt vatten eller erbjuda extra anestesi. Andra anestesi metoder (t. ex. MS-22213) kan också användas. Enligt IACUC riktlinjer för Stowers Institute for Medical Research, manuell insamling av ägg anses vara en icke-invasiv förfarande, som inte kräver fullständig anestesi (t. ex. genom MS-222). - När placerad, blot den ventrala sidan av fisken med en delikat vävnad torka som kontakt med vatten kommer att orsaka ägg att aktivera.
- Håll honan mellan tummen och pekfingret. Pressa försiktigt mot de laterala sidorna av coelomic hålighet i riktningen av urogenitala öppningen medan rulla fingrarna något. Samla in uttryckta ägg med hjälp av en engångsspatel.
- Överför dessa ägg till den fuktade petriskål.
Obs: flera kopplingar av ägg kan kombineras i samma maträtt om specifika föräldraskap data inte behövs. Äggen kan förvaras vid 24 ° c och är bäst när de används för IVF inom 30-60 min efter uppsamling. - Efter insamling, försiktigt tillbaka fisken till en återvinnings tank fylld med system vatten.
Notera: placera fisken tillbaka i mörkt skåp tank för framtida OVA samling vid behov.
4. manlig könscell samling
- Välj en hane för samling.
Obs: det finns inga utåt synliga tecken på manlig könscell kvalitet. Emellertid, fisk bör visas hälsosamt i utseende före användning i detta förfarande. För att skilja mellan manlig och kvinnlig av vuxen människa A. Auktor, användes bomull klumpa ihop sig metoden12. - Immobilize en hane med kallt vatten och placera honom i ryggläge i en fuktad svampdjur hållare. Immobilize genom att placera fisken i 4 ° c system vatten i minst 30 sekunder eller tills fisken är immobiliserade (dvs förlust av Gill rörelse, se Ross och Ross13 för detaljer).
Obs: arbeta snabbt och försök att undvika att värma fisken tills förfarandet är slutfört. Detta kan innefatta regelbundet doppa de handskar tips av fingrarna i kallt vatten eller erbjuda extra anestesi. Andra anestesi metoder (t. ex. MS-22213) kan också användas här. Enligt IACUC riktlinjer för Stowers Institute for medicinsk forskning, manuell insamling av spermier anses vara en icke-invasiv förfarande, som inte kräver fullständig anestesi (t. ex. genom MS-222). - Blot den ventrala sidan av fisken med en delikat vävnad torka som kontakt med vatten kommer att aktivera milt.
- Placera försiktigt änden av ett kapillärrör vid urogenitala öppning.
- Utvisa milt genom att applicera lätt tryck på sidorna av fisken med tummen och pekfingret. Börja distalt till gälarna, flyttar mot urogenitala öppningen.
- Samla upp milt i slutet av ett kapillärrör. Försiktig sugning kan vara nödvändigt med hjälp av en rökrörs röret. Undvika avföring som kan utvisas med milt.
- Dispensera milt i ett tomt 1,5 mL centrifugerör och späd med dubbelt så mycket sperma förlängare E400 (se tabell över material). Håll på is.
Observera: milt från flera hanar kan slås samman om specifika föräldraskap data inte behövs. Detta steg kan användas för att förlänga arbetstiden för milt i flera timmar, men det krävs inte för omedelbar befruktning. - Efter insamling, försiktigt tillbaka fisken till en återvinnings tank fylld med system vatten.
Notera: placera fisken tillbaka i mörka skåp tanken för framtida spermasamling vid behov.
5. in vitro-fertilisering
- Använd en ny pipett för varje bestånd, blanda spermierna genom att Pipettera och/eller agitera sidan av röret innan gödsling som spermier i milt kan bosätta sig i E400 lösningen över tiden.
- Fördela milt eller förlängd milt till den nyinsamlade ägg lösningen.
- Tillsätt snabbt 1 mL system vatten till kopplingen för att aktivera spermier och ägg för gödsling. Undvik att blanda eller agitera skålen innehåll och tillåta 2 min för befruktning att inträffa.
Anmärkning: blanda och agitera kraftigt minskar fertilisering priser och bör därför undvikas14. - Lägg E2 embryo media att fylla skålen 2/3RD full.
Anmärkning: beroende på det efterföljande förfarandet kan embryon antingen användas direkt (t. ex. för injektion av genetiska konstruktioner enligt beskrivningen före15) eller embryon kan inkuberas i E2-Embryomedia vid 23 ° c tills de når 5 DPF. Vid denna punkt överföra embryon till de viktigaste recirkulerande bostäder systemet med hjälp av system vatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det protokoll som presenteras här bygger huvudsakligen på ett tidigare offentliggjort protokoll6. Men eftersom a. Auktor leker under natt timmar, konstruerade vi ett hölje för fisk avel som kan ändra fotoperioden oberoende av arbetstid (figur 1). Fisk ljus cykeln ändras inom ett helt slutet vattenbrukssystem som innehåller tre rader med tankar (figur 1). Varje tank innehåller ett oberoende värmeelement som används för att manuellt öka temperaturen under priming processen. Enskilda hyllor kan sättas på separata foto perioder och kan stängas för att förhindra ljus från att komma in eller fly. Alla foto perioder kan manipuleras genom en automatiserad styrenhet placerad på sidan av ljus cykelhållaren. För åtkomst under mörka timmar är racket utrustad med rött arbetsljus och mörkläggningsgardiner. A. Auktor leker efter en temperaturökning från 23-26 ° c med en ökning på 1,5 ° c per dag16. För att uppnå detta i våra mörka skåp, använde vi dränkbara akvarium värmare i varje tank (figur 1).
Den viktigaste faktorn för en lyckad IVF förfarande i a. Auktor är kvaliteten på de insamlade ägg. Dräktig, kvinnlig fisk med stora, utskjutande abdomens är mest benägna att släppa livskraftiga ägg, som verkar tydliga och även i utseende (figur 2A-d). Lägga den insamlade milt till sådana ägg resultat i utvecklingen av befruktade embryon vanligtvis inom 20-30 min (figur 2e). Livskraftiga befruktade embryon kommer att bli något mer genomskinliga innan en cell skede av utvecklingscykeln medan obefruktad ägg kommer att visas mer ojämn och ogenomskinlig (figur 2e). Resulterande embryon hålls i petriskålar i ZIRC E2 embryo media och inkuberas vid 23 ° c i en 14/10 ljus/mörker cykel. Embryon överförs sedan till det huvudsakliga cirkulerande bostads systemet på 5 dagar efter befruktning för uppfödning.
För att demonstrera vikten av tekniken, visar vi hur fenotypning av hybrider för specifika egenskaper som ögon storlek och kroppspipigmentering kan hjälpa till att dechiffrera sin genetiska grund. Cavefish skiljer sig tydligt från ytan fisk i deras öga storlek och kropp pigmentering. För att förstå den genetiska grunden för dessa egenskaper, korsade vi yt-och Cavefish (F0) och genererade hybrid F1-och F2-populationer med IVF för att iaktta den fenotypiska variation som erhållits (figur 3). Storleken på ögonen är mindre i F1-generationen som indikerar att närvaron av ögon är en delvis dominerande drag (figur 3). I ytan-grotta F2 hybrider, vi får ett brett spektrum av ögon storlekar, vilket indikerar att det finns flera loci att kontrollera ögon storlek i a. mexicanus, vilket gör det till ett kvantitativt drag (figur 3). Ett annat exempel är pigmentering. Observera F1 hybrid av yta och Cavefish, kan man dra slutsatsen att kroppen pigmentering är en dominerande egenskap som fisken är fullt pigmenterade (figur 3). I F2-generationen pekar variationen i kroppspigmentering igen mot ett kvantitativt drag. Kombination av dessa fenotypiska data med sekvenserings data kan avslöja underliggande genetisk loci ansvarig för dessa fenotyper. Dessa F2 populationer är en bra resurs för att förstå den genetiska grunden för olika egenskaper och sådana populationer har använts tidigare för att studera dessa egenskaper17,18,19. En standardiserad IVF-teknik kan avsevärt effektivisera generering av hybrider, möjliggör genetisk kartläggning av loci kontrollera sådana egenskaper och hjälper oss att förstå hur vissa fenotyper är ofördelaktiga i vissa livsmiljöer och adaptiva i andra.
Figur 1 : Design av rack för att skifta dag/natt cykler av A. Auktor. (a) den allmänna inställningen av detta racksystem tillåter fotoperiod manipulation, vilket ger en simulering av nattetid under dagen timmar när dörrarna är stängda, och hyllan lamporna är avstängda. (b) priming fisken för att stimulera ägg mognad uppnås genom att använda dränkbara värmare (se tabell över material) installeras i enskilda tankar som kan justeras separat (röda pilar). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Exempel på lämpliga hondjur för ägg samling och representativ illustration av livskraftiga och olönsamma ägg. (a) dräktig, kvinnlig fisk med stora, utskjutande abdomens är mer lämpade för manuell OVA samling än (b) Honor med en strömlinjeformad formade buken. c) livskraftiga ägg (dvs. ägg som producerar livskraftiga embryon när de befruktas) kan identifieras genom deras tydliga, jämna utseende, medan olivskraftiga ägg (dvs. ägg som inte producerar livskraftiga embryon när de befruktas), som visas id, har en grumlig, ojämn Utseende. (e) efter framgångsrik befruktning, livskraftiga embryon blir mer genomskinliga och ange en cell skede medan Obefruktade ägg (röda pilar) kommer långsamt förfalla. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Genetisk analys av ögonstorlek och kroppspigmentering egenskaper. Stamtavla som visar bilder på föräldra (F0) ytfisk (överst till vänster) och Cavefish (överst till höger), F1 hybrider (andra raden) och F2 hybrider. F1 Fish har mellanliggande ögon storlek och är fullt pigmenterade medan F2 fisk visar en bred variation i de två morfologiska egenskaper: öga storlek och pigmentering. Alla ursprungliga data som är underliggande denna siffra kan nås från Stowers ursprungliga dataarkivet på http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1365. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medan IVF är en standardiserad metod för många olika modellorganismer som Zebrafish, befintliga protokoll för a. Auktor tar inte hänsyn till att denna art naturligt leker under natten timmar6. Med tanke på att Cavefish och ytan fisk skiljer sig ganska drastiskt i deras dygnsrytm, mogningen cykel av ägg skiljer sig också mellan grottan och ytan morfotyper. Medan mellanlagringstemperaturer och tider för Surface A. Auktor är väl studerade12, kan Cavefish skilja sig i deras lekbeteende och mognad cykel. Konventionella metoder för Hybrid produktion är därför mycket utmanande och osäkra på grund av förlusten av dygnsrytmen i grottan morfotyp av A. Auktor7, vilket resulterar i förändrade lek tider av dessa fiskar. Genom att flytta fotoperioden, kan vi ge tid specifika hybrid embryon utan att behöva förlita sig på sällsynta naturliga lek händelser mellan de två morfotyper. Att hålla grottan och ytfisken separerar förhindrar också aggressiva ytmorfer från att ha en negativ effekt på avel.
Vissa begränsningar finns med denna metod såsom variationer i ägg kvalitet. Identifiering av en hona (yta eller Cavefish) med mogna ägg är inte trivialt och kräver noggranna observationer av fisk beteende. I allmänhet har dräktiga honor som är redo för leken större abdomens och kommer upprepade gånger att borsta mot botten tankens yta eller embryosamlingsfällan20.
Vi observerade att kvaliteten på spermier är konsekvent under hela dag/natt cykel. Det kritiska steget av framgångsrika IVF (framgångsrik när det gäller att skapa befruktade embryon) är att få god kvalitet, livskraftiga ägg. Därför är det oerhört viktigt att samla in ägg från fisk som är på väg att leka naturligt (figur 2A). När äggen samlas in, kan de observeras under en dissektion Mikroskop för att undersöka kvaliteten. Insamlingen av livskraftiga ägg under natten är dock obekvämt och utmanande för forskaren. Den inställning som vi presenterar här möjliggör förskjutning av mogningscykeln av ägg, så IVF kan användas för att generera synkroniserade embryon för nedströms ansökan under normal arbetstid.
Med befordran av kryopreservation av milt (e.g., som det beskrivas i zebrafiskar21), kommer IVF att bli ett kraftfullt verktyg för att etablera och underhålla genetiska linjer för det framväxande modell systemet a. Auktor. I kombination med metoder för genetisk modifiering15 och morpholino-baserade knockdown17, dessa förfaranden kommer att ge metodologisk plattform för att studera den genetiska och utvecklingsmässiga underbyggnad av anpassningar till olika livsmiljöer i A. Auktor.
Sammanfattnings, det protokoll som presenteras här kommer att möjliggöra produktion av synkroniserade embryon av A. Auktor för andra nedströms tillämpningar, såsom injektion av genetiska konstruktioner eller studera tidiga embryologiska fenotyper. Den största styrkan i protokollet är att det möjliggör effektiv produktion av ytgrotta hybrider som kan användas för att genetiskt kartlägga fenotypiska skillnader mellan ytfisk och Cavefish genom QTL (kvantitativ drag loci) analys. Sammantaget, få livskraftiga ägg under dagtid för IVF är en kraftfull teknik som kommer att vara fördelaktigt för en rad framtida studier inom olika områden av biologisk vetenskap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna skulle vilja tacka Philippe Noguera och Kimberly bland för deras stöd på videoproduktion. Författarna skulle också vilja erkänna hela Aquatics team av Stowers Institutet för djurhållning. Detta arbete stöddes av institutionell finansiering till DPB och NR. NR stöddes av Edward Mallinckrodt Foundation och JDRF. RP stöddes av ett bidrag från Deutsche Forschungsgemeinschaft (PE 2807/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Centrifuge Tube | Eppendorf | #22364111 | |
| 100 mm Petri Dishes | VWR International | #25384-302 | |
| Aspirator Tube | Drummond | #2-000-000 | |
| Calibrated 1-5 µL Capillary Tubes | Drummond | #2-000-001 | |
| Dispolable Spatulas | VWR International | #80081-188 | |
| HMA-50S 50W Aquatic Heaters | Finnex | HMA-50S | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | #3123000063 | |
| P1000 Pipette Tips | Thermo Scientific | #2079E | |
| Sanyo MIR-554 incubator | Panasonic Health Care | MIR-554-PA | |
| Sperm Extender E400 | 130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glucose, 30 mM HEPES Adjust to pH 7.9 with 5M KOH and filter sterilize. Solution can be stored at 4 ?C for up to 6 months. |
||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| System Water | Deionized water supplemented with Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] to reach a specific conductance of 800 µS/cm. Water quality parameters are maintained within safe limits (Upper limit of total ammonia nitrogen range, 1 mg/L; upper limit of nitrite range, 0.5 mg/L; upper limit of nitrate range, 60 mg/L; temperature, 22 °C; pH, 7.65; dissolved oxygen 100 %) | ||
| Tissue Wipes | Kimberly-Clark Professional | #21905-026 | |
| ZIRC E2 Embryo Media | 15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 µM KH2PO4, 50 µM Na2HPO4, 1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. Adjust pH to 7.2 to 7.4 using 2 N hydrochloric acid. Filter sterilize. Stored at room temperature for a maximum of two weeks. |
References
- Jeffery, W. R.
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genetics. 5, e1000326 (2009).
- Riddle, M. R., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555, 647-651 (2018).
- Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441 (2), 297-304 (2018).
- Borowsky, R. Breeding Astyanax mexicanus through Natural Spawning. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Borowsky, R. In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Beale, A., et al. Circadian rhythms in Mexican blind cavefish Astyanax mexicanus in the lab and in the field. Nature Communications. 4, 2769 (2013).
- Sato, Y., Sampaio, E. V., Fenerich-Verani, N., Verani, J. R. Reproductive biology and induced breeding of two Characidae species (Osteichthyes, Characiformes) from the São Francisco River basin, Minas Gerais, Brazil. Revista Brasileira Zoology. 23 (1), 267-273 (2006).
- Yasui, G. S., et al. Improvement of gamete quality and its short-term storage: an approach for biotechnology in laboratory fish. Animal. 9 (3), 464-470 (2015).
- Westerfield, M. The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2000).
- Simon, V., Hyacinthe, C., Retaux, S. Breeding behavior in the blind Mexican cavefish and its river-dwelling conspecific. PLoS One. 14 (2), e0212591 (2019).
- Borowsky, R. Determining the Sex of Adult Astyanax mexicanus. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Ross, L. G., Ross, B. Anaesthetic and Sedative Techniques for Aquatic Animals. , 3rd edn, Wiley-Blackwell. (2008).
- Matthews, J. L., et al. Changes to Extender, Cryoprotective Medium, and In Vitro Fertilization Improve Zebrafish Sperm Cryopreservation. Zebrafish. 15 (3), 279-290 (2018).
- Stahl, B. A., et al. Stable transgenesis in Astyanax mexicanus using the Tol2 transposase system. Developmental Dynamics. , 1-9 (2019).
- Elipot, Y., Legendre, L., Pere, S., Sohm, F., Retaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11, 291-299 (2014).
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genetics. 5 (1), e1000326 (2009).
- Jeffery, W. R. Chapter 8. Evolution and development in the cavefish Astyanax. Current Topics in Developmental Biology. 86, 191-221 (2009).
- Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C., Borowsky, R. Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus. Current Biology. 17 (5), 452-454 (2007).
- Hinaux, H., et al. A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish. Zebrafish. 8, 155-165 (2011).
- Draper, B. W., Moens, C. B. A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiment. (29), (2009).
