Summary
In vitro befruktning er en vanlig brukt teknikk med en rekke modell organismer å opprettholde laboratorie bestander og produsere synkroniserte embryo for nedstrøms applikasjoner. Her presenterer vi en protokoll som implementerer denne teknikken for ulike populasjoner av den meksikanske Tetra fisk, Astyanax mexicanus.
Abstract
Astyanax mexicanus fremstår som en modell organisme for en rekke forskningsfelt i biologisk vitenskap. En del av den nylige suksessen til denne tetramerisk fisken arter er at det besitter interfertile hule og elv-bolig populasjoner. Dette gjør det mulig for genetisk kartlegging av arvelige trekk som ble fikset under tilpasningen til de ulike miljøene av disse bestandene. Mens denne arten kan opprettholdes og oppdrettet i laboratoriet, er det utfordrende å både få embryo på dagtid og skape hybrid embryo mellom stammer. In vitro befruktning (IVF) har blitt brukt med en rekke ulike modell organismer å lykkes og gjentatte ganger avle dyr i laboratoriet. I denne protokollen viser vi hvordan, ved acclimatizing A. mexicanus til ulike lys sykluser kombinert med endringer i vanntemperatur, kan vi skifte avl sykluser til en valgt tid på dagen. Deretter viser vi hvordan vi kan identifisere passende foreldre fisk, samle sunne kjønnscellene fra menn og kvinner, og produsere levedyktige avkom ved hjelp av IVF. Dette gjør at relaterte prosedyrer som injeksjon av genetiske konstruksjoner eller utviklingsmessige analyser oppstår under normal arbeidstid. Videre kan denne teknikken brukes til å lage hybrider mellom hulen og overflate-bolig populasjoner, og dermed muliggjøre studiet av genetisk grunnlag av fenotypiske tilpasninger til ulike miljøer.
Introduction
I de senere årene har Astyanax mexicanus blitt en modell organisme i ulike felt som utviklingsmessige biologi, evolusjonær biologi, atferdsdata biologi, og fysiologi1,2,3,4 . Det unike med dette systemet kommer fra denne arten har flere morphotypes som har tilpasset svært ulike miljøer. Overflaten bolig morphotype bor i elver hvor det er høyt biologisk mangfold og rikelig med mat kilder for fisken. I kontrast, hulen morphotypes av A. mexicanus, cavefish, bor i huler hvor biologisk mangfold, mat kilder og oksygen er drastisk redusert1. Cavefish avvike fra overflaten fisk i en rekke fenotyper som fravær av øyne og pigmentering, insulinresistens, og evnen til å lagre fett2,3,4. Imidlertid, overflate fisken og cavefish fremdeles tilhøre det likt art og er, derfor, interfertile.
For begge morphotypes har et sett med betingelser blitt definert for å muliggjøre rutinemessig vedlikehold og avl under laboratorieforhold på5,6. Men genetiske modifikasjoner, riktig embryonale utviklingsstudier, og etablering av hybrider er fortsatt utfordrende av flere grunner. A. mexicanus primært gyte i natt timer som er upraktisk for etterfølgende eksperimenter på tidlig embryonale stadier som injeksjon av genetiske konstruksjoner eller overvåking av tidlig embryonale utviklingsprosesser. I tillegg er generering av overflate og hule hybrider utfordrende å bruke naturlige gyting, siden hulen morphotypes har en endret døgnrytme7 som til slutt påvirker produksjonen av levedyktige OVA. Vellykket, men invasiv, IVF prosedyrer har blitt beskrevet for andre Astyanax arter, der Kjønnscelle produksjon og gyting atferd ble primet bruke hormonelle injeksjoner8,9. Mindre invasive IVF-prosedyrer (dvs. innhenting av kjønnscellene fra manuelle gyting uten injeksjon av hormonelle preparater) har blitt beskrevet, men betrakter ikke forskjellene i gyting syklusen mellom hule og overflate morphotypes av A. mexicanus 6i den.
Andre fisk modell organismer, slik som sebrafisk, kan lett bli genetisk modifisert og studert på en embryonale nivå fordi hindringene nevnt ovenfor er vellykket løst. Implementering av standardiserte avl teknikker, in vitro befruktning, og sperm kryonisk bevaring har alle skjøvet sebrafisk fremover og befestet modellens bruk i biologisk vitenskap10. Derfor, utvide disse teknikkene til A. mexicanus vil ytterligere styrke det som et modell system.
Her presenterer vi en detaljert protokoll for IVF som vil bidra til å gjøre a. mexicanus mer tilgjengelig. Vi vil presentere en avl oppsett som gjør det mulig skiftende lys-sykluser av fisken fra dagtid til natta slik at levedyktig OVA kan fås i løpet av dagen timer uten injeksjon av hormonelle preparater. Deretter gir vi en detaljert beskrivelse av hvordan du skaffer OVA og milt brukes til IVF. Denne metoden vil muliggjøre produksjon av embryo under normal arbeidstid og gjøre ytterligere nedstrøms søknader mer gjennomførbart sammenlignet med å bruke embryo fra naturlig gyting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her over ha blitt anerkjent av det institusjonell dyr bekymre og bruk komité (IACUC) av Stowers off for legeundersøkelse forskning.
1. lys syklus manipulasjon
- Sett opp fiske tanker i en ugjennomsiktig, helt omsluttet (lys beskyttelse), Flow-through akvakultur system som inneholder flere rader med tanker (figur 1).
Merk: Flow-through-systemet som vist i figur 1 bruker system vann til å skylle avfallet gjennom bak standen pipe av hver tank og renner inn i en sump som munner ut i et sanitæranlegg avløp. I dette eksperimentet, en vann vekslingskurs på en gallon (US) per time gjennom en drypp emitter ble brukt. - Oppretthold temperaturen på hver tank med en uavhengig varmeelement som brukes til å manuelt endre temperaturen under priming prosessen.
- Definer enkeltrader på en måte for å aktivere separate photoperiods i hver av dem. Installer dørene på hver rad som kan lukkes for å hindre at lyset kommer inn i eller rømmer.
Merk: den automatiserte kontrolleren kan muliggjøre manipulering av alle photoperiods med minst mulig forstyrrelse for fisken. - Utstyre stativet med et rødt arbeidslys og blendingsgardiner for tilgang under mørke timer.
2. justere photoperiod og priming fisk for Kjønnscelle samling
- Fjern den ønskede fisken (figur 2a) fra generelle system stativer og plasser i avl stativer for å muliggjøre justering av photoperiod 14 dager før priming.
Merk: Dette gjør at fisken kan akklimatisere seg til et nytt miljø. - Behold fisken ved 22,8 ° c (73 grader) i denne perioden ved hjelp av det installerte vann varmesystemet. Den normale photoperiod er fra 6 am til 8 pm lys og 8 pm til 6 am mørkt. For lys syklus rack, Skift photoperiod til 10 pm til 12 PM lys og 12 pm til 10 PM mørkt ved å justere timeren som driver lyset i stativet.
Merk: menn og kvinner er plassert i samme tank for å tillate naturlig grunning atferd skal skje. Mens gyting kan finne sted i tanken, kan fisken fortsatt brukes til in vitro befruktning siden kjønnscellene er utgitt i trinn11. - Når fisken er akklimatisert, begynner priming dyrene for gyting5 som beskrevet i trinn 2.3.1 til 2.3.5.
Merk: denne prosedyren tar totalt seks dager. Over denne tiden, endre temperaturen til Prime i OVA produksjonen ved hjelp av en installert akvatiske varmesystem. Bruke 50W Aquatic varmere (se tabell over materialer), sette ovnen direkte til temperaturen (skala på ovnen er i Fahrenheit) gitt i protokollen på hvert trinn. Avhengig av størrelsen på tanken og strømnings-through rate av vann, tid for temperatur justering kan variere. I dette eksperimentet ble temperaturen justert ved middagstid og temperatur likevekts tok over de neste 18 h.- På dag 1, heve temperaturen fra 22,8 ° c (73 ° f) til 24,4 ° c (76 grader ° f).
- På dag 2, heve temperaturen fra 24,4 ° c (76 ° f) til 26,1 ° c (79 grader ° f).
- På dag 3 og 4, hold temperaturen ved 26,1 ° c (79 ° f). Fisk vil være klar til å gyte i løpet av dagen og IVF kan utføres.
Merk: avhengig av den enkelte fisken, kan kvinner gyte på dag 3 og/eller dag 4. Vi anbefaler å prøve å få OVA på dag 3 og/eller dag 4 avhengig av suksessen til OVA samlingen. - På dag 5, Senk temperaturen fra 26,1 ° c (79 ° f) til 24,4 ° c (76 grader ° f).
- På dag 6, Senk temperaturen fra 24,4 ° c (76 ° f) til 22,8 ° c (73 grader ° f).
Merk: gi en 7-dagers gap før gjenta denne temperatur syklusen. Det anbefales å fortsette å holde fisken i denne photoperiod siden dette vil redusere den totale tiden som trengs av fisken for å justere til denne forskjøvet lys syklus.
3. kvinnelig Kjønnscelle samling
- Begynn med å sette inn en fuktet vev tørk inn en Petri parabol lokk og lukke parabolen å opprette en fuktet kammer og hindre at OVA tørker ut under innsamlingen prosessen.
- Neste velge en kvinnelig for samling. Gravid fisk med store, utstående abdomens vil sannsynligvis være det beste valget for denne prosedyren (figur 2a).
Merk: for å skille mellom menn og kvinner av voksen A. mexicanus, bomullsdott metoden ble brukt12. - Nakkens en kvinnelig bruker kjølt vann og plassere henne i liggende posisjon i en fuktet svamp dyr holderen. Gjør det ved å plassere fisken i 4 ° c system vann i minst 30 s eller til fisken er immobilisert (dvs. tap av Gill bevegelse, se Ross og Ross13 for detaljer).
Merk: arbeid raskt og prøv å unngå oppvarming fisken før prosedyren er fullført. Dette kan omfatte periodisk dyppe hansker tips av fingrene i kaldt vann eller tilby supplerende anestesi. Andre anestesi metoder (f. eks, MS-22213) kan brukes også. Under IACUC retningslinjer for Stowers Institute for Medical Research, manuell samling av OVA anses som en ikke-invasiv prosedyre, som ikke krever fullstendig anestesi (f. eks, gjennom MS-222). - Når posisjonert, blot den ventrale siden av fisken med en delikat vev tørk som kontakt med vann vil føre til at OVA å aktivere.
- Hold kvinnen mellom tommelen og pekefingeren. Klem forsiktig mot de laterale sidene av coelomic hulrom i retning av urogenitale åpningen mens rullende fingrene litt. Samle uttrykt egg ved hjelp av en gangs slikkepott.
- Overfør disse egg til fuktet Petri parabolen.
Merk: flere klør av egg kan kombineres i samme rett hvis spesifikke foreldre data ikke er nødvendig. OVA kan lagres ved 24 ° c og er best når de brukes til IVF innen 30-60 min etter samling. - Etter innsamling, forsiktig retur fisken å en det å bli frisk tank fylte med system vann.
Merk: Plasser fisken tilbake i mørke kabinett tank for fremtidig OVA samling når det er nødvendig.
4. mannlig Kjønnscelle samling
- Velg en hann for samling.
Merk: det er ingen ytre synlige tegn på mannlig Kjønnscelle kvalitet. Imidlertid, fisken burde komme frisk inne opptreden tidligere bruk i denne fremgangsmåte. For å skille mellom menn og kvinner av voksen A. mexicanus, bomullsdott metoden ble brukt12. - Nakkens en mannlig bruker kjølt vann og plassere ham i liggende posisjon i en fuktet svamp dyr holderen. Nakkens av sted fisken inne 4 ° c system vann for det vil si 30 sekunder eller til fisken er immobilisert (i.e., tap av Gill bevegelse, se Ross og Ross13 for detaljene).
Merk: arbeid raskt og prøv å unngå oppvarming fisken før prosedyren er fullført. Dette kan omfatte periodisk dyppe hansker tips av fingrene i kaldt vann eller tilby supplerende anestesi. Andre anestesi metoder (f. eks, MS-22213) kan brukes her også. Under IACUC retningslinjer for Stowers Institute for Medical Research, manuell samling av sperm er ansett som en ikke-invasiv prosedyre, som ikke krever fullstendig anestesi (f. eks, gjennom MS-222). - Blot den ventrale siden av fisken med en delikat vevs tørke som kontakt med vann vil aktivere milt.
- Plasser enden av en kapillær slange forsiktig ved urogenitale åpningen.
- Utvise milt ved å påføre lett press på sidene av fisken med tommelen og pekefingeren. Start i gjellene, beveg mot urogenitale åpningen.
- Samle milt i enden av et kapillærrør. Skånsom sug kan være nødvendig ved bruk av et aspirator rør. Unngå avføring som kan bli utvist med milt.
- Sett milt inn i et tomt 1,5 mL sentrifugerør og fortynne med dobbelt så mye volum som sperm Extender E400 (se tabell over materialer). Fortsett isen.
Merk: milt fra flere hanner kan samles sammen hvis spesifikke foreldre data ikke er nødvendig. Dette trinnet kan brukes til å forlenge arbeidstiden til milt i flere timer, men det er ikke nødvendig for umiddelbar befruktning. - Etter innsamling, forsiktig retur fisken å en det å bli frisk tank fylte med system vann.
Merk: Plasser fisken tilbake i mørke kabinett tank for fremtidig sperm samling når det er nødvendig.
5. befruktning i vitro
- Ved hjelp av en ny pipette for hver aksje, bland sperm av pipettering og/eller agitating siden av røret før gjødsling som sperm i milt kan bosette seg i E400 løsning over tid.
- Dispensere milt eller forlenget milt løsning i den nylig innsamlede OVA.
- Legg raskt 1 mL system vann til clutchen for å aktivere sperm og egg for befruktning. Unngå å blande eller agitating parabolen innholdet og la 2 min for befruktning forekomme.
Merk: blanding og agitating i stor grad reduserer befruktning priser og bør derfor unngås14. - Legg E2 embryo Media å fylle parabolen 2/3Rd full.
Merk: avhengig av den påfølgende prosedyren, kan embryo enten brukes med en gang (f. eks, for injeksjon av genetiske konstruksjoner som beskrevet før15) eller embryo kan inkubert i E2 embryo Media ved 23 ° c til de når 5 DPF. På dette punktet overføre embryo til de viktigste resirkulering bolig system ved hjelp av system vann.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen som presenteres her er hovedsakelig basert på en tidligere publisert protokoll6. Men siden A. mexicanus gyter i løpet av natten timer, utformet vi en bolig rack for fisk avl som kan endre photoperiod uavhengig av arbeidstid (figur 1). Fisken lyset syklus er forandret innen en fullt ut omsluttet, flyte-igjennom akvakultur system inneholder tre rekker av tank (skikkelsen 1). Hver tank inneholder en uavhengig varmeelement som brukes til å manuelt øke temperaturen under priming prosessen. Individuelle hyller kan settes på separate photoperiods og kan lukkes for å hindre at lyset kommer inn eller rømmer. Alle photoperiods kan manipuleres ved hjelp av en automatisert kontroller plassert på siden av lyset syklus rack. For tilgang under mørke timer, er stativet utstyrt med et rødt arbeidslys og blendingsgardiner. A. mexicanus gyter etter en økning i temperaturen fra 23-26 ° c med en økning på 1,5 ° c per dag16. For å oppnå dette i vår mørke skap, brukte vi nedsenkbare akvarium ovner i hver tank (figur 1).
Den viktigste faktoren for en vellykket IVF prosedyre i a. mexicanus er kvaliteten på den innsamlede OVA. Gravid, kvinnelig fisk med store, utstående abdomens er mest sannsynlig å løslate levedyktig OVA, som vises klart og selv i utseende (figur 2a-d). Legge de innsamlede milt til slike egg resultater i utviklingen av befruktet embryo vanligvis innen 20-30 min (figur 2e). Levedyktig befruktet embryo vil bli litt mer gjennomskinnelig før du går inn i en celle fase av utviklingsmessige syklusen mens ubefruktede OVA vises mer ujevn og ugjennomsiktig (figur 2e). Resulterende embryo holdes i Petri retter i ZIRC E2 embryo Media og inkubert ved 23 ° c i en 14/10 lys/mørk syklus. Embryo blir deretter overført til de viktigste resirkulering bolig system på 5 dager etter befruktning for oppdrett.
For å demonstrere viktigheten av teknikken, viser vi hvordan bestemmelse av fenotype av hybrider for spesifikke egenskaper som øye størrelse og kropp pigmentering kan hjelpe i å tyde deres genetiske basis. Cavefish skiller seg klart fra overflaten fisk i deres øye størrelse og kropp pigmentering. For å forstå det genetiske grunnlaget for disse egenskapene, krysset vi overflaten og cavefish (F0) og genererte hybrid F1 og F2 populasjoner ved hjelp av IVF for å observere fenotypiske variasjonen oppnådd (Figur 3). Størrelsen på øynene er mindre i F1-generasjonen som indikerer at tilstedeværelsen av øynene er en delvis dominerende egenskap (Figur 3). I overflate-hulen F2 hybrider, får vi et bredt spekter av øye størrelser, noe som indikerer at det er flere Loci som kontrollerer øye størrelse i a. mexicanus, noe som gjør det til en kvantitativ egenskap (Figur 3). Et annet eksempel er pigmentering. Observere F1 hybrid av overflate og cavefish, kan det bli konkludert med at kroppen pigmentering er en dominerende egenskap som fisken er fullt pigmentert (Figur 3). I F2-generasjonen peker variasjonen i kropps pigmentering igjen mot en kvantitativ egenskap. Kombinasjonen av denne fenotypiske data med sekvensering data kan avdekke underliggende genetiske Loci ansvarlig for disse fenotyper. Disse F2 populasjoner er en god ressurs for å forstå genetisk grunnlag av ulike trekk og slike populasjoner har blitt brukt tidligere for å studere disse trekkene17,18,19. En standardisert IVF teknikk kan i stor grad effektivisere generering av hybrider, slik at genetisk kartlegging av Loci kontrollere slike egenskaper og hjelpe oss å forstå hvordan visse fenotyper er ugunstig i enkelte habitater og adaptive i andre.
Figur 1 : Design av stativer for å skifte dag/natt sykluser av A. mexicanus. (a) det generelle oppsettet av dette rack systemet tillater photoperiod manipulasjon, noe som gir en simulering av natten i løpet av dagen timer når dørene er lukket, og sokkelen lysene er slått av. (b) priming fisken for å stimulere egg modning oppnås ved hjelp av nedsenkbare varmeovner (se tabell over materialer) installert i individuelle tanker som kan justeres separat (røde piler). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Eksempler på egnede kvinner for OVA samling og representative illustrasjon av levedyktig og unviable OVA. (a) gravid, kvinnelig fisk med store, utstikkende abdomens er mer egnet for manuell egg samling enn (b) kvinner med en strømlinjeformet formet mage. (c) levedyktig OVA (dvs. OVA produsere levedyktig embryo når befruktet) kan identifiseres ved deres klare, selv utseende, mens unviable OVA (dvs. OVA ikke produsere levedyktig embryo når befruktet), som vist i (d), har en skyet, ujevn Utseende. (e) etter vellykket befruktning, levedyktig embryo blitt mer gjennomskinnelig og angi en celle scenen mens ubefruktede OVA (røde piler) vil langsomt forfall. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Genetisk analyse av øye størrelse og kropp pigmentering trekk. Stamtavle viser bilder av foreldrenes (F0) overflate fisk (øverst til venstre) og cavefish (øverst til høyre), F1 hybrider (andre rad) og F2 hybrider. F1 fisken har middels øye størrelse og er fullt pigmentert mens F2 fisk viser en bred variasjon i de to morfologiske trekk: øye størrelse og pigmentering. Alle opprinnelige data underliggende dette tallet kan nås fra Stowers opprinnelige data repository på http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1365. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens IVF er en standardisert metode for mange forskjellige modeller organismer som sebrafisk, eksisterende protokoller for a. mexicanus ikke ta hensyn til at denne arten naturlig gyter i løpet av natten timer6. Gitt at cavefish og overflate fisken avviker ganske drastisk i deres døgnrytme, er modnings syklus av egg også forskjellig mellom hule og overflate morphotypes. Mens staging temperaturer og tider for overflate A. mexicanus er godt studert12, cavefish kan variere i deres gyting atferd og modnings syklus. Konvensjonelle metoder for hybrid produksjon er derfor svært utfordrende og usikre på grunn av tap av døgnrytme i hule morphotype til A. mexicanus7, noe som resulterer i endrede gyte tider av disse fiskene. Ved å flytte photoperiod, kan vi gi tid bestemt hybrid embryo uten å måtte stole på sjeldne naturlig gyting hendelser mellom de to morphotypes. Holder hulen og overflate fisken separat likeledes forhindrer aggressiv overflate morphs fra har en ugunstig bevirke opp på formering.
Noen begrensninger finnes med denne metoden, for eksempel variasjoner i OVA kvalitet. Identifisering av en kvinnelig (overflate eller cavefish) med modne OVA er ikke trivielt og krever grundige observasjoner av fisken atferd. Vanligvis gravid kvinner klar for gyting har større abdomens og vil gjentatte ganger pensel mot bunnen tank overflaten eller embryo samling felle20.
Vi observerte at kvaliteten på sperm er konsistent gjennom hele dagen/natt syklus. Det kritiske trinnet for vellykket IVF (vellykket i form av å generere befruktet embryo) er å skaffe god kvalitet, levedyktig OVA. Derfor er det svært viktig å samle egg fra fisk som er i ferd med å gyte naturlig (figur 2a). Når OVA er samlet, kan de observeres under en disseksjon mikroskop for å undersøke kvaliteten. Samlingen av levedyktige OVA i løpet av natten, derimot, er upraktisk og utfordrende for forskeren. Oppsettet som vi presenterer her gir mulighet for skiftende av modnings syklusen av OVA, slik at IVF kan brukes til å generere synkroniserte embryo for nedstrøms søknad under normal arbeidstid.
Med fremme av kryonisk bevaring av milt (f. eks, som det er beskrevet i sebrafisk21), vil IVF bli et kraftig verktøy mot etablering og vedlikehold av genetiske linjer for den nye modellen systemet a. mexicanus. I kombinasjon med metoder for genetisk modifisering15 og morpholino-baserte knockdown17, vil disse prosedyrene gi metodisk plattform for å studere den genetiske og utviklingsmessige grunnlaget av tilpasninger til ulike habitater i A. mexicanus.
Oppsummert protokollen som presenteres her vil muliggjøre produksjon av synkroniserte embryo av A. mexicanus for andre nedstrøms anvendelser, slik som injeksjon av genetiske konstruksjoner eller studere tidlig embryological fenotyper. Den store styrken av protokollen er at det gir mulighet for effektiv produksjon av overflate-hule hybrider som kan brukes til genetisk kart fenotypiske forskjeller mellom overflaten fisk og cavefish gjennom QTL (kvantitativ egenskap Loci) analyse. Til sammen, få levedyktig OVA på dagtid for IVF er en kraftig teknikk som vil være gunstig for en rekke fremtidige studier på ulike felt av biologiske vitenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Philippe Noguera og Kimberly bland for deres støtte på video produksjon. Forfatterne ønsker også å anerkjenne hele akvatisk team av Stowers Institutt for husdyrhold. Dette arbeidet ble støttet av institusjonelle midler til DPB og NR. NR ble støttet av Edward Mallinckrodt Foundation og JDRF. RP ble støttet av et stipend fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (PE 2807/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Centrifuge Tube | Eppendorf | #22364111 | |
| 100 mm Petri Dishes | VWR International | #25384-302 | |
| Aspirator Tube | Drummond | #2-000-000 | |
| Calibrated 1-5 µL Capillary Tubes | Drummond | #2-000-001 | |
| Dispolable Spatulas | VWR International | #80081-188 | |
| HMA-50S 50W Aquatic Heaters | Finnex | HMA-50S | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | #3123000063 | |
| P1000 Pipette Tips | Thermo Scientific | #2079E | |
| Sanyo MIR-554 incubator | Panasonic Health Care | MIR-554-PA | |
| Sperm Extender E400 | 130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glucose, 30 mM HEPES Adjust to pH 7.9 with 5M KOH and filter sterilize. Solution can be stored at 4 ?C for up to 6 months. |
||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| System Water | Deionized water supplemented with Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] to reach a specific conductance of 800 µS/cm. Water quality parameters are maintained within safe limits (Upper limit of total ammonia nitrogen range, 1 mg/L; upper limit of nitrite range, 0.5 mg/L; upper limit of nitrate range, 60 mg/L; temperature, 22 °C; pH, 7.65; dissolved oxygen 100 %) | ||
| Tissue Wipes | Kimberly-Clark Professional | #21905-026 | |
| ZIRC E2 Embryo Media | 15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 µM KH2PO4, 50 µM Na2HPO4, 1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. Adjust pH to 7.2 to 7.4 using 2 N hydrochloric acid. Filter sterilize. Stored at room temperature for a maximum of two weeks. |
References
- Jeffery, W. R.
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genetics. 5, e1000326 (2009).
- Riddle, M. R., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555, 647-651 (2018).
- Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441 (2), 297-304 (2018).
- Borowsky, R. Breeding Astyanax mexicanus through Natural Spawning. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Borowsky, R. In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Beale, A., et al. Circadian rhythms in Mexican blind cavefish Astyanax mexicanus in the lab and in the field. Nature Communications. 4, 2769 (2013).
- Sato, Y., Sampaio, E. V., Fenerich-Verani, N., Verani, J. R. Reproductive biology and induced breeding of two Characidae species (Osteichthyes, Characiformes) from the São Francisco River basin, Minas Gerais, Brazil. Revista Brasileira Zoology. 23 (1), 267-273 (2006).
- Yasui, G. S., et al. Improvement of gamete quality and its short-term storage: an approach for biotechnology in laboratory fish. Animal. 9 (3), 464-470 (2015).
- Westerfield, M. The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2000).
- Simon, V., Hyacinthe, C., Retaux, S. Breeding behavior in the blind Mexican cavefish and its river-dwelling conspecific. PLoS One. 14 (2), e0212591 (2019).
- Borowsky, R. Determining the Sex of Adult Astyanax mexicanus. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Ross, L. G., Ross, B. Anaesthetic and Sedative Techniques for Aquatic Animals. , 3rd edn, Wiley-Blackwell. (2008).
- Matthews, J. L., et al. Changes to Extender, Cryoprotective Medium, and In Vitro Fertilization Improve Zebrafish Sperm Cryopreservation. Zebrafish. 15 (3), 279-290 (2018).
- Stahl, B. A., et al. Stable transgenesis in Astyanax mexicanus using the Tol2 transposase system. Developmental Dynamics. , 1-9 (2019).
- Elipot, Y., Legendre, L., Pere, S., Sohm, F., Retaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11, 291-299 (2014).
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genetics. 5 (1), e1000326 (2009).
- Jeffery, W. R. Chapter 8. Evolution and development in the cavefish Astyanax. Current Topics in Developmental Biology. 86, 191-221 (2009).
- Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C., Borowsky, R. Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus. Current Biology. 17 (5), 452-454 (2007).
- Hinaux, H., et al. A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish. Zebrafish. 8, 155-165 (2011).
- Draper, B. W., Moens, C. B. A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiment. (29), (2009).
